Name: 의식 쥐에 주입 및 무선 막전위의 기록 및 Visual 사건 관련 전위 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 무선 텔레메트리 프로브 수술 이식을 통해 의식 상태의 쥐에서 망막 및 시각 피질의 전기생리학적 신호를 동시에 기록하는 방법. 이 기법은 마취 없이 신경 행동을 연구하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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JC는 이 원고를 집필하는 데 재정적 지원을 해준 멜버른 대학교의 데이비드 헤이 추모 기금(David Hay Memorial Fund)에 감사의 뜻을 전합니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 ARC Linkage 보조금 100200129(BVB, AJV, CTON)에서 제공했습니다.

윤리 문 : 동물 실험은 과학적 목적을위한 동물의 관리 및 사용 (2013)의 호주 코드에 따라 실시 하였다. 동물 윤리 승인은 동물 윤리위원회, 멜버른 대학에서 얻었다. 재료는 본 명세서 만 아니라 의학적 또는 수 의학적 용도를위한 실험실 실험이다. 1. 준비 전극 주 : 세 채널 송신기가 동시에 수행 될 2 ERG 1 VEP 기록 가능 외과 이식에 사용된다. 활성 비활성 및 3 개의 전극을 눈에 부착하기 위해 주입 전에 링 형상으로 사전 식 될 필요가있다. 비활성 전극 전체 색깔 덮개로 덮여있는 동안 식별 목적을 위해, 제조 업체, 절반 흰색에 반 색깔의 플라스틱 덮개를 활성 전극을 동봉했다. 접지 전극 (투명 플라스틱 외피) 변경되지 않고 남아있다. 모든 활성 및 비활성 ELECTR에 대한송시 행위는 1.1, 1.2, 1.3 및 1.7 단계를 반복합니다. <ol><li> 이 뾰족한 펜치로 이중 가닥 스테인레스 스틸 전극을 꼬인 것이 풀리다. </li><li> 링 전극을 형성하는 나머지 하나의 긴 직선 가닥두고 스테인리스 스트랜드 (선단으로부터 약 1cm) 중 하나를 낸다. </li><li> 전극의 팁에서 매끄러운 고리를 형성하고, 다시 그 자체 트위스트 상 스테인리스 단일 가닥 접어. </li><li> 르 활성 전극 패션이 루프 ~ 0.2 - 루프의 염기 꼬아 직경 0.5 mm (여기에 설명 된 목적을 양쪽 눈으로부터 ERG를 기록하기 위해 이러한 방식으로 두 개의 활성 전극을 형성)을위한 ERG 비활성 VEP 전극 루프 직경은 ~ 0.8 mm 직경 (이 예에서는 하나의 능동 VEP 전극과 세 비활성 전극 용 이렇게) 만든다. </li><li> 스테인리스 나사 (직경 0.7 mm, 길이 3mm) 때문에 전극이 스크루 헤드의 주위에 얹혀 원형 VEP 활성 전극 후크. </li><li> 출동제 스테인리스 나사 (직경 0.7 mm, 길이 3 mm)의 주위에 3 비활성 전극 (ERG이 1을 VEP) K. </li><li> 자극을 줄이기 위해 두 개의 스테인리스 스틸 가닥의 날카로운 끝을 통해 앞으로 플라스틱 슬리브를 당깁니다. </li><li> 약 25 ° C에서 10 개 이상의 시간 동안 2 % 글루 타르 알데히드에 몸을 담근하여 원격 측정 송신기를 소독. 그런 다음 멸균 생리 식염수 3 회와 송신기를 씻어. </li></ol> 2. 송신기 주입 <ol><li> 동물 준비 <ol><li> 70 % 에탄올로 세정하여 실험 전에 수술 영역 소독. 사용하기 전에 모든 수술 장비를 압력솥와하지 않을 때 수술 중 사용 클로르헥시딘 장비를 유지한다. 멸균 환경을 유지하기 위해 수술 중 수술 용 드레이프 동물 커버. 모든 실험자 수술 마스크, 멸균 장갑과 가운을 착용해야합니다. </li><li> 3 L / 분 maintai의 유량으로 2 % 이소 플루 란 - 1.5 마취 유도수술을 통해 2 L / 분에서 2 % - 1.5 네드. 발가락 사이의 근육을 곤란에 페달 반사의 부재에 의해 마취의 충분한 깊이를 확인합니다. </li><li> 흉골에 사타구니 위에서 복부를 통해 40mm X 30mm의 영역을 면도. </li><li> 눈에 이마를 통해 후방을 30mm의 X 20mm의 영역을 면도하고 귀에 전방. </li><li> 두 면도 영역을 소독. 이마 지역의 경우 10 % 포비돈 - 요오드 세 번 (외과 기술자 협회에 의해 설정 연습의 표준에 부합되고, 눈 주변 지역에 대한 알코올 계 소독제의 사용을 방지)으로 소독. 복부에 걸쳐 10 %, 포비돈 요오드 및 70 % 에탄올로 소독. </li><li> 추가 국소 마취의 각막에 proxymetacaine 1 방울을 적용합니다. </li><li> 눈의 건조를 방지하기 위해 각막에 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨 1 방울을 적용한다. </li></ol></li><li> 외과 이식 <ol><li> 10 밀리미터 절개를합니다수술 용 메스와 귀 사이의 수직 중간 선을 따라 머리에. </li><li> 흉골 아래의 중간 선을 따라 피부 층을 통해 복부에 5mm의 절개를합니다. </li><li> 터널 헤드 절개에 복부 절개에서 5mm 직경 캐 뉼러 피하. </li><li> 머리 복부에서 캐 뉼러를 통해 상기 송신기의 전극 배선 (3 활성 및 비활성 3)를 공급. </li><li> 송신기베이스 기준 전극을두고 무균 거즈에 전극의 끝 부분을 커버합니다. </li><li> 무균 거즈와 전극의 끝 (3 활성 및 비활성 3)을 커버. </li><li> 정위 플랫폼에 쥐의 머리를 고정합니다. </li><li> 수술 가위로 길이 30mm로 이마의 절개를 확장합니다. </li><li> 3 ~ 9시에 - 2 봉합 (0 ~ 3)으로 느슨한 피부를 수축하여 수술 영역을 노출. </li><li> 브레 그마, 람다 및 정중선 봉합을 노출 멸균 거즈를 이용하여 두개골을 덮는 골막 긁어. </리&gt; <li> VEP 활성의 두개골을 통해 두 개의 구멍을 드릴 정위 좌표를 (정중선에서 정수리 5 밀리미터 주동이) 및 비활성 (7mm은 복부 정중선 외측 3mm를 정수리합니다). </li><li> 작은 스크류 드라이버 미리 만들어진 구멍에 깊이 ~ 1mm에와 두개골에 미리 부착 된 스테인레스 스틸 나사 (직경 0.7 mm, 길이 3mm)로 VEP 활성 및 비활성 전극을 연결합니다. 이것은 기본 피질 조직을 손상시키지 않고 뼈 나사 앵커. </li><li> 일시적으로 눈꺼풀을 철회 0 봉합 - 르 활성 전극 8을 사용하여 이식합니다. </li><li> 우수한 결막 원개까지 눈 뒤에서 16 G 21 정맥의 피하에 삽입합니다. </li><li> 가이드 바늘을 제거합니다. </li><li> 눈으로 이마에서 단축 플라스틱 카테터를 통해 활성 전극을 공급. 그런 다음 플라스틱 카테터를 제거합니다. </li><li> ELEC 않도록, 전극 루프를 통해 나사 결합, - 임시 봉합사 (0-8)를 사용하여다시 터널로 후퇴에서 trode. </li><li> 12시, 윤부 뒤에 1mm에서 우수한 결막에 0.5 mm의 절개를합니다. 기본 공막을 노출 무딘 절개를 사용합니다. </li><li> 반 공막 두께의 윤부 바로 뒤에 0 봉합 - 0 또는 9 - 8을 이식. </li><li> ERG 활성 전극에서 임시 봉합을 제거합니다. </li><li> 전극의 끝 부분을 보장 3 연속 매듭을 묶는하여 반 공막 두께 봉합에 ERG 활성 전극을 고정은 윤부 부근에 자리 잡고 있습니다. </li><li> (0 - - 9 0 8) 1 ~ 2 중단 봉합사를 이용하여 결막 플랩을 닫습니다. 결막이 완전히 편안함을 개선하기 위해 ERG 전극을 커버 있는지 확인합니다. </li><li> 눈꺼풀 후퇴 봉합사를 제거합니다. </li><li> 반대편 눈의 절차를 반복합니다. </li><li> 모든 스테인리스 나사와 전극 와이어를 확보하기 위해 두개골을 통해 시아 노 아크릴 레이트 젤을 적용합니다. 확인합니다 ERG 활성 전극은 실내에 고정하기 전에 너무 꽉 끌어되지 않습니다수 안구의 움직임. </li><li> 0 봉합 - 비 흡수성 3를 사용하여 머리에 상처를 닫습니다. </li><li> 복부를 노출 설치류를 돌립니다. 수술 가위로 원격 교육 알바를 따라 40mm의 복부 피부 절개를 길게. </li><li> 내부 복강을 노출 내부 근육 벽을 통해 35 밀리미터 절개를합니다. </li><li> 이 봉합 (가) 3 - 0 ()를 사용하면 동물의 오른쪽 내부 복부 벽에 송신기 본체를 연결합니다. 간 접촉하지 마십시오. </li><li> 루프 접지 전극과 봉합사 (3-0)이 모양 보안. 이 복강에 자유 떠 놓습니다. </li><li> 연속 봉합 (0 - 3)를 사용하여 복막을 닫습니다. </li><li> 중단 봉합 (0 - 3)를 사용하여 피부 절개를 닫습니다. </li></ol></li><li> 수술 후 관리 <ol><li> 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 모니터링합니다. 집은 동물 단독으로 수술을 다음과 같습니다. </li><li> carpr 관리OFEN 피하 4 일 동안 하루에 한 번 진통제 (5 ㎎ / ㎏)합니다. </li><li> 칠일 후 수술을 위해 식수에 예방 경구 항생제 (Enrofloxin, 5 ㎎ / ㎏)를 추가합니다. </li><li> 첫 번째 7 일 후 수술 자극을 줄이기 위해 피부 절개 사이트에 항 염증 연고를 적용합니다. </li></ol></li></ol> 의식 쥐 3. 행동 ERG와 VEP 녹음 <ol><li> 다크 전에 ERG와 VEP 녹음 12 시간 동안 동물을 적용 </li><li> 어두운 붉은 조명 (17.4 cd.m -2, λ 최대 = 600 ㎚)에서 모든 실험 조작을 실시 </li><li> 국소 마취 (0.5 % proxymetacaine) 및 확장시키고 (0.5 % tropicamide) 각막에 방울을 적용합니다. </li><li> 사용자 정의 만든, 명확한 제한 수단으로 의식 쥐를 안내합니다. 주 :이 플라스틱 튜브의 길이는 60mm로 고정 전체적인 직경이 다른 크기의 래트를 수용하도록 조절 될 수있다. 상기 장치의 전방 단부는 헤드 (MO)을 최소화하기 위해 테이퍼vement과 정상적인 호흡 수 있도록 구멍이 포함되어 있습니다. 이 테이퍼 전면는 Ganzfeld 구의 개방에 정렬 및 쥐의 머리와 눈의 안정화 할 수 있습니다. 설치류가 제한 수단 (3 ~ 5 차례) 이전에 수술에 순응되어 있습니다. </li><li> 그릇의 입구에 정렬 된 눈을 가진 Ganzfeld 그릇 앞의 쥐를 놓습니다. </li><li> 송신기의 ~ 5cm 내에서 자석을 전달하여 내주 송신기의 전원을 켭니다. 송신기는 수신기베이스의 LED 상태 표시등을 확인하여 켜져 있는지 확인합니다. </li><li> 이전 21 설명 된 바와 같이 발광 에너지 (즉, -5.6 1.52 로그에 cd.sm -2)의 범위에서 신호를 수집합니다. 간략하게, 밝게 빛나는 에너지의 주차 빛 수준 (~ 80 반복) 이하에서 평균 이상의 신호 (1 ~ 반복). 점차적으로 가장 어두운 영역에서 가장 밝은 빛 레벨 1 180 초에서 interstimulus 간격을 연장. </li><li> 르로드를 분리하려면콘 응답은 트윈 플래시 패러다임 (8)을 사용한다. 예를 들어, 1.52 로그 cd.sm 두 깜박 -2 년 사이에 500 밀리 초 간 자극 간격을 시작합니다. </li><li> 밝은 발광 에너지에서 VEP 신호, 평균 20 반복을 기록하기 위해 (즉, 1.52 로그 cd.sm -2, 5 초 간 자극 간격). </li><li> ERG 및 VEP 기록 7, 10, 14, 21 및 28 일 후 수술을 수행하는 시간이 지남 신호 변동에 의해 평가된다 임플란트 안정성을 평가한다. </li><li> 자일 라진 마취 (12 : 1 ㎎ / ㎏) 실험 기간에 따라, 케타민 후 pentobarbiturate의 intracardial 주입 (1.5 ㎖ / ㎏)를 통해 쥐를 안락사. </li></ol>

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RG와 RF는 이 연구의 상업적 자금 제공자(화이자 노이센티스 및 화이자 글로벌 리서치)의 직원입니다. MI는 이 연구 기간 동안 Pfizer Global Research의 직원이었으며 현재 Proteostasis Therapeutics(미국 케임브리지)의 직원입니다.

때문에 시각 전기 생리학의 최소 침습 자연, 인간 환자의 ERG와 VEP 기록은 의식이있는 상태에서 수행에만 전극 배치를위한 국소 마취제의 사용을 요구하고 있습니다. 반면에, 동물 모델에서 시각적 전기 생리학 종래 자발적 눈과 몸체 움직임을 제거하여 안정적인 전극의 배치를 가능하게 전신 마취 하에서 수행된다. 이전 공보 25-27 24 등으로 도시하지만, 일반적으로 사용되는 전신 마취제는 ERG 및 VEP 응답을 변경. 설치류 모델의 의식 ERG와 VEP 플랫폼 등의 개발로 차례로 임상 연구 결과를 임상에서 더 나은 번역 가능성을 줄 수있다 동물 모델에서 생리적 반응의 우수한 표현을 제공합니다. 마취를 사용하는 또 다른 단점은 실험의 기간을 제한한다는 것이다. 구체적으로는, 반복 administ뿐만 아니라 장기간의 마취제의 사용마취제의 배급은 약물 구축 및 관련 호흡기 문제 (28)과 같은 부작용의 가능성을 증가시킬 수있다. <p class="jove_conte...

르와 VEP는 각각 실험실과 병원 모두에서 망막과 시각 경로의 무결성을 평가하는 생체 도구의 최소 침습 있습니다. 전체 필드 ERG는 망막 통로 1,2- 다양한 세포 종류를 대표하는 각각의 요소와 다른 구성 요소들로 분해 될 수있는 특성 파형을 산출한다. 고전 전체 필드 ERG 파형은 광 수용체 활동 후 빛에 노출 2-4을 대표하는 것으로 나타났다 초기 음의 기울기 (A-파)로 구성되어 있습니다. 다음은 파가 중간 망막, 주로 ON 바이폴라 세포 5-7의 전기 활동을 반영하는 상당한 양의 파형 (B-파)로 이어진다. 또한, 하나는로드 응답 (8)로부터 콘을 분리 광량 간 자극 간격을 변화 할 수있다. 플래시 VEP는 망막 빛 자극에 반응하여 시각 피질과 뇌 줄기의 전기 전위를 나타냅니다9,10. 이 파형은 레티노-geniculo-선조체 경로 11-13 쥐 11,13 다양한 V1 라미 수행 피질 처리를 나타내는 말 성분 뉴런의 활성을 반영하는 초기 요소와, 초기 및 후기 요소로 세분화 될 수있다. 따라서 ERG와 VEP의 동시 측정은 시각 경로에 관여 구조의 포괄적 인 평가를 반환합니다. 현재 동물에서 전기 생리학을 기록하기 위해, 마취 전극 안정적인 배치를 가능하게 사용된다. 이 의식 쥐 14-16에서 ERG와 VEP을 측정하려는 시도하고 있지만, 이러한 연구는 복잡 할 수 있고, 동물의 움직임과 자연의 행동 (17)을 제한하여 동물의 스트레스로 이어질 수 유선 설정을 사용하고있다. 향상된 소형화 및 배터리 수명을 포함한 무선 기술의 최근 발전과 함께, 그것은 ERG의에 대한 원격 측정 방식을 구현하는 것이 가능하다유선 녹음 장기 생존율의 개선과 관련된 스트레스를 감소 차원 VEP 기록. 원격 측정 프로브의 완전 내재화 안정적인 주입은 만성 온도, 혈압 (18), 활동 (19)의 모니터링뿐만 아니라 뇌파 (20)에 대한 성공을 입증했다. 기술의 이러한 발전은 만성 연구를위한 플랫폼의 유틸리티를 증가, 반복성과 의식 녹음의 안정성에 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>생체 증폭기</td><td>ADInstruments</td><td>ML 135</td><td>ERG 및 VEP 신호 증폭</td></tr><tr><td>카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 1.0%</td><td>Allergan</td><td>CAS 0009000-11-7</td><td>수술 중 각막 수분 유지</td></tr><tr><td>Carprofen 0.5%</td><td>Pfizer Animal Health Group</td><td>CAS 53716-49-7</td><td>수액 보충을 위해 주사 가능한 식염수를 투여하는 수술 후 진통제</td></tr><tr><td>클로르헥사딘 0.5%</td><td>Orion Laboratories</td><td>27411, 80085</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>소독 시아노아크릴레이트 젤 활성제</td><td>RS 구성 요소</td><td>473-439</td><td>빠르게 건조 시아노아크릴레이트 젤</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 젤</td><td>RS 구성 요소</td><td>473-423</td><td>두개골에 스테인리스 나사 고정</td></tr><tr><td>치과 버</td><td>Storz Instruments, Bausch 및 Lomb</td><td>E0824A</td><td>VEP 나사를 이식하기 위해 각 반구의 두개골에 작은 구멍을 만들기위한 ~ 0.7mm 직경의 소형 드릴 헤드 드릴</td></tr><tr><td></td><td>Bosch</td><td>Dremel 300 시리즈</td><td>트레패닝용 자동 드릴</td></tr><tr><td>Enrofloxin</td><td>Troy Laboratories</td><td></td><td>예방적 항생제 포스트 surgey</td></tr><tr><td>Ganzfeld 통합 구</td><td>광도 측정 솔루션 국제</td><td></td><td>맞춤형 광 자극기 : 직경 36mm, 조리개 13cm 크기</td></tr><tr><td>거즈 면봉</td><td>Multigate Medical Products Pty Ltd</td><td>57-100B</td><td>수술 절개 및 노출 된 두개골 표면 건조</td></tr><tr><td>수술 중 Isoflurane 99.9 %</td> <td>Abbott Australasia Pty Ltd</td><td>CAS 26675-46-7</td><td>소유명: Isoflo(TM) 흡입 마취제. VEP 전극 임플란트 수술</td></tr><tr><td>Kenacomb 연고</td><td>Aspen Pharma Pty Ltd</td><td></td>를 위한 산소 가스와 혼합된 제약 등급 흡입 마취제 <td>수술 후 피부 자극 및 가려움증을 줄이기 위해</td></tr><tr><td>Luxeon LED</td><td>Phillips Lighting Co.</td><td></td><td>광 자극을 위해 20 개의 5 W 및 1 개의 1 W LED가 스코프 소프트웨어로 제어</td></tr>됩니다 <tr><td>바늘 (매크로 수술)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501959</td><td>복부 및 머리 수술 봉합에 사용되며 3-0 봉합사, 눈 바늘, 커팅 엣지 5/16 서클 크기 1, 15mm</td></tr><tr><td>바늘 홀더 (매크로 수술)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500224</td><td>복부 및 머리 수술</td></tr> <tr><td>중 바늘을 잡기 위해바늘 홀더 (미세 수술)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>555419NT</td><td>안구 수술 중 바늘을 잡기 위해</td></tr><tr><td>Optiva 카테터</td><td>Smiths Medical International LTD</td><td>16 또는 21 G</td><td>가이드 두개골에서 결막까지 각막 활성 전극</td></tr><tr><td>포비돈 요오드 10%</td> <td>Sanofi-Aventis</td><td>CAS 25655-41-8</td><td>소유명: Betadine, 수술을 위해 면도한 피부를 준비하기 위한 방부제 10%, 500 ml</td></tr><tr><td>Powerlab 데이터 수집 시스템</td><td>ADInstruments</td><td>ML 785</td><td>텔레메트리 송신기에서 신호 획득, 텔레메트리 데이터 컨버터</td></tr><tr><td>Proxymetacaine 0.5%</td><td>Alcon Laboratories&nbsp;</td><td>CAS 5875-06-9</td><td>토피칼 안구 진통</td></tr><tr><td>Restrainer</td><td>cutom 제작</td><td></td><td>Restrainer의 앞면은 머리 움직임을 최소화하기 위해 테이퍼되어 있으며, 길이는 다양한 랫 길이를 수용할 수 있도록 조정할 수 있습니다. 전체 직경은 60 mm입니다.</td></tr><tr><td>Scapel blade</td><td>R.G. Medical Supplies</td><td>SNSM0206</td><td>외과 절개</td></tr><tr><td>가위(매크로 수술)</td><td>World Precision Instruments</td><td>복</td><td>부 및 앞머리 조직 절단용</td></tr><tr><td>501225 가위(미세 수술)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501232</td><td>전극 부착을 위한 결막 해부</td></tr><tr><td>범위 소프트웨어</td><td>ADInstruments</td><td>버전 3.7.6</td><td>동시에 ADI Powerlab 시스템을 통해 자극을 트리거하고 데이터를 수집합니다.</td></tr><tr>수술 부위에서 쉐이<td>버</td><td>오스터</td><td>골든 A5</td><td>쉐이브 퍼</td></tr>, <tr><td>스테인리스 스트릴 나사&nbsp;</td><td>MicroFasteners</td><td>L001.003CS304</td><td>0.7 mm 샤프트 직경, 3 mm 길이&nbsp;</td></tr><tr><td>입체 프레임</td><td>David Kopf</td><td>모델 900</td><td>두개골의 이식 랜드 마크를 찾기위한 작은 동물 입체 기구</td></tr><tr><td>수술 용 드레이프</td><td>Vital Medical Supplies</td><td>GM29-612EE</td><td>수술 중 멸균 환경 보장</td></tr><tr><td>봉합사 (거대 외과)</td> 복부 및 머리 수술 봉합을위한 <td>Ninbo 의료 바늘</td><td>3-0</td><td>, 멸균 실크 꼰, 60cm</td></tr><tr><td>봉합 바늘 ( 미세수술)</td><td>Ninbo 의료용 바늘</td><td>8-0 또는 9-0</td><td>안구 수술 포함, 공막에 전극 봉합 및 결막 상처 봉합, 나일론 봉합사, 3/8 원 1 &times; 5, 30 cm</td></tr><tr><td>텔레메트리 데이터 변환기&nbsp;</td><td>DataSciences International</td><td>R08</td>을 <td>사용하면 텔레메트리 신호가 데이터 수집 소프트웨어와 인터페이스할 수 있습니다</td></tr><tr><td>텔레메트리 데이터 교환 매트릭스</td><td>DataSciences International</td><td></td><td>송신기에서 데이터를 수집하고 수신기와 페어링</td></tr><tr><td>텔레메트리 데이터 수신기</td><td>DataSciences International</td><td>RPC-1</td><td>송신기에서 텔레메트리 데이터 수신</td></tr> 텔레<tr><td>메트리 송신기</td><td>DataSciences 국제</td><td>F50-EEE</td><td>3 채널 텔레메트리 송신기</td></tr><tr><td>트로피카미드 0.5%</td><td>Alcon Laboratories&nbsp;</td><td></td><td>홍채 확장</td></tr><tr><td>핀셋 (거대 외과)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500092</td><td>복부 및 머리 수술 중 조직 조작</td></tr><tr><td>핀셋 (미세 수술)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>안구 수술 중 조직 조작</td></tr></tbody></table>

의식 쥐에 주입 및 무선 막전위의 기록 및 visual 사건 관련 전위

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

전체 필드 전위도 (ERG) 및 시각 유발 전위 (VEP)은 실험실과 임상 모두에서 망막과 시각 경로의 무결성을 평가하는 유용한 도구입니다. 현재 전임상 ERG와 VEP 측정은 안정된 전극 게재 위치를 보장하기 위해 마취로 수행됩니다. 그러나 마취 임재 정상적인 생리적 반응을 오염시키는 것으로 밝혀졌다. 이 마취 교란을 극복하기 위해, 우리는 의식 쥐의 ERG와 VEP를 분석 할 수있는 새로운 플랫폼을 개발한다. 전극은 수술 ERG을 분석하고 경막 VEP를 측정 할 수있는 시각 피질을 통해 할 수있는 눈에 서브 conjunctivally 주입한다. 진폭 및 감도 범위 / 타이밍 파라미터가 발광 에너지 증가에 ERG 및 VEP 양에 대해 분석된다. 르와 VEP 신호는 적어도 사주 후 수술 주입을위한 안정적이고 반복적으로 표시됩니다. 마취없이 ERG와 VEP 신호를 기록하는이 능력은 전임상들에 교란랩탑 설치는 임상 데이터에 우수한 번역을 제공해야한다.

감광체 응답은 램과 퓨의 모델에 기초하여, 각 동물에 대한 상위 2 발광 에너지 (1.20, 1.52 로그 CSM -2)에서 ERG 응답의 초기 하강 사지의 전연 지연 가우시안 피팅에 의해 분석되고 (22)는 후드와 자작 나무 (23)에 의해 공식화. 이 공식은 진폭과 민감도 매개 변수 (그림 1C 각각 1D를) 반환합니다. 쌍곡선 함수는 또한 진폭과 민감도 매개 변수 (그림 1E 및 1F 각각)을 반환 각 동물에 대한 막대 양극 세포의 발광 에너지 응답에 장착되었다. 콘 바이폴라 셀 진폭이 피크 반응에 도달하는 데 걸린 시간으로 촬영 암시 시간 파형의 피크 응답 (도 1a 및도 1b의 정상 파형)으로 분석 하였다. 자세한 사항은 ...

우리는 녹음이 마취 교란없이 실시하고 있습니다 인간의 조건에 더 유사하다 눈 (전위도) 및 의식 쥐의 뇌 (시각 잠재적 유발)에서 시각 전기 생리 신호를 측정하는 수술 주입 및 녹음 과정을 보여줍니다.

의식 쥐에 주입 및 무선 막전위의 기록 및 Visual 사건 관련 전위

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

이 절차의 전반적인 목표는 무선 텔레메트리 프로브를 외과적으로 이식한 후 의식 상태의 ERG 및 VEP 신호를 측정하는 것입니다. 이 기술은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 전신 마취의 제한 없이 뉴런이 어떻게 작동하는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 의식 상태의 동물에서 망막과 시각 피질의 전기 생리학적 신호를 동시에 기록할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하기 위해 현미경 하에서 전극을 준비합니다. 이를 위해 두 개의 정밀 플라이어를 사용하여 두 가닥으로 꼬인 스테인리스 스틸 전극을 풉니다. 스테인리스 스틸 가닥 중 하나를 끝부분에서 약 1cm 지점에서 절단하여, 링 전극을 성형할 수 있도록 하나의 더 긴 직선 가닥만 남깁니다.그 다음, 단일 스테인리스강 가닥을 다시 접고 꼬아서 전극 끝에 매끄러운 링을 형성합니다. 다음으로 루프의 기저부를 꼬아 직경 0.2~0.5 mm의 원을 만들어 ERG 활성 전극을 성형합니다. 2개의 ERG 비활성 전극과 1개의 VEP 비활성 전극의 경우 루프 직경을 0.8 mm로 만듭니다.이 예시에서는, 하나의 활성 ERG 전극과 세 개의 비활성 전극을 준비합니다. 그 다음, 원형 VEP 활성 전극을 스테인리스강 나사에 걸어 전극이 나사 머리에 닿게 합니다. 이어서, 세 개의 비활성 전극을 두 번째 스테인리스강 나사에 겁니다.접지 전극은 복강 내로 직접 삽입하며, 팁 부분에 루프를 만들 필요는 없습니다. 마취된 동물의 수술 부위를 삭모하고 소독한 후, 수술용 메스로 양 귀 사이의 정중선을 따라 머리 부분에 10 millimeter 절개를 가합니다. 그다음, 흉골 아래의 정중선을 따라 복부 피부층에 5 millimeter 절개를 가합니다.그 후, 복부 절개창에서 머리 절개창까지 직경 5 mm의 캐뉼라를 피하로 통과시켜 터널을 만듭니다. 송신기의 전극 와이어를 캐뉼라를 통해 복부에서 머리 쪽으로 밀어 넣습니다. 기준 전극은 송신기 베이스와 함께 둡니다.그런 다음, 모든 전극 팁을 무균 거즈로 덮습니다. 다음으로, 쥐의 머리를 고정 장치(stereotaxic platform)에 고정합니다. 외과용 가위를 사용하여 이마 절개 부위를 30 millimeters까지 확장합니다.그런 다음, 두 개의 봉합사를 사용하여 피부를 견인함으로써 수술 부위를 노출시킵니다. 두개골 위의 골막을 긁어내어 브레그마(bregma), 람다(lambda) 및 정중선 봉합선을 노출시킵니다. 이어서 VEP 활성 및 ERG, VEP 비활성 정위 좌표에 맞춰 두개골에 두 개의 구멍을 뚫습니다.활성 전극과 비활성 전극을 스테인리스강 나사로 두개골에 약 1mm 깊이로 고정합니다. ERG 활성 전극을 이식하려면, 봉합사를 사용하여 윗눈꺼풀을 일시적으로 견인합니다. 그다음, 16~21 gauge 캐뉼라를 안구 뒤쪽에서 상결막구석을 통해 이마 방향으로 피하에 삽입합니다.그 다음, 가이드 니들을 제거합니다. 이어서, 이마에서 눈 방향으로 플라스틱 카테터를 통해 활성 전극을 삽입합니다. 그런 다음, 플라스틱 카테터를 제거합니다.전극이 터널 안으로 다시 후퇴하는 것을 방지하기 위해 전극 루프에 통과시킨 임시 봉합사를 사용하십시오. 그 후, 각막연 뒤쪽 1mm 지점의 상결막에 0.5mm 절개를 실시합니다. 둔성 박리를 이용하여 아래의 공막을 노출시키십시오.그 다음, 각막연 바로 뒤쪽의 공막 두께 절반 지점에 봉합사를 삽입하되 안구를 천공하지 않도록 주의하십시오. 이어서 ERG 활성 전극에서 임시 봉합사를 제거합니다. 매듭을 세 번 연속으로 지어 ERG 활성 전극을 공막 두께 절반 지점의 봉합사에 고정하고, 신호 대 잡음비를 높이기 위해 전극 팁이 각막연에 가깝게 위치하도록 하십시오.필요한 경우, 활성 전극이 각막을 압박하지 않도록 과도한 전극 리드를 뒤로 당겨줍니다. 그런 다음, ERG 전극을 완전히 덮도록 1~2개의 단속 봉합사를 사용하여 결막 플랩을 폐쇄합니다. 그 후, 눈꺼풀 견인 봉합사를 제거합니다.반대편 눈에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다. 이제 모든 스테인리스 스틸 나사와 전극 와이어를 고정하기 위해 두개골 위에 시아노아크릴레이트 겔을 도포합니다. 눈의 움직임이 가능하도록 ERG 활성 전극이 고정되기 전에 너무 팽팽하게 당겨지지 않았는지 확인하십시오.다음으로, 단속 봉합을 사용하여 절개 부위를 폐쇄합니다. 그 후, 설치류의 몸을 돌려 복부 영역이 노출되게 합니다. 수술용 가위를 사용하여 백선(linea alba)을 따라 복부 피부 절개 부위를 40 millimeters까지 확장합니다.그 후, 내측 근육벽을 따라 35 millimeter 절개를 하여 복강 내부를 노출시킵니다. 두 개의 봉합사를 사용하여 송신기 본체를 동물의 복벽 우측에 부착하되, 간과 접촉하지 않도록 주의합니다. 접지 전극은 두 개의 봉합사로 루프 형태로 고정하여 접어둔 뒤, 다른 전극 리드선들과 함께 복강 내에 자유롭게 떠 있도록 배치합니다.그 다음, 연속 봉합법을 사용하여 복막을 닫습니다. 이어서 단속 봉합법을 사용하여 피부 절개 부위를 닫습니다. 암적응 신호를 기록하기 위해 동물들을 12시간 동안 암적응시키며, 모든 과정은 희미한 적색등의 도움을 받아 암실에서 수행합니다.설명을 위해 여기서는 일반적인 실내 조명 조건에서 기록을 수행하겠습니다. 기록 전, 쥐의 각막에 국소 마취제와 산동제를 점안하십시오. 다음으로, 의식이 있는 동물을 맞춤 제작된 투명 고정 장치에 넣으십시오.쥐의 눈이 그릇의 입구와 일직선이 되도록 Ganzfeld bowl 앞에 둡니다. 자석을 송신기에서 5 cm 이내로 가져가 체내 이식형 송신기를 켭니다. 수신기 베이스의 LED 상태 표시등을 확인하여 송신기가 켜졌는지 확인합니다.신호 대 잡음비를 개선하기 위해 수신 패드가 들어 있는 패러데이 케이지를 닫습니다. 그런 다음, 다양한 광에너지 범위에서 신호를 수집합니다. 이 그림은 수술 후 7일째 되는 날 의식이 있는 쥐에서 측정된 ERG 파형을 보여줍니다.ERG 반응을 다양한 범위의 자극 에너지에 대해 기록하였으며, 가장 낮은 강도의 플래시에 대한 반응은 하단에, 가장 높은 강도의 플래시에 대한 반응은 상단에 표시하였습니다. 수술 후 28일째에 이러한 파형은 7일째의 파형과 유사하게 유지되었습니다. 4주 동안 광수용기 진폭과 민감도에서 유의미한 시간적 영향은 나타나지 않았습니다.간상 양극 세포의 진폭과 민감도. 원추 양극 세포의 진폭. 그리고 잠복 시간.마찬가지로, VEP 파형은 수술 후 7일과 28일 시점에서 서로 유사한 것으로 나타났습니다. 진폭 및 타이밍 파라미터에서도 유의미한 시간적 영향이 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 ERG 및 VEP 신호가 안정적으로 유지되었음을 나타냅니다.숙달된 후에는, 이 기법의 수술 구성 요소는 1시간 반에서 2시간 이내에 완료됩니다. 의식 상태 기록 구성 요소는 적절하게 수행될 경우 45분 이내에 완료될 수 있습니다. 이 절차 이후에 약물 투여나 질병 조작과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다.이는 신약 개발의 추가적인 질문에 답할 뿐만 아니라 종단적 실험을 기록하는 데에도 활용될 것입니다. 또한, 필요에 따라 이 절차를 다른 동물에게도 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 의식이 있는 상태에서 ERG 및 VEP 텔레메트리 신호를 측정하기 위해 수술적으로 임플란트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

이 비디오는 망막 건강과 시력 경로 무결성을 연구하기 위한 쥐 모델의 준비를 보여줍니다. 시각적 유발 전위 및 전기 망막검사 참조 및 활성 전극을 쥐에 연결한 다음, 고르게 망막 조명을 위해 플랫폼을 Ganzfeld 그릇 앞의 쥐와 정렬하고 외부 간섭을 피하기 위해 패러데이 케이지를 닫습니다.

전기생리학 설정을 사용하여 시각적 경로 무결성을 평가하기 위한 RAT 모델 준비

이 비디오는 여러 부위의 뇌 활동에 대한 전기 생리학적 기록을 위해 마취된 쥐를 준비하는 자세한 절차를 보여줍니다. 두개골에 접근하기 위해 두피를 절개하고, 정확한 위치에 구멍을 뚫어 전극을 설치하고 고정합니다. 그런 다음 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상 위치에 삽입하여 데이터를 기록합니다.

쥐의 여러 부위에서 뇌 활동에 대한 생체 내 전기생리학적 기록

이 비디오는 무선 양방향 다채널 전극 장치를 쥐의 뇌에 이식하여 다채널 신경망을 기록하고 자극하는 절차를 보여줍니다.

쥐의 뇌에 무선 양방향 미세전극 시스템 이식

이 비디오는 빛 자극에 대한 반응으로 뇌의 시각 피질에서 나오는 전기 신호를 기록하는 미리 이식된 두개골 전극으로 어둡게 적응하고 마취된 쥐에서 시각적 유발 전위 또는 VEP를 측정하는 과정을 보여줍니다.

쥐 모델의 두개골 전극을 통한 시각적 유발 전위 기록

이 비디오는 실시간 발작 감지를 위해 마취된 쥐에 머리 전극 시스템을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 자극 및 전극 기록, 치과용 시멘트로 고정, 헤드 마운트 증폭기에 연결하는 작업이 포함됩니다.

실시간 발작 감지를 위해 쥐 모델에 머리 전극 시스템 이식

이 비디오는 의식이 있는 쥐의 망막전도(ERG)와 시각 유발 전위(VEP)를 기록하는 방법을 보여줍니다. 외과적으로 전극을 이식한 쥐는 먼저 어둠에 적응한다. 확장 점안액을 적용한 후, 동물을 구속기에 넣고 Ganzfeld 그릇에 넣습니다. 그런 다음 ERG 및 VEP 신호가 기록됩니다.

쥐의 망막전도 및 시각 유발 잠재력 기록

이 비디오는 발작으로 유발된 새끼 쥐의 뇌파(EEG) 신호 기록을 보여줍니다. 데이터 수집 시스템에 연결된 전극을 이식한 자유롭게 움직이는 강아지를 예로 들어 보겠습니다. 간질 발작을 유발하기 위해 신경독을 투여하고 EEG 신호를 사용하여 그에 따른 전기 파열 활동을 모니터링합니다.

자유롭게 움직이는 새끼 쥐에서 뇌파검사를 통한 유도 발작 기록

이 프로토콜은 마취된 쥐에서 망막전도와 시각적 유발 전위를 동시에 측정하는 것을 설명합니다.

전위도의 동시 녹화 및 마취 된 흰쥐의 비주얼 사건 관련 전위

무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

여기에서 우리는 현재 최대 10개의 분산된 뇌 영역에서 대칭적인 양측 와이어 전극 기록이 가능한 TD Drive라는 독특한 쥐용 3D 프린팅 가능한 임플란트를 소개합니다.

TD Drive: 행동하는 쥐와 잠자는 쥐의 다중 영역 전기생리학적 기록을 위한 파라메트릭 오픈 소스 임플란트

배우세요 무선 텔레메트리 프로브 수술 이식을 통해 의식 상태의 쥐에서 망막 및 시각 피질의 전기생리학적 신호를 동시에 기록하는 방법. 이 기법은 마취 없이 신경 행동을 연구하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

의식 쥐에 주입 및 무선 막전위의 기록 및 Visual 사건 관련 전위

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