Name: 신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 뇌에 바이러스 입자와 형광 마이크로 비즈를 뇌실 및 혈관 내 주입하는 방법을. 이 기술은 중추신경계 급성 감염 단계에서 바이러스 분포를 직접 관찰하여 신경바이러스학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 Masaaki Kaneta 씨, Hiromi Suzuki 씨, Mitsue Kawashima 씨(하마마츠 대학 의과 대학 재생 및 감염 병리학과)에게 탁월한 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 일본 과학 진흥회, KAKENHI Grant Number 23590445의 지원을 받았습니다.

모든 실험 프로토콜은 의과 대학의 하마 마츠 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. MCMV (스미스 주) 및 재조합 1. 준비 M32이 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) -MCMV <ol><li> 등 이전에 8 설명 - (1.9 1.2) 다음과 같은 방법에 따라 재조합 M32-EGFP-MCMV 생성합니다. </li><li> 야생형 MCMV (: U68299 가입 번호)의 스미스 균주에서 유래 재조합 바이러스를 사용합니다. 삽입 EGFP (4361 염기쌍; BP) 37,089과 41,450 BP 사이 - 상동 재조합에 의해 MCMV의 게놈 (M32 M31의 궤적). </li><li> M32, 5&#39;- CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(정방향 프라이머), 5 : 중합 효소 연쇄 반응에 의해 MCMV M32 증폭 (41,450 - 오른쪽 아래의 프라이머를 사용하여 서열 유전자 좌위의 측면에, 39246 BP - 39286 BP 시퀀스 및 M31 (37,089의 측면에 남아 &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(역방향 프라이머); M31, 5&#39;- CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39;(정방향 프라이머), 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(역방향 프라이머). </li><li> 된 NheI과의 BamHI 제한 부위를 사용하여 EGFP 발현 벡터로 M32의 궤적을 삽입합니다. 를 AflII과를 XbaI 사이트를 사용하여 플라스미드 -recombinant M32-EGFP에 M31의 궤적을 삽입합니다. EGFP - - M32에서 된 NheI과를 AflII와 M31 시퀀스 - EGFP - M32 절단 M31 재조합 플라스미드와 H 2 O에 용해 </li><li> MCMV (스미스 균주)의 핵으로 절단 한 구조를 형질 감염은 상동 재조합을 유도하는 전기 시스템을 사용하는 NIH3T3 세포를 24 시간 후 감염 (HPI)를 -infected. </li><li> 삼일 후 감염, 감염된 세포의 EGFP 발현 초점을위한 여섯 웰 플레이트에 1 / 1,000의 비율과 화면에 감염되지 않은 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)와 공동 배양 세포에서. </li><li> Harve녹색 형광 초점을 포함하는 우물에서 성 바이러스 함유 상층 액과는 배로 희석. 정제를 들어, 하나의 녹색 형광 초점을 표시 우물을 선택합니다. </li><li> 모든 초점이 제한 희석 감염 디스플레이 EGFP 발현에 기인하는 경우, 바이러스 제제에는 야생형 바이러스가 남아 있는지 나타내는 순이다. 이전 17 바와 같이 플라크 분석 방법에 의해 바이러스를 정량화. </li><li> 장갑과 마스크를 착용 바이오 안전성 레벨 2에서 인증 바이오 안전성 캐비닛에 MCMV을 취급합니다. </li><li> 12 일 된 ICR 마우스 배아에서 준비 MEFs에의 통로 MCMV (스미스 주) 및 재조합 MCMV는 이전 17 설명했다. </li><li> 16 ° C에서 20 분 동안 3,000 × g에서 원심 분리하여 감염 MEF 문화의 상층 액에서 세포를 제거합니다. </li><li> 초 원심 분리기 70,000 × g에서 40 분 동안 상층 액. TBS 버퍼 1 ml의 비리 온을 함유하는 펠렛을 재현 탁하고, 미리 형성된 선형들에 전송할orbitol 구배 (25 % - 70 %). 60 분 18 초 원심 분리기 다시에서 70,000 × g으로. </li><li> 주사기와 비리 함유 밴드를 수확. 40 분 동안 70,000 × g에서 추가 초 원심 분리 단계에서 수확 비리 펠렛. </li><li> 감염 실험 전까지 -80 ° C에 인산 완충 용액 (PBS) 및 저장 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 이전 19 바와 같이 플라크 분석 방법에 의해 바이러스 역가를 정량화. </li><li> 형광 현미경 (도 1a) 및 투과 전자 현미경 (TEM) (8) (도 1B)에 의해, 입자 구조에 의해 (489 내지 508 nm에서의 방출에 여진) 재조합 MCMV 입자의 EGFP 발현 시각화. </li></ol> 나일 레드 형광 마이크로 비즈 2. 준비 <ol><li> 구매 카르 복실 형광 나일 레드 마이크로 비드 및 직경에 따라 튜브에 마이크로 비즈 500 μl를 배치 (0.04- 약 0.06 μm의, 3.63 × 10 (12) 입자; 0.1 - 약 5.75 × 10 (10) 입자 0.3 μm의; 및 1.7-2.2 μm의 약 6.85 × 10 7 입자). </li><li> 모든 독소를 제거하고 실온에서 멸균 물에 비드를 재현 탁 약 1 일 동안 0.1 M NaOH를 500 μl의 구슬을 취급합니다. </li><li> 사용하기 전에 실온에서 C57BL / 6 마​​우스에서 얻은 10 % 마우스 혈청 비드 O / N을 흡착. </li><li> 집계, 소용돌이 구슬을 분리하고 사용하기 전에 철저하게 초음파 처리합니다. </li></ol> 신생아 마우스로 MCMV 및 형광 마이크로 비즈의 3 ICV 주입 <ol><li> 12 시간 조명 / 어두운주기에 따라 온도 제어 설비의 정상적인 임신 한 ICR 마우스를 유지한다. 신생아는 출생의 날에 P 0.5로 지정되어 있습니다. </li><li> 10 μL 주사기와 70 % 알코올로 27 G 바늘을 소독. </li><li> MCMV 형광 마이크로 함유하는 주사액 (5 μL)을로드조심스럽게 주사기의 플런저를 당겨 바늘에 구슬. </li><li> 4 분 - 3 얼음에 마우스를 넣어 신생아 마우스 (P 0.5)을 억제. 동물이 마취되면 마취 깊이를 결정하기 위해 TOE 핀치 응답 방법을 사용한다. </li><li> 표 0.7 위치에서 비 독성 실험 펜 주사 부위 - 1.0 mm의 시상 봉합 0.7 측 방향 - 신생아 브레 그마 (도 2a)에서 1.0 mm의 꼬리. </li><li> 바늘에게 표시된 주사 부위의 두개골 표면에 수직 깊이 2mm를 삽입합니다. 참고로, 무독성 메이커 바늘의 선단으로부터 2mm를 표시한다. </li><li> 천천히 두피 (그림 2B)를 열지 않고 측면 뇌실에 MCMV (약 5 × 10 5 PFU)의 5 μl를 주입. </li><li> (- 약 5.75이 0.3㎛, 입자 × 108 0.1)에 의한 마우스의 다른 군에서는 형광 마이크로 비드를 함유하는 5 μL 용액을 주입동일한 방법. </li><li> 역류를 방지하기 위해 플런저 운동을 중단 한 후 20 초 - 천천히 바늘 (10)를 제거합니다. </li><li> 복구 5 쥐를 유지하기 위해 - 이동 및 일반 응답이 복원 될 때까지 따뜻한 용기에 10 분. </li><li> 시점 (3, 12, 24, 48, 72 시간) 후 분사의 범위에서 (5)에 기재된 바와 같이 뇌 수확. </li></ol> 신생아 마우스로 MCMV 또는 형광 마이크로 비즈 4. IV 주입 <ol><li> 4 분 - 3 얼음에 마우스를 넣어 신생아 마우스 (P 0.5)을 억제. </li><li> P에서 0.5 신생아를 MCMV의 정맥 주사를 수행하기 위해 35 G 바늘 1 ml의 주사기를 사용합니다. </li><li> 피상적 시간 (얼굴) 정맥을 시각화하기 위해 transilluminator가 (맥 파인더)를 사용합니다. 주입하기 전에 수술 테이프 (그림 2C)를 사용하여 transilluminator가에 신생아를 고정합니다. </li><li> (1.5 배)를 돋보기 안경을 착용하는 동안, 천천히 MCMV (약 5.45 × 50 μl를 주입; 10 9 입자) 또는 형광 마이크로 비드 (0.04 - 약 0.06 μm의, 3.63 × 10 (11) 입자 0.1 - 약 0.3 μm의, 5.75 × 10 9 입자 및 1.7-2.2 μm의 약 6.85 × 10 6 입자)가 표면 ​​시간적 정맥에 (그림 2D). </li><li> 바늘을 제거한 후 출혈이 중단 될 때까지 주입 부위에 압력을 70 % 에탄올을 함유하는 거즈를 사용한다. </li><li> 신생아에게 따뜻한 용기를 케이지에 반환하기 전에 복구하는 약 5 분을 제공합니다. </li><li> 시점 (3, 12, 24, 72 시간) 후 분사의 범위에서 (5)에 기재된 바와 같이 뇌 수확. </li></ol> 파라핀 섹션 5. 뇌 조직 샘플 준비 <ol><li> 짓 눌린 된 얼음에 작은 플라스틱 접시에 주입 된 신생아를 놓습니다. </li><li> 동물이 마취되면 anesthes의 깊이를 결정하기 위해 TOE 핀치 응답 방법을 사용아이오와. </li><li> 흉강을 열어 흉곽을 통해 하나의 중앙 또는 두 개의 끝 수평 최종 컷을 확인합니다. </li><li> 날카로운 가위로 중앙 홀에 상처를 확인합니다. 아트리움에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션을 달이다. 간 자발적인 움직임 (PFA 춤)과 경량화 색이 관찰 될 때 관류를 중지합니다. 에게서 피를 뽑다하지 마십시오. </li><li> 제 가위를 이용하여 헤드를 제거하여 (20 같이 이전에 설명) 신생아 해부. </li><li> 두개골을 노출하는 코, 목의 외피를 따라 중간 선 절개를합니다. </li><li> 신중 두개골의 내면을 따라 슬라이딩 한쪽 난원 매그넘로 홍채 가위의 날카로운 단부를 배치했다. </li><li> 후방 두개골 표면의 선단까지 연장 상처를 확인하고 반대쪽 측면에 동일한 상처를합니다. 소뇌 주위의 두개골을 멀리 취소합니다. </li><li> 조심 뇌 손상을 방지하기 위해 한쪽 두개골을 벗겨. 이 과정을 반복뇌의 반대편에 절차. </li><li> 주걱을 사용하여, 뇌의 복부 표면을 따라 후각 신경 전구 연결을 단절. </li><li> 부드럽게 아직 가위를 사용하여 두개골에 뇌를 연결하고 뇌를 제거하는 경질 트리밍, 머리에서 뇌를 분리합니다. </li><li> 4 % PFA 4 ° C에서 24 시간 동안 뇌의 10 배 이상 볼륨을 포함 정착의 유리 병에서 뇌를 놓습니다. </li><li> 물 변위 등급 에탄올 욕의 일련의 조직을 탈수하고 블록을 형성하는 파라핀 왁스 침투. 21 4 μm의 두께 조각으로 마이크로톰으로 파라핀 블록을 잘라. </li><li> Deparaffinize는 감염된 뇌 (22)의 슬라이드를 재수합니다. 파라핀 포함 된 섹션에 대한 현장 하이브리드에서 진행합니다. </li></ol> 냉동 섹션 6. 뇌 조직 샘플 준비 <ol><li> 5.1에 설명 된 단계에 따라 뇌를 제거 - 5.11. </li><li> 형광 마이크로 비드 및 M32-EGFP-MCMV을 관찰하기 위해 평평한 바닥 cryomolds에 절제 뇌를 놓습니다. 완전히 뇌 샘플을 커버하는 매체를 포함 추가합니다. 스냅 척에 부착하기 전에 cryomolds의 가장자리를 유지하는 집게를 사용하여, 예냉 N 헥산 (-80 ° C)에서 cryomolds 동결. </li><li> 절편의 경우, 미리 냉각 된 저온 유지 척에 고정 된 조직 블록을 연결합니다. 그라 이오 스탯 챔버로 척에 고정 된 조직을 전송하고 -10 내지 -20 ° C까지 온도를 낮추고, 약 8 조각 컷 - 23 10 μm의 두께를. </li><li> 분무 cytofixative (이소 프로필 알코올, 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물)와 섹션을 수정합니다. 공기는 즉시 살포 후 실온에서 30 분 동안 섹션을 건조하고, 그들을 저장 - 더 사용할 때까지 80 ºC. </li><li> 다시 RT에 대한 섹션을 평형과 PBS로 3 회 세척한다. </li><li> G를 π 공역 계 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)와 섹션을 얼룩1의 농도로 100 RT에서 PBS에 10 분 동안 (도 5) 또는 PE 공역 CD31 항체 : riffonia의 1의 농도로 B4 동종 렉틴 Simplicifolia의 100 RT에서 PBS에 30 분 동안 (도 6). </li><li> PBS로 3 회 섹션을 씻으십시오. </li><li> 세척 후, 세포 핵을 시각화 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 부분을 염색. , EGFP (489 nm에서 여기, 508 nm에서 방출) (345 nm의, 455 nm에서 방출에 여기) 안티 - 페이드 시약 및 이미지 DAPI의 섹션을 탑재하고, 나일 레드 (553 nm에서 여기, 637 nm에서 방출) 형광 현미경 (도 3, 5, 6). </li></ol> 파라핀 임베디드 섹션에 대한 현장 하이브리드 (FISH) 7. 형광 <ol><li> 전체 MCMV DNA 세대를 포함하는 박테리아 인공 염색체를 사용하여 닉 번역에 의해 현장 하이브리드의 DNA에 대한 형광 직접 표시된 FISH 프로브를 준비오메 (pSM3fr) 19. 물고기 프로브의 농도는 0.1 μg의 / μL이다. </li><li> Deparaffinize는 감염된 뇌 (22)의 슬라이드를 재수합니다. </li><li> 바이러스의 DNA를 검출 된 RNase (100 μg의 PBS / ㎖)로 조직 절편을 치료. </li><li> 20 분 동안 98 ° C - 0.05 %의 NP40, 95에서 0.01 M 구연산 완충액 (pH 6.0)으로 항원 검색을 수행합니다. 20 분 동안 RT까지 슬라이드 쿨. </li><li> 유리 코 플린 염색 항아리에서 2 분마다 순수한 물에 세 번 슬라이드를 씻는다. 0.06 %의 펩신, 37 ° C에서 5 분 동안 0.01 N HCl 용액과 추가 항원 검색 단계를 수행합니다. </li><li> 린스는 2 분 동안 유리 코 플린 염색 항아리마다 순수한 물에 세 번 슬라이드. </li><li> 85 % 에탄올로 한 후 100 % 에탄올, 70 % 에탄올로부터 슬라이드를 전송하여 다시 조직 절편을 탈수. </li><li> 혼성화 완충액 10 ㎖를 제조 원위치 혼성화 염 (3 M의 NaCl, 100 mM 트리스 1.25 ml에 섞어-HCl pH가 8.0, 5 ㎖ 탈 포름 아미드 100 mM의 인산 나트륨 pH가 6.8, 50 mM의 EDTA), 2.5 ml의 50 % 덱스 트란 설페이트, 250 ㎕의 50X 덴 하르트 용액, 125 μL의 100 ㎎ / ㎖의 tRNA 및 875 μL의 H 2 O. </li><li> 직접 혼성화 버퍼에 임의로 전체 MCMV 게놈 인식 형광 표지 한 DNA 프로브를 희석. 최종 부피는 10 μL (7 ㎕의 하이브리드 버퍼, 1 μL 프로브 (0.1 μg의 / μL), 2 ㎕의 증류수)해야한다. </li><li> 각 슬라이드에 프로브 믹스 (10 μl를) 추가 및 커버 슬립 (15 × 15mm)을 다룹니다. 고무 시멘트와 커버 슬립을 밀봉합니다. 85 ° C에서 5 분 동안 프로브 믹스 변성, 42 ℃에서 하이브리드 화 단계 O / N을 완료. </li><li> 2 분 동안 73 ° C에서 0.3 % NP40, 0.4 배의 SSC와 슬라이드를 씻으; 0.1 % NP40, 1 분 동안 73 ° C에서 0.4 배의 SSC와; 및 2 배 SSC와 두 번. </li><li> DAPI (10 NG / ㎖)로 커버 슬립을 슬라이드 커버 핵 Counterstain과. </li><li> 산형광 현미경 (그림 4) 안티 - 페이드 시약 및 이미지 DAPI (345 nm에서 여기, 455 nm에서 방출) 및 EGFP (489 nm에서 여기, 508 nm에서 방출)의 섹션. </li></ol>

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동물 모델, ICV, 복강 내, 직접 태반 및 IV 감염에 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다. 우리는 절차의 간략화와 목표 영역에 입자를 직접 주입의 이익을 위해 신생 마우스의 ICV 및 IV 주입 모델에 초점을 맞추었다. 복강 내 감염 쉬운 방법이지만, 바이러스 입자는 간접 공정 5, 24을 통해 체계적으로 확산. 직접 태반 감염은 배아 전신 감염을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 그러나,이 방법은 안정된 결과를 얻을 특별한 훈련이 필요하며 낮은 성공 확률을 가지고있다. 감염 방법은 태반을 통해 간접 방법이며, 각 시험 6에서 태아에 주입 양을 제어하기 어렵다. 신생아 마우스는 CMV 등 바이러스에 매우 민감하기 때문에,이 연구에서 우리는 초기의 PHA의 바이러스 입자의 분포와 감염된 세포의 그것과 비교할 수감염의 전자. IV를 감염 모델이 BBB과 바이러스의 상호 작용을 포함하여 천연 감염을 닮은 전신 감염 모델 반면 ICV 주사 모델은 BBB (25)...

바이러스 성 뇌염을 연구 할 때, 바이러스 입자의 초기 분포 질환 발병 기전을 이해하고 뇌에서 바이러스 타겟을 식별하는 것이 매우 중요하다. Pandoravirus 크기가 1에서 700 개 이상의 나노가 있지만 대부분의 바이러스는 20 ~ 300 nm의에서 크기가 다양합니다. 감염의 급성 단계에서 바이러스 입자의 분포는 입자의 크기, 세포 수용체의 분포, 또는 바이러스에 대한 세포 수용체의 친화력에 의존 할 수있다. 동물 모델, 뇌실 (ICV), 복강 내, 직접 태반, 정맥은 (IV) 감염은 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다합니다. ICV 바이러스 접종은 종종 마우스에서 중추 신경계 (CNS) 감염을 확립하기 위해 사용된다. 이 기술을 사용하여 연구는 특히 뇌실 주위 영역의 셀 및 뇌척수액 (CSF), simila 직접 접촉 뇌의 영역에서 광범위하게 감염 신고바이러스 ventriculoencephalitis의 효과에 대한 연구. 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 입자의 작은 크기 (20 - 25 nm의 직경)을 ICV 감염 2-4 뇌 전반에 걸쳐 그 보급을 용이하게한다. 복강 5, 직접 태반 6, IV 주사 7 hematogenic 전신 투여를 나타냅니다. 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)을 통해 바이러스 입자의 침투들이 확산 소교 노쥴 8,9 나타내는 신생아의 뇌 실질에 도달 할 수있다. 거대 세포 바이러스 (CMV)는 헤르페스 바이러스 제품군에 속하는 흔한 바이러스입니다. 미국에서는 50 % - 국민의 80 %가 40 CMV 감염이 거의 유해하지만 면역 환자와 태아의 질병을 일으킬 수 있습니다 나이 CMV 감염이 있었다. 모든 배달 중 0.2 % - 2 %는 같은 소두증, 뇌실 주위 석회화, 소뇌 형성 부전, MICR 등의 심각한 증상을 초래, CMV (10)에 태어난안염, 및 시신경 위축 (11, 12). 또한, 정신 지체, 감각 신경성 난청, 시각 결함, 발작, 간질 비 치명적 CMV에 감염된 유아 13, 14의 약 10 %에서 발생한다. CNS 장애는 CMV 선천성 기형의 가장 흔한 특징적인 증상입니다. 더 많은 아이들이 영구적으로 다운 증후군, 태아 알코올 증후군, 또는 척추 피열 (15)보다는 선천성 CMV 매년 비활성화됩니다. 안전하고 효과적인 백신의 필요성을 요구, 본에서 CMV에 대한 어떤 예방 접종을 사용할 수 있습니다. 감염의 초기 단계에서 그 수용체와 CMV 입자의 상호 작용을 공부 백신의 효과를 이해하는 것이 중요하다. Ventriculoencephalitis 및 확산 소교 결절은 CMV의 두 가지 주요 병리학 적 특성이 16 뇌염 있습니다. (- 300 내지 150 nm) 감염 (a)의 급성기에 뇌를 통해 확산 CMV 입자가 어떻게 불확실하고있다차 방법 세포 수용체의 분포 및 바이러스에 대한 자신의 친 화성이 바이러스 확산에 기여한다. 가와사키 외. ICV는 입자 및 감염의 초기 단계에서의 수용체 (β1 인테그린)의 분포의 관점에서 IV 감염을 평가했다. 우리는 CMV 입자와 β1의 인테그린의 발현의 보급이 잘 ICV 및 IV 감염 (8) 모두에서 감염의 초기 단계에 상관 관계가 있음을 발견했다. ICV 감염 ventriculoencephalitis의 모델 및 IV 감염 확산 소교 노쥴의 모델이다. 바이러스 또는 형광 입자의 역학을 공부하는 것은 입자 크기, 세포 수용체와 바이러스의 상호 작용, 뇌에 BBB 침투의 메커니즘의 효과에 대한 유용한 정보를 제공 할 것입니다. 다음 프로토콜은 CNS 어떤 바이러스 감염 및 바이러스 벡터를 조사하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>트리스; 트리스(하이드록시메틸)- 아미노메탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 벡터&nbsp;</td><td>클론텍</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM 형광 폴리스티렌 나일 레드 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM 형광 폴리스티렌 나일 레드 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM 형광 폴리스티렌 나일 레드 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% 마우스 혈청</td><td>DAKO&nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICR 마우스</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수정 마이크로 리터 주사기 (7000 시리즈)</td> <td>해밀턴 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 게이지 바늘</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>필립스 헬스케어</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>사쿠라 파인텍</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>시그마-알드리치</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>구연산염 완충액(pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>펩신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>도진도</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 황산염 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt's 용액 (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA (10 mg/ml)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>, ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glass</td><td>, ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>일본 쇼지 주식회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 Vector laboratories, Inc. (FITC-접합 그리포니아 심플리시폴리아 이소렉틴 B4</td><td>Vector laboratories, Inc.)</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&nbsp; 골드</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

바이러스 성 뇌염의 발병 기전에 대한 연구에서, 감염 방법이 중요하다. 뇌의 두 가지 경로 감염성의 첫 번째는 내피 세포 및 뇌 혈관 주위 세포의 감염을 포함 혈행 경로이다. 두 번째는 뇌 실내 (ICV) 경로이다. 일단 중추 신경계 (CNS) 내의 바이러스는 뇌척수액을 통해 거미 막밑 공간 수막 및 맥락총에 퍼져있다. 실험 모델에서, CNS 바이러스 분포의 초기 단계에있어서 잘되지 않으며, 이는 특정 셀은 초기 감염 불분명하다. 여기서, 우리는 감염의 급성 단계에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 입자의 분포를 분석 한 신생아 마우스의 뇌에 ICV 또는 혈관 내 (IV) 주입에 이어 바이러스 혈증 차 불린다. ICV 주사 모델에서, 쥐 CMV (MCMV) 또는 형광 마이크로 비드 5 μL은 midpoi의 뇌실 주입했다NT를 27 G 바늘 10 μL 주사기를 사용하여 귀와 눈 사이. IV를 주입 모델에서 35 G 바늘을 1 mL를 주사기를 사용 하였다. transilluminator가이 신생 마우스의 표면 시간적 (얼굴) 혈관을 시각화 하였다. 우리는 표면 시간적 정맥에 MCMV 또는 형광 마이크로 비즈의 50 μl를 주입. 뇌는 서로 다른 시간 지점 포스트 분사에 수확 하였다. MCMV 게놈은 현장 하이브리드 방식의를 사용하여 검출되었다. 재조합 MCMV 입자를 발현하는 형광 마이크로 비드 또는 녹색 형광 단백질의 형광 현미경으로 관찰 하였다. 이러한 기술 뇌염의 발병 기전을 조사하기 위해 많은 다른 병원균에 적용될 수있다.

바이러스 성 뇌염의 발병 기전에 대한 연구에서, 감염 방법이 중요하다. ICV 경로는 급성 감염, 지주막 하 공간을 통해 CSF를 통해 확산 수막 및 맥락막 얼기에 도달 나타내는 반면, 혈행 경로, 내피 세포와 뇌의 혈관 주위 세포의 급성 감염을 나타냅니다. MCMV 게놈 및 M32-EGFP-MCMV 입자 또는 형광 마이크로 비드의 직접 관찰을 검출 계내 혼성화 급성 뇌염 입자의 1 분포를 분석하는 데 사용 하였다. 재조합 MCMV의 생성 (M32-EGFP-MCMV) 이 프로토콜은 M32-GFP-MCMV가 생성 된 방법 재조합을 보여줍니다. EGFP는 상동 재조합에 의해 MCMV 게놈에서 ...

여기에서는 바이러스 입자 또는 형광 마이크로비즈를 신생아 쥐의 뇌에 뇌내실 및 혈관 내 주입하는 간단한 방법을 설명합니다. 바이러스와 나노 입자의 국소화 패턴은 현미경 평가 또는 현장 혼성화에 의해 검출될 수 있습니다.

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 중추신경계 감염의 급성기 동안 바이러스 입자의 분포를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신경바이러스학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 급성 감염 단계 동안 미성숙한 중추신경계에서 바이러스 입자가 어떻게 분포하는지 등을 확인할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 두 가지 간단한 방법, 즉 뇌실 내 주입 및 혈관 내 주입을 통해 바이러스 입자의 초기 분포를 현미경으로 직접 관찰할 수 있다는 점입니다. 먼저 70% alcohol로 10 µL 주사기와 27 gauge 바늘을 멸균하십시오.그 다음, 시린지의 플런저를 조심스럽게 당겨 5 µL의 마우스 거대세포바이러스(murine cytomegalovirus) 주입 용액 또는 형광 마이크로비즈를 바늘에 채웁니다. P0.5 신생 마우스를 얼음 위에 3~4분 동안 두어 마취 및 고정시킨 후, 발가락 꼬집기 반응법(toe pinch response method)을 사용하여 마취 깊이를 결정합니다. 마취된 마우스의 주입 부위를 독성이 없는 실험용 펜으로 표시하는데, 위치는 시상봉합(sagittal suture)에서 외측으로 약 0.7~1.0 mm, 신생 마우스의 브레그마(bregma)에서 약 0.7~1.0 mm 떨어진 지점으로 합니다.이 도식은 해당 부위를 더 자세히 보여줍니다. 참조를 위해, 바늘 끝에서 2 mm 지점을 독성이 없는 마커로 표시하십시오. 그 다음, 표시한 주입 부위의 두개골 표면에 수직이 되도록 바늘을 2 mm 깊이로 삽입하십시오.그런 다음 두피를 절개하지 않고 마우스 뇌실 외측에 murine cytomegalovirus 5 µL를 천천히 주입합니다. 다른 마우스 그룹에는 동일한 방법으로 형광 마이크로비즈가 포함된 5 µL 용액을 주입합니다. 주입 후에는 역류를 방지하기 위해 바늘을 10~20초 동안 그대로 둡니다.그 다음 바늘을 천천히 제거합니다. 주입된 동물들이 따뜻한 용기 안에서 움직임과 전반적인 반응성이 회복될 때까지 5~10분 동안 회복하도록 합니다. 정맥 주사를 위해서는 마취된 신생물을 수술용 테이프로 투과 조명기에 고정한 다음, 표재측두정맥을 시각화합니다.다음으로, 1.5배 확대경을 착용한 상태에서 35게이지 바늘이 장착된 1 ml 주사기를 사용하여 murine cytomegalovirus virus 50 µL를 표재측두정맥에 천천히 주입합니다. 대조군에서도 적절한 크기의 형광 마이크로비드를 사용하여 동일한 절차를 반복합니다. 바늘을 제거한 후 70% 알코올을 적신 거즈로 주사 부위를 압박하여 출혈이 멈출 때까지 지혈합니다.신생아를 따뜻한 용기에 넣고 약 5분 동안 회복시킨 후 케이지로 되돌립니다. 급성 감염 단계에서 뇌실 내 주입 후 2시간이 지나면, 화살표로 표시되고 확대된 영역에서 볼 수 있듯이 녹색 재조합 M32 EGFP MCMV 입자가 주로 주변부 영역에서 관찰됩니다. 이 시점에서 M32 EGFP MCMV 입자는 맥락총과 뇌실하대에서도 관찰됩니다.MCMV 게놈은 뇌실 내 주입 3시간 후 뇌실하구역에서 처음으로 검출됩니다. 형광 및 C2 하이브리다이제를 사용하여 MCMV 게놈을 녹색 점으로 확인할 수 있으며, 이 확대된 영역에서 화살표로 표시되어 있습니다. 정맥 주입 3시간 후에는 이 고배율 이미지에서 보여주듯, 녹색 점으로 나타나며 화살표로 표시된 MCMV 입자들이 실질의 혈관 영역 내부와 외부에서 발견됩니다.이 시점에서도 MCMV 입자들은 맥락총과 뇌실하대에서 여전히 관찰됩니다. 형광 및 C2 하이브리드법을 사용하여, IV 주사 후 12시간에 혈관 영역과 뇌막에서 MCMV 게놈이 검출됩니다. 화살표로 표시된 바와 같습니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 5분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 중추신경계 감염의 급성기 동안 바이러스 입자의 분포를 관찰하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 마스크와 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

intracerebroventricular-intravascular-injection-viral-particles

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 시각 피질의 뉴런과 glia의 형광 라벨에 대한 AAV 벡터의 intracranial 주사를 제시한다.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

신생아 생쥐의 중추 신경계에 치료 요원들을 소개하는 뇌 (intracerebroventricular)와 (정맥 주사) 2) 체계로 : 1)이 문서 분사의 두 가지 방법을 보여줍니다.

마우스에 Intracerebroventricular을 통해 치료 대리점 납품 (ICV)과 정맥 (IV) 사출

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

이 비디오는 신생아 마우스 뇌에서 쥐 거대세포바이러스(MCMV) 분포를 연구하기 위한 뇌내폐 주사 과정을 보여줍니다. 가시성을 위해 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하도록 설계된 MCMV는 새끼 쥐의 뇌 외측심실에 주입됩니다. 주입된 바이러스는 뇌척수액을 통해 순환하여 가장자리 영역, 맥락막 신경총 및 심실하 영역을 포함한 뇌실 주위 영역의 세포를 감염시킵니다.

신생아 마우스 뇌에서 쥐 사이토메갈로바이러스 분포를 분석하기 위한 뇌실 내 주사

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의...

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.

신생아 마우스의 정맥 주사

여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

Zika 바이러스 유도 신경 장애 Intracerebral 주입 전략을 사용 하 여 마우스 모델을 수립: 배아, 신생아, 및 성인

이 프로토콜은 신생아 기간 동안 쥐와 생쥐에서 사용할 수 있는 재현 가능한 정맥 투여 경로를 입증하는 것을 목표로 합니다. 이 절차는 주로 정맥 투여를 사용하는 신생아 치료실에서 약물 투여를 미러링하고자 하는 전임상 설치류 연구에 중요합니다.

후안와 정맥 주입의 신생아 설치류 모델

본 프로토콜은 유전자 편집 및 약물 전달을 위해 신생아 마우스에서 척수강내 주사를 수행하기 위한 단계별 지침을 설명합니다.

게놈 편집 및 약물 전달을 위한 신생아 마우스의 척수강내 주사

지주막하 바이러스 주입을 사용하는 아데노 관련 바이러스의 광범위한 전달을 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 이 방법은 표재층에서 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장할 뿐만 아니라 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 5층 피라미드 뉴런에서 전이유전자의 선택적 발현을 초래합니다.

AAV2의 지주막하 주입에 의한 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입

배우세요 신생아 마우스 뇌에 바이러스 입자와 형광 마이크로 비즈를 뇌실 및 혈관 내 주입하는 방법을. 이 기술은 중추신경계 급성 감염 단계에서 바이러스 분포를 직접 관찰하여 신경바이러스학 연구에 활용할 수 있습니다.

신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

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