면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

이 기술의 전반적인 목표는 마우스 장 조직의 긴 부분을 효율적으로 처리하여 길이를 따라 균일한 조직학적 염색을 수행하는 것입니다. 장 단면을 얻기 위해서는 장의 전체 길이를 따라 염색에 변화가 있을 수 있습니다. 나는 표준 스위스 롤링 기술을 사용해 보았지만 매우 뻣뻣하고 쉽게 열리지 않는 장 조직이 생성된다는 것을 알았습니다.

몇 가지 실험을 통해 독성이 적은 화학 물질을 사용하고 장 조직을 훨씬 더 잘 굴릴 수 있는 빠른 고정 방법을 생각해 냈습니다. 변형된 정착액은 다른 두꺼운 조직을 빠르게 고정하는 데 사용할 수 있습니다. 준비 과정에서 텍스트 프로토콜에 따라 실험 동물을 안락사시키고 수술 환경을 준비합니다.

시작하려면 해부 집게와 가위를 사용하여 마우스의 크기에 따라 흉곽 아래 약 1-2cm 아래의 복부 중앙을 측면 절개합니다. 그런 다음 피부를 부드럽게 잡아당겨 잘라내어 복부 근육을 드러냅니다. 다음으로, 장을 잡거나 당기지 않고 근육을 잡고 위로 당깁니다.

그런 다음 복부 근육을 조심스럽게 절개하고 조심스럽게 절개하여 장을 드러냅니다. 이제 결장을 확인하고 직장과 연결되는 원위 끝까지 추적하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 결장을 항문 입구에 최대한 가깝게 절제합니다.

다음으로, 위가 소장과 연결되는 지점을 찾아 가위를 사용하여 위에서 약 1cm 떨어진 장을 잘라냅니다. 이제 자유 소장과 결장의 전체 길이를 PBS가 들어 있는 깨끗한 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 결장의 말단부를 고정하고 결장 전체를 부드럽게 풀어 부착된 장간막 조직을 제거합니다.

그런 다음 맹장을 확인하고 맹장이 결장과 연결되는 장을 절제하여 결장을 분리합니다. 마찬가지로 부착된 장간막 결합 및 지방 조직에서 소장의 나머지 부분을 풀어냅니다. 그런 다음 맹장과 합류하는 소장을 횡단합니다.

그런 다음 맹장을 제거하고 버릴 수 있습니다. 이제 10ml 주사기에 변형된 Bouin의 고정제를 채우고 개게이지 바늘을 부착합니다. 장 분절의 앞쪽 구멍에 약 50cm 정도 바늘을 삽입합니다.

분절 내부에 개관 바늘을 단단히 고정하면서 고정제로 조직의 내용물을 천천히 씻어냅니다. 너무 많은 압력을 가하면 세그먼트가 파열될 수 있으므로 주의하십시오. 소장이 너무 길어 처리할 수 없는 경우 먼저 소장을 세 개의 동일한 세그먼트로 자르고 각 세그먼트를 개별적으로 플러시할 수 있습니다.

고정으로 인해 장 부분의 색이 불투명해집니다. 다음으로, 가위를 사용하여 장간막 선을 따라 세그먼트를 세로로 자른 다음 집게로 열린 상태에서 PBS 접시에 세그먼트를 간단히 헹굽니다. 이제 소장을 근위부, 중위부, 원위부의 세 개의 동일한 부분으로 자르며, 이는 대략 십이지장, 제주넘 및 회장에 해당합니다.

거시적으로 볼 때, 각 섹션에는 눈에 띄는 특징이 없습니다. 각 세그먼트의 원위 끝에서 근위를 식별할 수 있는 표시를 해야 합니다. 그런 다음 내강 면이 위를 향하도록 세그먼트를 페트리 접시의 뚜껑에 놓습니다.

결장 분절에서, 근위 끝에서 너비를 가로지르는 융기로 내강 쪽을 식별합니다. 중간 및 원위 영역에는 세로로 이어지는 몇 가지 잡색이 있습니다. 소장에서는 융모를 표시하는 더 거친 표면으로 내강 쪽을 확인합니다.

현미경 검사에 따르면 융모는 각 분절의 근위 영역에서 가장 긴 반면, 결장 소굴은 근위 영역에서 가장 짧고 중간 부분에서 가장 높습니다. 결장의 스위스 롤링을 진행합니다. 결장을 평평하게 열고 내강 쪽이 위로 향하게 하여 근위 끝에서 페트리 접시의 가장자리를 향해 집게로 당깁니다.

내강 쪽을 위로 향하게 하고 집게로 근위부 끝을 잡고 근위부 끝의 가장자리를 이쑤시개로 감싸고 감싼 가장자리를 이쑤시개에 단단히 조입니다. 그런 다음 이쑤시개 주위로 결장을 부드럽고 천천히 굴려 스위스 롤을 만듭니다. 결장 길이 전체를 말아 올리면 다른 집게를 사용하여 롤을 조직 처리 카세트에 조심스럽게 밀어 넣습니다.

그런 다음 카세트를 10% 완충된 포르말린으로 옮기고 실온에서 밤새 배양합니다. 소장 조각을 스위스로 굴리려면 내강 쪽을 위로 열고 집게로 근위 끝에서 접시 가장자리를 향해 당깁니다. 그런 다음 콜론에 표시된 것과 동일한 기술을 사용하여 스위스 롤을 만들고 포르말린으로 고정합니다.

설명된 방법을 사용하여 C57 black 6 마우스의 대장에 대한 HND 염색을 통해 포괄적인 조직학적 평가를 위해 결장의 모든 부분을 밝혔습니다. 다음으로, 제제는 말초 장 소낭선에서만 활성화되는 LGR5 프로모터에 의해 구동되는 EGFP를 발현하는 마우스에 대해 사용되었습니다. 이 EGFP 전이유전자는 침투율이 약 5-10%에 불과하지만 관심 영역을 쉽게 찾을 수 있습니다.

EGFP LGR5 발현을 가진 동일한 마우스를 사용하여 KLF5 및 KI67을 염색했습니다. 정상적인 LGR5 발현을 가진 첫 번째 대조군 마우스를 연구했습니다. EGFP 양성 세포는 파란색 화살표로 표시되고 EGFP 음성 세포는 흰색 화살표로 표시됩니다.

그런 다음 KLF5 녹아웃 마우스에서 동일한 전이유전자를 발현했습니다. KLF5와 KI67의 동시 염색은 EGFP 양성 줄기세포에서는 누락되었지만, EGFP 음성 crypt에는 남아 있습니다. 분명히 다중 플루오로 힘 염색을위한 준비의 품질은 매우 우수합니다.

일단 숙달되면 이 기술은 소장과 결장을 모두 수집하는 경우 쥐당 약 15분 안에 완료할 수 있습니다. Bouin의 고정제로 작업하는 것은 눈에 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 눈 보호와 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

지켜봐 주셔서 감사하고 실험을 잘 봐주셔서 감사합니다.