Name: 세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 Clostridium difficile 포자 발아 동안 코어 텍스 조각과 환원당을 정량화하는 색소법을. 이 방법은 대부분의 실험실에서 표준 시약과 장비로 수행할 수 있어 세균 포자 생물학 연구에 유용합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

설명이 프로젝트는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 보너스 번호 5R01AI116895에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알레르기 및 전염병 국립 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. 생성 샘플 <ol><li> 열 C를 활성화 디피는 얼음에 30 분 및 저장을 위해 65 ° C에서 포자. 참고 : C를 앞서 설명한 바와 같이 7,9,10 디피 포자를 제조 및 정제 할 수있다. </li><li> X는 샘플의 수는 분석 중에 촬영하는 X + 1 용액에서 발아 용액을 제조 하였다. 참고 : 박테리아의 종류가 연구되고 포자에 발아 솔루션은 고유의 것입니다. C.을 분석하십시오 디피 포자 발아, 우리는 10 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 NaCl을 탈 이온수 100 mM의 글리신 및 10 mM의 타우로 콜린 산의 용액을 사용 하였다. </li><li> 분석을 시작하기 전에, 피질 조각 검출을위한 빈 역할을하는 포자없이 발아 솔루션의 1.0 ml의 샘플을 그립니다. </li><li> OD 빨리 발아 솔루션 및 소용돌이에 ~ 3.0 (600)에 포자를 추가합니다. 참고 : B. 우리의 발아 연구 내용 서브 틸리 스, 우리는 같은 OD를 사용 (6)C. 용으로 00 포자 디피. 참고 : 포자의이 금액은 C. 동안 모니터링 피질 조각 방출을 위해 잘 작동 남과 어울리지 않는 포자 발아. 이 분석에 사용 된 포자의 크기는 각각의 박테리아 균주 또는 실험적으로 결정되어야한다. </li><li> 즉시 14,000 × g에서 1 분 동안 실온에서 원심 분리 포자를 첨가 한 후 1.2 ml의 샘플을 제거한다. 이것은 제로 시점이다. </li><li> 후속 피질 단편 분석을위한 신선한 튜브 원심 분리 된 샘플로부터 상등액 1.0 ㎖에 옮긴다. 주 : 테르븀 형광 9,18,19에 기초한 분석을 이용하여 상기 용액에서 DPA의 검출을위한 별도의 100 μL 샘플을 제거 DPA가 모니터링해야해야한다. </li><li> -80 ° C에서 수집 된 샘플을 고정. </li><li> 모든 시점이 완료 될 때까지 반복하여 일정한 간격으로 1.4 및 1.5 단계를 반복합니다. 참고 : 시간의 원심 분리 및 샘플링 시점 적은 일에 필요하기 때문에2 분 떨어져 우리의 절차를 수행하는 동안 불가능했던, 그래서 우리의 샘플링 간격은 한 번에 14 분 동안 매 2 분이었다. </li><li> 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, 5000 : 설탕 검출 및 정량화를 감소시키기위한 포지티브 대조군으로서, N의 -acetylglucosamine (nmol의) 다음의 양을 포함한다. 껍질 샘플과 동시에 이들 샘플을 준비하고, 표준 곡선이 포자를 발아에 의해 생성 된 데이터와 관련되도록 껍질 샘플과 함께 실행. </li><li> 모든 시점의 샘플을 수집 한 후, 샘플을 동결 건조. 참고 : 우리는 2 ml의 스크류 캡 튜브에 우리의 샘플을 동결 건조. </li></ol> 2. 코어 텍스 조각을 측정 <ol><li> 1 %의 페놀 및 0.5 % β 메르 캅토 에탄올이 보충 된 3 N HCl을 120 μL에 재현 탁하여 동결 건조 샘플. </li><li> 2 ml의 스크류 캡 튜브에 재현 탁 샘플을 전송합니다. 참고 : 재현성를 들어, 모든 동결 건조 된 시료를 재현 탁하고 전송되어 있는지 확인합니다. </li> &lt;리&gt; 4 시간 동안 95 ° C에서 재순환 수조에서 샘플을 품어. </li><li> 그들은 멋진 때까지 배양 한 후, 얼음에 샘플을 배치합니다. </li><li> 3 M NaOH를 120 μL로 샘플을 중화. </li><li> 포화 중탄산 나트륨 용액 80 ㎕를 각 샘플 및 와류에 5 % 아세트산 무수물 용액 80 μL를 추가한다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 정확히 3 분 동안 다시 95 ° C의 물을 욕조에 샘플을 전송합니다. 참고 :이 단계는 민감하고 긴 시간이 하향 신호의 개발에 영향을 미칠 수있는 시간입니다. </li><li> 수조에서 샘플을 제거하고 얼음에 냉각. </li><li> 각 튜브와 소용돌이에 6.54 % K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 정확히 7 분 동안 95 ℃에서 재순환 수욕 샘플을 인큐베이션. 참고 :이 단계는 민감하고 긴 시간이 하향 신호의 개발에 영향을 미칠 수있는 시간입니다. </li><li> 없애다5 분 동안 얼음에 샘플 및 장소. </li></ol> 3. 색상 시약 <ol><li> 샘플을 얼음 (단계 2.12)에 있지만, 컬러 시약을 준비한다. (; 에를리히 시약 DMAB) 빙초산의 1.9 ml의에서 P는 -dimethylaminobenzaldehyde의 0.320 g을 녹여. 참고 : 시약 시간, 온도, 빛에 민감하고 사전에 할 수 없습니다. </li><li> DMAB가 완전히 용해 후 10 N 염산과 소용돌이의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 빙초산과 소용돌이의 5 ML을 추가합니다. </li></ol> 4. 비색 반응 <ol><li> 전송 각 100 ㎕ 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 피질 샘플을 냉각시켰다. </li><li> 각 샘플에 갓 준비 색 용액 700 μl를 추가합니다. </li><li> 즉시 37 ° C의 물을 욕조에 샘플을 전송하고 정확히 20 분 동안 품어. </li><li> 무려 96 웰 플레이트에 각 시료 200 μl를 전송합니다. </li><li> 접시에 585 nm에서 샘플을 정량화리더. 샘플은 노란색에서 시작해야하며, 긍정적 인 반응이 보라색으로 이동합니다. 더 피질에 존재하는, 깊은 보라색 색상입니다. </li></ol>

<ol><li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+sporulation+programs%3A+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li>
<li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li>
<li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li>
<li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li>
<li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+spore+biology%3A+sporulation%2C+germination%2C+and+spore+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor%2C+CspC%2C+is+important+for+establishing+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).</li>
<li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li>
<li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li>
<li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submicrodetermination+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li>
<li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials%3A+its+application+to+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li>
<li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipicolinic+acid+%28DPA%29+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li>
<li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li>
<li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li>
<li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li>
<li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li>
<li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li>
<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

자극 후, 발아 과정을 거치고 포자 고분자 합성에 대한 필요없이 저항 특성을 잃는다. 포자 발아가 트리거되면 포자 코어는 물이 교환 DPA를 발표한다. 인해 휴면 포자의 높은 DPA 콘텐츠 포자 코어는 팽창이 장벽으로, 아마도 작용하여 팽윤 코어 방지 강렬한 삼투압 및 전문 펩티, 피질 중이다. 상기 방법은 보라색의 색조에 변화 측정으로 환원당의 존재를 검출하기 에를리히 시약 (황색 용액)을 사용한다. 피질 가수 분해 중에 NAG NAM 및 당류가 해방된다 (가수 분해 효소의 정도에 따라, 당은 이당류 또는 다당류로 해방 될 수있다). 염산 (2.1 단계)에 의해 글리코 시드 결합의 가수 분해는 무료로 감소 끝 7 단당류를 생성합니다. neutraliz 후수산화 나트륨 동량 (250 단계)와 산을 보내고, 상기 NAG 주변 알콜 및 NAM 단당류를 아세트산 무수물로 아 실화된다 (13) (260 단...

내생 포자는 대사 세균이 불리한 환경에서 지속 할 수 있도록 박테리아의 휴면 형태이다. 많은 포자 - 형성 박테리아 포자 형성 영양 결핍에 의해 유도되지만,이 공정은 산소 또는 다른 스트레스 1 pH를 노출의 변화에 의해 제어 될 수있다. 이들 대사 휴면 포자 형태 동안 박테리아는 UV 방사선, 탈수, 고온 및이 냉동 레지스트. 포자 형성 과정에 대한 지식의 대부분 모델에서 생체 연구 고초균에서 온다. 포자 형성 과정은 DNA 복제 및 축 3,4- 필라멘트의 형성으로 시작된다. 비대칭 격막은이 불평등 크기의 구획에 셀을 분할한다. 더 큰 구획은, 머더 셀은 더 작은 구획은 forespore을 삼키기. 머더 셀과 도만을 방출 포자 결국 lyses 머더 세포 성숙의 유전자 발현을 조정 forespore 두주변 환경 1에 t 포자. 포자 구조 및 조성은 다양한 세균 종에 걸쳐 보존되어있다. 포자 코어는 식물 세포보다 낮은 수분 함량을 갖고 dipicolinic 산 (DPA) -1,2- 풍부하다. 포자 형성하는 동안, DPA 물 교환 포자 코어로 펌핑된다. 코어 주변 대부분의 포자 형성 균에, 발아 (germinants)을 자극하는 작은 분자를 인식하는 수용체 2 위치, 내부 포자 막이다. 단 포자의 내막 밖에있는 세포벽의 펩티도 글리 칸 층이다. 특수한 펩티 층 (피질) 세포벽 펩티을 둘러싸고 [N 아세틸 글루코사민 (NAG)와 N-acetylmuramic 산 (NAM)이 교대] 세포벽 펩티 같은 많은 구성 요소로 구성된다. 그러나, 피질의 NAM 잔기의 약 50 %가 무람-δ 락탐 5,6- 변환되었습니다 </s&gt;입니다. 포자 발아 동안이 무람-δ 락탐 잔기 따라서 피질 아니라 칸막이 벽 (발아 마칠 공정)을 저하 할 수 포자 피질 용균 효소 (SCLEs)에 의해 인식된다. 피질 주변은 외부 막과 코트 단백질이 여러 층이다. 발아 과정을 제어하는​​ 포자 형성 세균 매우 중요하다. 싹 트는 수용체는 해당 germinants 2와 상호 작용할 때 발아가 시작됩니다. 많은 포자 - 형성 박테리아에서 이러한 germinants 2 이의 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 이온 또는 이들의 조합이다. C. 디피 포자 발아 특정 담즙산 [예를 들어, 타우로 콜린 산 (TA)] 및 아미노산 (예컨대, 글리신) 7-10의 조합에 의해 개시된다. C. 사이의 차이가 있지만 디피 발아 경로와에서 공부 경로 다른 포자 형성같은 B와 박테리아, 서브 틸리 모든 공통 식물 세포는 포자 발아 2,8 성장할 수 있도록 포자 외피 저하하는 절대 조건이다. 또는 SLEC (B. 서브 틸리에서 발견) (많은 클로스 트리 디아에서 발견) 코어 텍스 저하는 SCLEs CwlJ / SleB에 의해 달성 될 수있다. 피질 가수 분해 세포벽 및 포자의 제한을 감소시킨다. 이는 전체 코어 수분 보충, 세포 대사 (2)에 필요한 단백질의 대부분을 재 활성화에 필요한 단계 수 있습니다. 포자가 발아 할 때 위상이 어두운 상태로 공정 상 밝은 상태로부터 휴면 포자 변화는 600에서 광학 밀도 (OD)의 변화에​​ 의해 측정 할 수있다 나노 11. 이전의 보고서는 OD의 변화의 대부분은 포자 12 DPA의 출시로 인해 있음을 시사한다. 우리의 최근의 연구 동안, 우리는 C.의 타이밍을 비교하고자 남과 어울리지 않는 포자 발아 및 모니터링되는DPA와 피질 조각 9 릴리스. 그들은 포자를 발아가 발표되기 시작으로이 연구는 피질 조각의 방출을 모니터링하는 것이 중요했다. 여기에서 사용되는 비색 분석이 환원 말단에 당류를 검출하는 방법에 기초 하였다 Ghuysen 외. (13)을 개발 하였다. 다른 사람이 환원당 (14)의 검출을위한 프로토콜을 설명했습니다 또는 이러한 프로토콜 15을 수정 한 때문에이 주제에 대한 문헌은 혼란 스러울 수 있습니다. 여기서, C. 발아에서 해방 환원당의 비색 검출 상세히에게 단계별 방법 우리 남과 어울리지 않는 포자. 이 연구는 C.를 사용하지만 남과 어울리지 않는 포자는 다른 포자 형성 균의 포자의 발아 중에 방출 된 환원당이 프로토콜 9,16,17 검출 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml 스크류 캡 튜브</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &#956; l 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956; ll 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸-D-글루코사민</td><td>시그마</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>염산 - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 무수물</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>사붕산칼륨 사수화물</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(디메틸아미노)벤즈알데히드</td><td>시그마</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>포화 페놀</td><td>피셔</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>알드리치</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>가열, 순환 수조</td><td>VWR 과학</td><td>모델 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 웰 투명 조직 배양 플레이트</td></tr><tr><td>배양 튜브</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>와류 기계</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile)와 다른 클로스트리디아(Clostridia)의 내생포자 발아 과정은 포자 형성 박테리아인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 점점 더 다른 것으로 밝혀지고 있습니다. 발아는 작은 분자 발아물질에 의해 유발되며 고분자 합성이 필요하지 않게 발생합니다. 바실러스(Bacillus)와 클로스트리디움(Clostridium) 종의 포자 발아 메커니즘 사이에는 차이가 있지만, 일반적인 요구 사항은 포자 코어가 팽창하고 재수화될 수 있도록 하는 펩티도글리칸과 같은 피질의 가수분해입니다. 재수화 후에는 신진대사가 시작될 수 있으며 이는 결국 식물 세포의 성장으로 이어집니다. 포자 발아 중 가수분해된 피질 단편의 검출은 어려울 수 있으며 앞서 설명한 분석에 대한 수정은 혼란스럽거나 재현하기 어려울 수 있습니다. 따라서 이 분석을 사용한 최근 보고서를 기반으로 박테리아 포자 발아 중 피질 조각의 비색 감지를 위한 단계별 프로토콜을 자세히 설명합니다.

표 1 NAG 표준을 사용하여 통상적 인 결과를 나타낸다. 데이터는 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. 표 2는 100 mM의 글리신 및 10mM의 TA (발아 촉진 조건) 또는 100 mM의 글리신 만 (비 발아 조건)으로 보충 발아 버퍼에서 발아 시험에서 전형적인 결과를 나타낸다. TA, C.가없는 디피 포자가 발아하지 않고, 용액의 피질 단편의 존재 하에서 거의 변화가있다. 그러나 두 TA 글리신, C.의 존재 남과 어울리지 않는 포자는 발아 및 솔루션에 피질 조각을 놓습니다. 이는 반응 샘플의 시간 경과에 OD 585의 상승이 관찰된다. 이 분석 중에 발표 피질 조각 (nmol의)의 총 금액은 (1B)도 유사한 표준 곡선을 사용하여 계산 하였다. 이 분석에서, 피질의 대부분은 가수 분해 (또는 해제) 15분...

여기에서는 박테리아 포자 발아 중 환원당의 존재를 감지하기 위한 비색 분석법을 설명합니다.

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

이 단계별 프로토콜의 전반적인 목표는 박테리아 포자 발아 과정 중 피질 조각이나 환원당의 양을 정량화하는 것입니다. 본 방법에서는 포자 발아 중 피질 조각 또는 환원당의 존재를 검출하는 데 필요한 단계들을 상세히 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 대부분의 실험실에서 프로토콜을 성공적으로 수행하는 데 필요한 시약과 장비를 이미 갖추고 있다는 점입니다.Clostridium difficile 포자가 들어 있는 튜브를 가열 블록에 넣고 65 °C에서 30분 동안 배양하여 이 절차를 시작합니다. 배양 후 튜브를 얼음에 둡니다. 발아 용액은 연구 대상이 되는 박테리아 포자의 종에 따라 달라집니다.C.difficile 포자 발아를 분석하기 위해, 탈이온수에 10 millimolar Tris(pH 7.5), 150 millimolar 염화나트륨, 100 millimolar glycine 및 10 millimolar taurocholic acid를 포함한 용액을 사용합니다. 샘플당 1 milliliter의 발아 용액과 추가로 1 milliliter를 더 준비합니다. 분석을 시작하기 전, 발아 용액 1 milliliter를 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 따로 보관합니다.이는 피질 파편 검출을 위한 공시료(blank)로 사용됩니다. 다음으로, 발아 용액에 OD600이 약 3.0이 되도록 포자를 첨가하고 짧게 볼텍싱합니다. 이 정도 양의 포자는 C.difficile 포자 발아 동안 피질 파편의 방출을 조절하는 데 적합합니다.포자를 첨가한 직후, 1.2 mL 샘플을 새로운 마이크로원심분리관에 취해 원심분리기에 넣습니다. 그 다음 상온에서 14,000 ×g로 1분 동안 원심분리합니다. 이 시점이 0시간 시점입니다. 원심분리가 끝나면 상청액 1 mL를 새로운 2 mL 스크류 캡 튜브로 옮기고 -80 °C에서 냉동 보관합니다.각 시간대별로 시료가 수집될 때까지 일정 간격으로 분주, 원심분리 및 냉동 과정을 반복합니다. 원심분리와 샘플링에 소요되는 시간이 필요하므로, 이 절차에서는 2분 미만의 시간대는 설정할 수 없으며, 따라서 이 시료들은 14분 동안 2분마다 한 번씩 채취합니다. 피질 시료를 준비하는 동안 dipicolinic acid를 모니터링해야 하는 경우, 100 µL의 시료를 별도로 분리하여 얼음 위의 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.또한 다음과 같은 양의 N-acetylglucosamine을 포함하는 표준 곡선 생성용 샘플을 준비하십시오: 발아 용액 내 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 및 5,000 nanomoles. 각 시점별로 샘플 수집이 완료되면, 냉동고에서 샘플을 꺼내어 공시료 및 표준 곡선 샘플과 함께 동결 건조하십시오.그 후 모든 시료를 사용 시까지 -80 °C에 보관하십시오. 분석 당일에 대조군 및 표준 곡선 시료를 포함하여 동결 건조된 시료를 페놀과 beta-mercaptoethanol이 포함된 120 µL의 염산에 재현탁하십시오. 다음으로, 재현탁된 모든 시료를 새로운 2 mL 스크류 캡 튜브로 옮기십시오.그 후 95 °C의 순환식 항온수조에서 4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플이 식을 때까지 얼음에 둡니다. 그런 다음 중화를 위해 3 M 수산화나트륨 120 µL를 첨가합니다.다음으로, 각 시료에 포화 중탄산나트륨 용액 80 µL와 5% 무수초산 용액 80 µL를 첨가하고 볼텍싱합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 시료를 배양합니다. 배양 후, 시료를 다시 95 °C 항온수조에 넣고 정확히 3분 동안 유지합니다.이 단계는 시간에 민감하며, 시간이 길어질수록 이후의 신호 발생에 영향을 줄 수 있다는 점에 유의하십시오. 샘플을 항온수조에서 꺼내어 얼음 위에서 냉각합니다. 각 튜브에 6.54% potassium tetraborate tetrahydrate 400 µL를 넣고 볼텍스합니다.샘플을 95 °C의 재순환 수조에서 정확히 7분 동안 배양합니다. 이 단계 또한 시간에 민감하므로 주의하십시오. 샘플을 꺼내어 5분 동안 얼음 위에 둡니다.시료를 얼음 위에 두는 동안 발색 시약을 준비합니다. 0.320g의 DMAB를 1.9mL의 빙초산에 녹입니다. 이 시약은 시간, 온도 및 빛에 민감하므로 미리 만들어 두어서는 안 된다는 점에 유의하십시오.DMAB이 완전히 용해되면, 10 N 염산을 100 µL 첨가하고 시료를 볼텍싱합니다. 그런 다음 빙초산 5 mL를 첨가하고 다시 볼텍싱합니다. 비색 반응을 위해, 냉각된 각 피질 또는 대조군 시료 100 µL를 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.갓 조제한 발색 용액 700 µL를 각 시료에 첨가합니다. 시료를 즉시 37 °C 항온 수조로 옮겨 정확히 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 시료 200 µL를 투명한 96-well 플레이트로 옮깁니다.샘플은 처음에 노란색을 띠어야 하며, 피질의 존재를 나타내는 환원당이 있을 경우 보라색으로 변합니다. 여기서는 많은 샘플이 육안으로 보이는 보라색을 나타내지 않습니다. 하지만 250, 500, 5,000 nanomole 샘플은 음성 대조군인 0 nanomole과 시각적으로 다르게 보입니다.플레이트 리더를 사용하여 585 nm에서의 흡광도를 측정합니다. 585 nm의 OD로 측정했을 때, 표준 시료에서 생성된 신호가 선형 회귀에 가장 잘 부합합니다. 이 표는 N-acetylglucosamine 표준물을 사용한 일반적인 결과물을 보여줍니다.이 데이터는 여기에 표시된 표준 곡선을 생성하는 데 사용되었습니다. 발아 촉진 조건 하에 100 millimolar glycine과 10 millimolar taurocholic acid가 첨가된 발아 버퍼를 사용하여 발아 분석을 수행하였습니다. 비발아 조건에서는 100 millimolar glycine만을 사용하였습니다.타우로콜산(taurocholic acid)이 없으면 C.Difficile 포자는 발아하지 않으며, 용액 내 피질 파편(cortex fragments)의 존재 여부에도 거의 변화가 없습니다. 그러나 타우로콜산과 글리신(glycine)이 모두 존재하면, C.difficile 포자가 발아하여 용액 속으로 피질 파편을 방출합니다. 이는 반응시킨 시료의 OD585 값이 시간이 경과함에 따라 증가하는 것으로 측정됩니다.본 분석 과정에서 방출된 피질 조각의 양은 표준 곡선을 사용하여 계산되었습니다. 이 분석에서 볼 수 있듯이, 대부분의 피질은 발아제 노출 후 15분 이내에 가수분해되거나 방출되었습니다. 이는 대부분의 포자가 이 시간 범위 내에서 발아했음을 시사합니다.이 영상을 시청한 후에는 세균 포자 발아 과정 중 발아 용액 내의 피질 조각 또는 환원당을 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 분석이 정확하게 진행될 수 있도록 반응 시간을 세심하게 주의 깊게 살피는 것이 중요합니다.

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Francis, MB, et al. 박테리아 포자 발아 중 피질 조각 검출. J. Vis. 경험. (2016).이 비디오는 시간 경과에 따른 환원당의 방출을 측정하여 박테리아 포자 발아 중 피질 분해를 감지하는 비색 방법을 보여줍니다. N-아세틸글루코사민 표준물질과 시점 샘플을 사용하여 이 분석은 보라색 발색 반응을 통해 당 농도를 정량화하여 피질 가수분해 정도를 나타냅니다.

박테리아 포자 발아 중 피질 분해의 비색 검출

출처: Wen, J., Pasman, et. al., Bacillus subtilis 포자의 제르미노솜 및 내막 시각화. J. Vis. Exp. (2019년)이 비디오는 박테리아 포자 내에서 발아 단백질의 조직을 밝히는 3차원 형광 이미지를 획득하기 위해 구조화된 조명 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다.

박테리아 포자 내막의 발아 단백질 시각화

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

복잡한 미생물 군집에서 박테리아 내생포자를 선별하는 방법이 개발되어 이 박테리아 그룹에 대한 맞춤형 배양 또는 분자 연구를 수행할 수 있습니다.

식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리

이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

여기 우리는 초보자에 대 한 프로토콜 Streptomyces약리학 중요 한 세균 속에 대 한 형질을 시작 하는 연구원을 제시.

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.

Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

이 프로토콜은 유세포 분석 및 카운팅 비드를 사용하여 에티듐 브로마이드로 표지된 박테리아 포자를 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 또한 온전한 포자의 표면에서 단백질의 공유 결합을 분석하는 데 효율적입니다.

Bacillus subtilis 포자 계수 및 유세포 분석의 표지 분석 개선

배우세요 Clostridium difficile 포자 발아 동안 코어 텍스 조각과 환원당을 정량화하는 색소법을. 이 방법은 대부분의 실험실에서 표준 시약과 장비로 수행할 수 있어 세균 포자 생물학 연구에 유용합니다.

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

더 많은 동영상 탐색