Name: 면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 개선된 스위스 압연 기술을 사용하여 생쥐 창자 조직을 효율적으로 처리하고 균일한 조직학적 염색을 달성하는 방법을. 이 기법은 독성이 낮은 화학물질을 사용하여 조직 처리의 안전성과 품질을 향상시킵니다.

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H&E 이미지를 제공해 주신 Ainara Ruiz de Sabando에게 감사드립니다. 이 연구는 Vincent W. Yang 박사에게 수여된 미국 국립보건원(DK052230, DK093680 및 CA172113)의 보조금으로 지원되었습니다.

1. 마우스 <ol><li> 마우스와 관련된 모든 연구는 스토니 브룩 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 마우스는 12시 12분 시간의 명암주기를 유지 하였다. <ol><li> 상업적으로 C57BL / 6 마​​우스를 얻을 수 있습니다. 에 loxP 사이트에 의해 형벌 Klf5 대립 유전자 (Klf5 f를 L / F 리터)을 들고 C57BL / 6 마우스를 얻습니다. 이 마우스는 이전에 (21)을 설명하고 우아 박사 료조 나가이에 의해 제공되었다. </li></ol></li><li> Lgr5 프로모터 (Lgr5-EGFP / CreERT2 마우스)의 규정에서 유도 Cre 호텔의 재조합 효소 유전자를 운반하는 C57BL / 6 마​​우스를 구입하십시오. </li><li> Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 f를 L / f를 리터 마우스를 설정하려면, 교차 Klf5 FL / F Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스와 다음 Klf5 FL / F 리터의 자손을 역 교배 리터 마우스 </SUP&gt; 마우스. </li><li> 프로토콜에 따라 타목시펜으로 치료 마우스는 이전 22 설명했다. 연속 5 일 동안 멸균 옥수수 기름에 용해 타목시펜 1 밀리그램 (10 ㎎ / ㎖) 8 주령의 실험 및 대조군 마우스의 복강 (IP)을 주입한다. </li><li> 첫 번째 타목시펜 주사 후 14 일에서 2 가스 소스를 CO에 연결 챔버에 배치하여 CO 2 질식을 사용하여 마우스를 희생. 마우스 의식하고 모든 움직임이 중단 될 때까지 가스가 챔버로 유입 할 수 있습니다. 안락사는 자궁 경부 전위를 수행 할 수 있도록합니다. </li></ol> 2. 조직 준비 및 스위스 롤링 <ol><li> 해부 집게와 가위를 사용하여 복부 쪽의 피부에 절개를 잘라. 포셉 한 쌍으로, 절개 부위의 피부를 잡고 부드럽게 떨어져 복부 근육 조직에서 빼냅니다. 복부 근육을 복부 피부를 잘라 노출 가위를 사용합니다. </li><li> 잡고 흥을 끌어포셉으로 ritoneum. 잡고 창자에서 당겨 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 복막 조직의 절개를하고 복부 근육을 노출 피부를 멀리 절단을 계속합니다. 조심스럽게 복부 근육의 절개를하고 장을 노출을 멀리 절단을 계속합니다. </li><li> 콜론를 확인하고는 직장 / 항문을 조인 말단부에 추적. 가위로, 가능한 한 항문에 가깝게 잘라. </li><li> 위를 확인하고는 소장과 결합 위치를 추적. 가위로 약 1cm 떨어진 위장에서 소장 무료 잘라. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 깨끗한 페트리 접시에 해제 소장과 대장의 전체 길이를 전송합니다. </li><li> 한 손 또는 집게 쌍으로 결장의 말단부를 잡고있는 장간막 부드럽게 결합 및 / 또는 지방 조직에서 콜론의 전체 길이를 해명 한편을 사용한다. </li><li> 맹장을 식별(작은 크고 작은 창자 사이 파우치)과 맹장과 결장은 대장을 무료로 (콜론의 기단부)에 가입 위치를 잘라. </li><li> 한 손이나 집게 한 쌍으로, 소장을 잡고 조심스럽게 모든 장간막 결합 및 / 또는 지방 조직에서 소장의 전체 길이를 해명하기 위해 다른 손을 사용합니다. 맹장을 절취하고 필요가없는 경우 버린다. 밤새 처리가 DH (2 O 50 % 에탄올 / 5 % 아세트산)의 변형 Bouin 정착액의 밖으로 해부 창자 배양하여 여기에 정지 될 수 있고, 다음 날의 절차를 계속 참고. </li><li> 소장 (소장 또는 대장)의 하나의 세그먼트를 처리, 수정 Bouin의 정착과 함께 10 ML의 주사기를 작성하고 그것에 위관 바늘을 연결합니다. 장 세그먼트 (segment)의 전방 구멍에 반 센티미터에 대해 바늘을 삽입합니다. </li><li> 악기에 확실히 압력을인가함으로써 장 구간 안에 위관 니들을 잡아장 세그먼트. 한편 주사기 채 수정 Bouin의 정착액을 이용하여 장 구간의 내용을 플러시 완만하지만 일관된 압력을 적용한다. 이 단계는 장 세그먼트 즉시 고정 동시에 청소를 할 수 있습니다. 플로우를 통해 폐기물을 수집하는 페트리 접시를 사용합니다. 고정 불투명 선회 결장 색으로 관찰 할 수있다. 참고 : 세척하거나 장 세그먼트가 오픈 버스트 수있는 동안 너무 많은 압력을 가하지 않도록해야합니다. </li><li> 가위를 사용하여 장간막 라인을 따라 길이 방향으로 장 세그먼트를 열 잘라. 한 쌍의 겸자로 잡아하고 PBS를 함유하는 페트리 접시에 간단히 린스. <ol><li> 근위부, 중간 및 원위부 : 3과 동일 세그먼트로 소장을 잘라. 근위 세그먼트는 위 다음 바로 하나이며, 말단 부분은 콜론 전에 즉시 하나입니다. 근위 세그먼트에 십이지장, 소장의 중간 및 말단에 해당회장. </li><li> 각 세그먼트의 근위 및 원위 단부를 표시한다. 선단부는 원래 위를 향해 가리키는 된 하나는 콜론으로 지적 말단이다. </li></ol></li><li> 세정 및 열 장 세그먼트를 배치하는 페트리 접시의 상단을 사용합니다. 내강면이 위를 향하도록 장 세그먼트를 배치합니다. <ol><li> 콜론의 경우, 그것의 폭을 가로 질러 실행 variegations / 능선에 의해 내강면을 식별하고 기단부에 존재한다. 중간 및 말단 영역은 길이 방향으로 실행 일부 variegations 있습니다. 소장의 경우, 융모를 표시하는 거친 나타나는 표면에 의해 내강 측을 식별합니다. 참고 : 작은 창자를 들어, 근위부, 중간 및 말단 영역의 외부 육안 해부학 적 경계가 없습니다. 그러나이 지역은 현미경 섹션에서 확인 할 수있다. 그들이 곳 융모는 말단 점차 짧아 인접 지역에서 가장 오래되고이 될길이가 짧은. 미시적으로는 결장 음와은 리지의 존재에 의해 식별 될 수있는 인접 영역의 최단이다. 대장 지하실 아직 인접 지역에 비해 여전히 키가 말초 지역의 중앙부에서 가장 높은 짧은이다. </li></ol></li><li> 스위스 결장 롤링 진행합니다 : <ol><li> 평면 오픈 콜론을 유지하고 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다. </li><li> 이 위를 향하도록 내강면을 유지하고 한 손으로 집게로 근위 끝을 잡고 다른 손으로 이쑤시개를 개최합니다. </li><li> 집게를 사용하여 이쑤시개 주위의 기단부의 가장자리를 감싸 약간 제자리에 고정하기 위해 이쑤시개에 랩 가장자리를 끼. </li><li> 부드럽게 천천히 스위스 롤을 형성하기 위해 이쑤시개 주위에 결장 롤 손가락으로 이쑤시개를 압연 시작합니다. </li><li> 전체 대장의 길이가 겹쳐서되면, 조심스럽게 C를 슬라이드 집게 한 쌍을 사용하여이쑤시개 오프 및 조직 처리 / -embedding 카세트에 olon 스위스 롤. 실온에서 하룻밤 동안 10 % 포르말린에 카세트를 놓습니다. </li></ol></li><li> 스위스 소장 롤링 진행합니다 : <ol><li> 한 번에 하나의 세그먼트를 처리, 내강면이 평면 오픈 세그먼트를 주기적으로 업데이트하여 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다. </li><li> 대장에 기재 한 바와 같이 스위스 압연을 진행합니다. </li></ol></li><li> 파라핀 삽입에 대한 포르말린 고정 조직을 처리를 진행합니다. 다음과 같이 진행하십시오 : 참고 : (자세한 내용은 자재 및 장비의 참조) 자동화 된 프로세서를 사용합니다. <ol><li> 조직 카세트 중일 고착성이 완전히 제거 될 때까지, PBS로 조직을 헹군다. </li><li> 다음 순서에 따라 에탄올을 이용하여 조직을 탈수 : 50 %의 에탄올을 10 분, 70 % 에탄올에서 10 분, 80 % 에탄올에서 10 분, 10 분, 95 % 에탄올, 10 분 동안 100 % 에탄올, 100 % 에탄올 10 분간 , 110 분 00 % 에탄올. </li><li> 다음 순서 자일 렌과의 교류 에탄올 : 2 : 1의 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 1 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 2 에탄올 : 10 자일 렌 - 10 15 분, 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분. 주의 : 크실렌 따라서 직장이 적절한 후드와 직원이 착용해야 적절한 보호 장비와 국소 배기 장치가 장착되어 있어야 건강에 유해하다. </li><li> 파라핀과의 교류 크실렌. 2 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 100 % 파라핀 58 °의 C - 오븐 (54)에 설정된 진공에서 다음 단계를 수행 1 - 2 시간, 1 100 % 파라핀 - 2 시간 또는 하룻​​밤. 참고 :이 파라핀 중합체를 분해하고 단단하고 부서지기 쉬운 것 때문에 파라핀 시간의 연장 기간 동안 60 ° C를 넘지 않도록하십시오. </li><li> 드 신선한 새로운 파라핀과 동양 조직에 포함파라핀이 경화되기 전에 희망하는. 스위스 롤의 경우, 조직 paraffinization 다음, 파라핀 삽입하는 동안 옆에 각 롤의 위치를​​ 변경하는 것이 중요합니다. 이 절단시 각 롤의 전체 길이의 부분이 생성 될 것임을 보장한다. </li></ol></li><li> 염색의 경우, 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 부분을 잘라. ; 충전 슬라이드에 섹션을 수집하고 오븐에서 밤새 65 ° C에서 그 (빵)을 건조 실온에 시원하고 연속적으로 염색을 위해 그들을 사용 할 수 있습니다. 주 : 소성 시간은 1로 단축 할 수있다 - 슬라이드 얼마나 갓 절단에 따라 2 시간. 절편 이후 한 달 미만의 경우는 하룻밤 구워하는 것이 좋습니다. 한 달 이상 되었다면, 1 - 2 시간의 소성 시간을 저장하기에 충분하다. 시간이 부족하면, 밤새 백업은 항상 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 조직 학적 분석 및 면역 형광 염색법 조직 학적 분석 및 immunoflu를 수행orescence 염색은 이전의 수정, 23, 24을 설명했다. 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 면역의 경우 : <ol><li> 1 시간 동안 65 ° C 오븐에서 슬라이드 구워 내생 알칼리 포스 파타 아제 활성을 비활성화하고 이후 자일 렌에 deparaffinize. </li><li> 내인성 퍼 옥시다아제 조직을 차단 메탄올 중 3 % 과산화수소 욕 섹션을 인큐베이션; 다음 10 분 동안 125 ° C에서 구연산 완충액 항원 회수 하였다 감소 알코올 욕 시리즈 (100 %, 95 %, 70 %)에서 배양 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0) 재수 decloaking 챔버를 사용하여. </li><li> 소수성 장벽을 제공 펜을 표시하여 조직 섹션 주위에 원을 그리고 (EGFP에 대한 일차 항체로 다음 희석 한을 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS-트윈 2.5 % 소 혈청 알부민 [BSA]) 버퍼를 차단과 함께 섹션을 품어 : 밤새 가습 실에서 4 ° C에서 500) 부드럽게 흔들어 섞으면.</li><li> 부분을​​ 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 적절한 농도로 형광 표지 된 이차 항체와 함께 품어. </li><li> 훽스트 2 차 항체 처리 및 얼룩 핵 후 슬라이드를 세척하고 설치 미디어를 탑재합니다. <ol><li> Klf5 / EGFP / 기-67 공동 염색의 경우, 프로세스 슬라이드 단계 3.1에 ​​설명 된대로 - 3.3 Klf5 항체 (희석 1 : 150)을 배양하여 Klf5 염색을 수행 하룻밤. </li><li> 프로토콜에 따라 슬라이드에 토끼 AP 폴리머 검출을 적용합니다. </li><li> Klf4는 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 면역 조직 화학 염색을 이용하여 염색 알 수있다. </li><li> 이전에 기술 된 프로토콜 25을 사용하여 항체 용출을 수행합니다. 글리신 - SDS에서 50 ° C (산도 2.0) 1 시간 동안 교반 솔루션에서 슬라이드를 품어. </li><li> 세척하고 증류수로 충분히 슬라이드 및 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS 트윈 - 2.5 %의 BSA) 블로킹 완충액으로 배양한다. </li><li> 기-67 추가 (희석 1 : 500)와 EGFP (희석 1시 50분0) 동시에 항체 및 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> (데이터는 도시하지 않음) 훽스트 염색하기 전에 적절한 보조 항체와 형광 검출을 수행하고 매체를 장착 마운트. </li></ol></li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 26 5 μm의 섹션을 염색에 조직의 조직 학적 형태를 관찰한다. 형광 이미지의 각각 EGFP, Klf5 및 기-67 염색을 시각화 535, 646, 700의 방출 파장을 사용합니다. </li></ol>

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<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

스위스의 압연 기술은 대규모 조직 학적 및 형태 학적 평가 소장 조직을 제조하기위한 강력한 방법이다. 원래 동결 절편 (18, 19)의 제조를 위해 개발 된 전술 스위스 압연 기술과는 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직에 대한 신속한 장 준비 및 고정 할 수있다. 냉동 된 조직과 비교 FFPE 조직 훨씬 긴 수명을 갖고 있기 때문에 더 조직 무결성 조직 학적 분석을 위해 조직의 바람직한 형태이다. 스위스 압연 프로토콜의 중요한 부분은 압연 및 염색 postfixation의 스위스 롤 무결성 및 조직의 품질을 유지하기위한 조직의 유연성을 포함한다. 장 조직 FFPE 표준 스위스 롤 기법은 일반적 힘들고 시간 소모적 (2 일) (18, 19)이다. 또한,이 표준 방법은 일반적으로 R은 소장 조직을 수득elatively 뻣뻣하고 쉽게되지는 스위스 롤에 형성한다. 10 % 포르말린에서 장 해부 조직 밤새 인큐베이션 조직 압연 전의 요구되기 때문이다. ...

포유류 장 상피 원주 세포의 단일 층을 포함한다. 분화 된 세포가 융모의 영역을 차지하면서 소장에서 증식 세포 지하실에 국한된다. 대장에는 융모 없기 때문에 그러나 증식 세포 지하실의 바닥에 지역화 및 분화 세포 소낭의 상부 영역을 차지한다. 지하실 내 증식 성 세포의 연속 분할에 의해 구동된다 - (5 일 3) 장 상피 신속한 보급을 겪는다. 지하실의 증식 성 세포는 균질 집단 아니며 상기 줄기 세포와 교통 증폭 (TA) 셀 (1)로 세분화된다. 이 바로 아래에서 5 세포 - 줄기 세포는 제 4 내 토굴 하단에 상주. 굴베이스 기둥 (CBC) 줄기 세포 및 예비 정지 줄기 세포 : 현재의 모델은 두 가지 줄기 세포 유형의 존재를 지원한다. CBC의템 세포는 활발하게 증식하고 류신이 풍부한 반복 포함하는 G 단백질 결합 수용체 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 Achaete의 방패 꼴의 뼈 조각 같은 2 (Ascl2) (5)로 표시됩니다. 한편, 예비 정지 줄기 세포는 B 세포 특이 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 통합 위치 1 (BMI1) 6 마우스 텔로 머라 제 역전사 (mTert) (7)에 의해 표시되어, HOP 호 메오 박스 (Hopx) 8 Doublecortin 형 캠 키나제 -like 1 (Dclk1) (9), 및 류신이 풍부한 반복 및 면역 글로불린 같은 도메인 1 (Lrig1) 10. 능동적 증식 줄기 세포를 흡수 셀 (장 세포) 및 분비 세포 (장 내분비, 잔, Paneth 및 다발 세포)로 분화를 더 받아야 TA 세포 일으킨다. 그들은 세포 사멸을 받아야하고있는 융모의 상단에 도달 할 때까지 증식 영역에서 지속적인 세포 분열은 토굴-융모 축을 따라 상피 세포의 상향 이동 결과상피의 표면으로부터 벗겨진. 장 상피 세포의 종류 (예를 들어, 장 배 세포가 리소자임에 대한 항체 및 MUC2 Paneth 세포에 대한 항체로 염색하여 인식 할 수있다) 별개의 단백질의 발현에 의해 표시된다. 우리는 장 상피 11-13의 항상성 및 병리 생물학에서 크 룹펠 같은 요인 (KLFs)의 역할을 연구한다. 변형 스위스 - 롤링 방법의 타당성을 지원 여기에 제시된 결과는 활발히 증식 장내 상피 줄기 세포 (14)의 유지 보수 크 룹펠 형상 인자의 역할 5 (KLF5)의 이전 연구에 기초한다. KLF5는 매우 활성 장 줄기와 TA 세포 (12)로 표현된다 아연 손가락 전사 인자이다. 이전 연구는 KLF5이 기-67, 장 지하실에서 알려진 증식 마커와 공동으로 표현되는 것을 보여 주었다. 위장 TR<html> 행위는 구조적으로 또는 기능적으로 균일 한 조직이 아니다. 소장은 근위부, 중간, 말단 부분으로 나누어 후자의 추가와 함께, 십이지장, 공장 및 회장과 맹장과 결장으로 대장으로 구분된다. 이 섹션은 각각 고유의 조직 학적 특징을 가지고 있으며, 서로 다른 역할 (15)을한다. 이와 같이, 욕설 효과 및 장 상피 세포의 반응의 정도를 연구 조직 (16)의 영역에 의존 할 수있다. 또한, 다양한 마우스 균주는 시험 16에 사용 모독의 유형에 기초하여 조직 학적 수준의 응답의 다양성을 증명한다. 따라서, 티슈 제조 어울리는하여 적절한 조직 학적 및 장 조직의 분자량 분석을 허용 할 필요가있다. 이와 같이, 스위스 롤 기술을 부여 한 번에 장 상피 세포의 전체 길이의 분석 따라서 포괄적 인 정보를 기반으로 박식 한 결론을 확인한다. e_content &quot;&gt; 스위스 롤 기법 제 매그너스 (17)에 의해 언급 한 Moolenbeck 및 Ruitenberg 및 공원 등에 의해 상세하게 설명 하였다. 조직을 준비하고 조직학을 수행하는 방법은 쥐 소장 18,19 각각. 프로토콜 분석으로 진단 목적을위한 적절하고 신뢰성있는 티슈 제조 허용 일본어 방법의 개선 된 버전이 공보에 제시 묘사. 이러한 변형 기술은 효율적인 수집 및 면역 조직 화학, 면역뿐만 아니라 세계적으로 사용되는 기술에 대한 장 상피 세포의 제조를 허용 추가 평가를 위해 (형광 및 발색 20) 현장 하이브리드에있다. 또한, 제조 방법 표본 수정 된 조직은 신속한 조직 고정하는 방법을 제공하는 동안 쉽게 사용 가능하고 상대적으로 저렴한 시약을 이용하여 단백질, DNA의 복구를 위해 수 있으며, RNA. 카메라 함께 생의 기술은 장 상피 세포의 조직 병리학 병리학, 분자 기능의 종합 평가 우수하다.

<table><tbody><tr><td>스테인레스 스틸 해부 키트</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>은폐 제거 챔버</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012</td><td></td></tr><tr><td>주사기 10 ml</td><td>VWR</td><td>89215-218</td><td></td></tr><tr><td>Swingsette 티슈 임베딩 / 처리 카세트 뚜껑</td><td>포함 Simport</td><td>M515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides [크기 : 25 x 75 x 1 mm]</td> <td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>수동 슬라이드 염색 세트</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>염색 접시 녹색</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>염색 접시 흰색</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>탈착식 손잡이가 있는 24-슬라이드 슬라이드 홀더</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>오븐</td><td>Thermo Scientific</td><td>6243</td><td>65도 베이킹 슬라이드</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000C</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 90i</td><td>밝고 형광등, 대물렌즈: 10X, 20X</td></tr><tr><td>PAP 펜 Super-Liquid Blocker Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200 증명</td><td>AAPR</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>AAPR</td><td>281000ACS</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 25% 물 용액</td><td>아크로스</td><td>202465000</td><td></td></tr><tr><td>10% 부퍼 포르말린</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 분획 V, 열 충격</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279</td><td></td></tr><tr><td>Gavage needle</td><td>VWR</td><td>20068-624</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti Klf5 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-22797</td><td>Dilution 1:150</td></tr><tr><td>Chicken anti EGFP 항체</td><td>Millipore</td><td>AB16901</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti Ki67 항체</td><td>Biocare Medical</td><td>CRM325B</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Mach3 토끼 AP 폴리머 검출 키트</td><td>Biocare Medical</td><td>M3R533L</td><td></td></tr><tr><td>워프 레드 크로모겐 키트</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806 H</td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP/CreERT2 마우스&nbsp;</td><td>잭슨 연구소</td><td>008875&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>자동화 프로세서</td><td>Leica</td><td>Leica TP1020</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

장 상피 항상성을 조절하는 요인의 역할과 부상 및 재생에 대한 반응을 이해하는 것이 중요합니다. 현재 문헌에서는 데이터 검증을 위해 장 조직의 이미지를 얻기 위한 여러 가지 방법론적 접근 방식을 설명합니다. 이 논문에서는 마우스 장 조직의 유도 및 처리와 관련된 일반적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 장 조직의 적절한 고정과 장 상피 형태를 향상시키는 스위스 롤 기술에 대해 논의합니다. 절제 후 처리 및 포매된 장 조직의 재배치는 절제 후 온전한 장 구조적 특징을 나타내는 파라핀 포매 블록을 얻는 데 중요합니다. 스위스 롤링 기법은 검사된 전체 장 또는 결장 절편의 조직학적 평가에 도움이 됩니다. 장의 구조적 특징을 구별하는 능력은 전체 길이에 걸친 장 염증 및 종양 형성을 정량적으로 측정하는 데 중요할 수 있습니다. 마지막으로, 파라핀 함유 절편은 면역조직화학 및 면역형광 검출 방법을 모두 사용하는 견고한 공정에 이상적입니다. 비형광 면역조직화학 절편은 다양한 세포 구조적 특징을 자세히 설명하는 조직의 생생한 이미지를 제공하지만 세포 내 공동 국소화 실험에 유연성을 제공하지는 않습니다. 다중 형광 채널은 공동 국소화 실험을 위해 면역형광 검출과 함께 적절하게 활용될 수 있어 기계론적 연구를 지원합니다.

면역 조직 화학 염색과 함께 스위스 압연 기술은 작거나 큰 장 조직의 포괄적 인 분석이 가능합니다. C57BL / 6 마우스 (그림 1)의 대장의 H &amp; E 염색의 예는 타당성의 그림과이 기술의 효과이다. 근위, 중간 및 말단도 1에 도시 된 바와 같이, 화상이 대장 모든 부분을 캡쳐 할 수있다. 따라서, 광범위한 조직 학적 평가를 허용한다. 스위스 롤과 크고 작은 창자 조직의 전체 길이를 캡처하는 능력은 이종 유전자 발현 마커 염색 또는 모욕 장 조직의 가변 응답 매우 유용하다. 예 Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스에서 EGFP 염색 패턴이다. 이 마우스 모델에서, EGFP의 발현에 의해 구동되고만 활발하게 증식 장 지하실에서 활성 Lgr5 프로모터,.<...

정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

이 기술의 전반적인 목적은 마우스 장 조직의 긴 섹션을 효율적으로 처리하여 전체 길이에 걸쳐 균일한 조직학적 염색을 얻는 것입니다. 장 섹션을 얻을 때, 장의 전체 길이에 따라 염색 정도에 차이가 발생할 수 있습니다. 표준 스위스 롤링(Swiss rolling) 기술을 활용해 보았으나, 결과적으로 장 조직이 매우 뻣뻣해져 펼치기가 어렵다는 것을 발견했습니다.몇 차례의 실험 끝에, 독성이 적은 화학 물질을 사용하면서 장 조직의 스위스 롤(Swiss rolling) 작업을 훨씬 더 원활하게 수행할 수 있는 신속 고정법을 고안하였습니다. 이 수정된 고정액은 다른 두꺼운 조직을 빠르게 고정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 준비 단계로, 텍스트 프로토콜에 따라 실험 동물을 안락사시키고 수술 환경을 준비하십시오.먼저, 해부용 핀셋과 가위를 사용하여 마우스의 크기에 따라 흉곽에서 약 1~2cm 아래인 복부 중앙에 가로 절개를 넣습니다. 그런 다음 피부를 조심스럽게 벌리고 절개하여 복근이 드러나게 합니다. 다음으로, 장기를 잡거나 당기지 않도록 주의하며 복근을 잡고 위로 당깁니다.그 다음, 복근에 조심스럽게 초기 절개를 가하고 복근을 주의 깊게 절개하여 장을 노출시킵니다. 이제 결장을 확인하고 직장과 연결되는 말단 끝부분까지 추적합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 항문 입구에 최대한 가깝게 결장을 절단합니다.다음으로 위와 소장이 연결되는 부위를 찾아 가위를 사용하여 위에서 약 1cm 떨어진 지점에서 소장을 절단하십시오. 이제 분리된 소장과 결장의 전체 길이를 PBS가 담긴 깨끗한 페트리 접시에 옮기십시오. 그다음 결장의 원위단을 고정하고 결장의 전체 길이를 조심스럽게 펴면서 부착된 장간막 조직을 제거하십시오.그런 다음 맹장을 확인하고, 맹장과 결장이 연결되는 부위의 장을 절단하여 결장을 분리합니다. 마찬가지로 소장의 나머지 부분을 부착된 장간막 결합 조직 및 지방 조직으로부터 풀어냅니다. 그런 다음 소장이 맹장과 연결되는 부위를 절단합니다.그 후 맹장을 제거하여 폐기합니다. 이제 10 mL 주사기에 변형된 Bouin 고정액을 채우고 가바지(gavage) 바늘을 부착합니다. 장 분절의 앞쪽 개구부에 바늘을 약 0.5 cm 정도 삽입합니다.가바지 바늘을 분절 내부에 단단히 고정한 상태에서, 조직 내의 내용물을 고정액으로 천천히 씻어내십시오. 압력이 너무 높으면 분절이 터질 수 있으므로 주의하십시오. 소장이 너무 길어 다루기 어렵

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식수에서 실시 Dextran 황산 나트륨 (DSS)은 급성 대장염의 설립 murine 염증성 손상 모델입니다. 이 프로토콜은 DSS 치료와 조직의 준비를 위해 방법을 설명합니다.

Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

이 비디오에서는 간단한 장 절개 장치를 사용하여 쥐의 장을 전체적으로 준비하는 방법을 보여줍니다. 그 결과 마운트는 우수하고 균일한 품질을 가지며 조직학적 분석에 사용할 수 있습니다.

마우스 장의 전체 마운트 준비: 간단한 장 절개 장치를 사용하여 전체 마운트 준비

전체 마운트 준비를 신속하게 준비하기 위해 마우스 창자를 자르고 '굴리는' 간단한 장치를 사용하는 것이 설명되어 있습니다.

간단한 장치는 빠르게 마우스 소장의 전체 마운트를 준비하는 방법

장 상피 줄기 세포 (ISCS)는 Paneth 셀과 혼합된다. 이러한 세포 ISCS을 지원 항균 보호를 제공 ISC의 자손을 차별화한다. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 장 상피 세포를 유지하는데 중요한 역할을한다는 설정하는 형질 전환 조건부 마우스 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

장은 소화와 흡수에 매우 중요합니다. 십이지장, 제주눔, 회장, 결장 등 각 부위는 독특한 세포 구조로 인해 뚜렷한 기능을 수행합니다. 장 생리학을 연구하려면 세심한 조직 분석이 필요합니다. 이 프로토콜은 스위스 롤 기법을 사용한 조직 고정 및 처리를 간략하게 설명하며, 적절한 조직 보존 및 배향을 통해 정확한 면역염색을 보장합니다.

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

이 프로토콜은 원래 쥐 장을 위해 개발된 '스위스 롤' 기법을 수정한 전체 위 면역염색법을 개략적으로 설명합니다.

수정된 스위스 롤 기법을 이용한 생쥐 위근층의 향상된 공간 지도 작성

이것은 유리 micropipettes의 모양을 수정하는 가이드입니다. 특히, 열 및 공기 압력을 사용하여 테이퍼가 낮은 피펫 저항을 선도 팁 오프닝을 증가하지 않고 확대됩니다. 이것은 작은 세포의 낮은 소음 녹음을 얻는 것이 중요합니다하지만 많은 응용 프로그램에서 유용합니다.

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

우리는 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 성인 생쥐의 조직에 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 이 전략은 세포 수명이 긴 조직의 매상, 종양 발생 변형, 또는 교통 - 확장 세포를 감지하는 데 유용합니다.

기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

해부 기술은 유리체, 망막, 그리고 마우스 눈에서 렌즈, 원심 분리에 의해 분리하고, 단백질 as​​says과 특성화의 내장 적출을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

배우세요 개선된 스위스 압연 기술을 사용하여 생쥐 창자 조직을 효율적으로 처리하고 균일한 조직학적 염색을 달성하는 방법을. 이 기법은 독성이 낮은 화학물질을 사용하여 조직 처리의 안전성과 품질을 향상시킵니다.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

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