Name: 의 하위 유형 캄 필로 박터 jejuni와 SSP. doylei은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 질량 분석 기반 PhyloProteomics(MSPP)를 사용하여 Campylobacter jejuni ssp. doylei를 균주 수준에서 하위 유형화하는 방법을. 이 기법은 MLST보다 빠르고 비용 효율적이며 역학 연구에 적용 가능합니다.

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탁월한 기술 지원을 제공해 주신 Hannah Kleinschmidt에게 감사드립니다. 이 논문은 Deutsche Forschungsgemeinschaft의 오픈 액세스 지원 프로그램과 괴팅겐 게오르그 아우구스트 대학의 출판 기금의 지원을 받았습니다.

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MSPP 방식의 설립에서 가장 중요한 단계는 바이오 마커 이온 정체성의 명확한 유전 적 결정이다. 그것은 틀림없이 바이오 마커를 식별 할 수 없다면, 이것은 반응식 13에서 제외한다. C. jejuni와의 SSP. doylei 방식은 14 개 바이오 마커 이온을 포함한다. 이 5 이하 C. 비교입니다 검출 가능한 C. 사이 jejuni와의 SSP. jejuni와 MSPP 방식 (13) 국지적 가장 큰 차이 jejuni와 SSP. jejuni와와 C. jejuni와의 SSP. doylei 바이오 마커는 L31 (-M) 및 L35 (-M) (13)의 경우에는 아미노 - 말단 메티오닌의 번역 후 제거했다. ...

지난 십년 동안, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 질량 분석계 (MALDI-TOF MS)가 임상 미생물학 1,2 미생물 속과 종의 식별을위한 높은 값의 표준 방법으로 진행 하였다. 종 식별은 그대로 세포 또는 세포 용 해물의 작은 단백질 지문의 기록에 기초한다. 일상적인 임상 미생물에서 사용되는 질량 분석 장치의 일반적인 질량 범위는 2-20 kDa 이상이다. 또한, 결과적인 스펙트럼은 다음 종의 균주 및 아종 이하 레벨 3을 구별하는데 사용될 수있다. 초기 선구적인 연구는 캄 필로 박터 jejuni와 4 균주의 특정 하위 그룹, 클로스 트리 디움 디피 5, 살모넬라 엔테 SSP에 대한 특정 바이오 마커 이온을 확인했다. 엔테의 혈청 형 Typhi (6), 황색 포도상 구균 7-9, 및 E12 - scherichia 10 대장균. 대립 유전자 아형에 해당하는 여러 변수 바이오 마커 대중의 조합은 더 깊은 하위 유형에 대한 옵션을 제공합니다. 이전에, 우리는 성공적으로 C.에 질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)라는 의미와 재현 phyloproteomic 관계로 대량 프로필에서 이러한 변화를 변환하는 방법을 구현 jejuni와의 SSP. jejuni와 격리 컬렉션 13. MSPP는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)과 같은 DNA 서열을 기초 subtyping이 기술에 질량 분석 당량 사용할 수있다. 캄 필로 박터 종은 세균성 위장염의 주요 원인 전세계 14, 15이다. 캄 필로 박터 감염 후 후유증의 결과, 즉, 길랑 바레 증후군, 반응성 관절염 및 염증성 장 질환 (16)를 발생할 수있다. 감염의 주요 소스는닭, 칠면조, 돼지, 소, 양, 오리, 우유, 표면의 물 (15), (17)로부터 오염 된 가축의 고기. 따라서, 식품 안전의 맥락에서 일정한 역학 감시 연구가 필요하다. MLST는 캄 필로 박터 종 (18)에 대한 분자 입력의 &quot;황금 표준&quot;입니다. MLST 방법을 기반으로 생거 시퀀싱은 노동 집약적, 시간과 상대적으로 고가이기 때문에, MLST 입력은 상대적으로 작은 분리 집단에 제한됩니다. 따라서, 저렴하고 빠른 하위 유형의 방법이 필요하다. 이 필요 MSPP 같은 질량 분석 방법에 의해 충족 될 수있다. 이 논문은 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 컬렉션을 사용하여 MSPP-입력에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. doylei 분리 및 MLST와 잠재력의 비교.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex III TOF/TOF 200 system</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>GT02554 G201</td><td>질량분석기</td></tr><tr><td>세균 검사 표준 BTS</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>263564</td><td>소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>8290190</td><td>5개의 튜브</td></tr><tr><td>캄필로박터 jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>벨기에 미생물 조정 수집/미생물학 연구소 UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141년; NCTC 11951년; 균주 093</td></tr><tr><td>캄필로박터 jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>벨기에 미생물 공동 수집/미생물학 연구소 UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>벨기에 미생물 조정 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; 카스퍼 71; 경기관총 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>캄필로박터 jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>벨기에 미생물 공동 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>벨기에 조정 미생물 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603 / 87</td></tr> <tr><td> Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>벨기에 조정 미생물 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni< > subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>벨기에 조정 미생물 수집 / 미생물학 연구소 UGent BCCM / LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613 / 87</td></tr><tr><td>Columbia 한천 기지&nbsp;</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics용</td> 나침반 <td>251419</td><td>소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>탈분된 양 피&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>02854 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>formic acid</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HCCA matrix</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes paper tissue</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>259935</td><td>소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>Mast Cryobank 바이알</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, 독일</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 광택 스틸 타겟</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 인슐린</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>물, 분자생물학 등급</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 phyloproteomics를 사용하여 분리 (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS는 종 및 아종 수준 그러나 심지어 아래 균주 수준에서뿐만 아니라 일부 박테리아를 차별화 할 수있는 가능성을 제공한다. 검출 가능한 바이오 마커의 대립 이온 이성체 분리는 특정 질량 변화 될. 질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)를 참조 균주 염기 서열을 게놈에 비해 분리 특정 질량 변화에서 phyloproteomic 관계의 공제를 허용하는 방식으로 질량 분석 검출 바이오 마커의 질량을 결합하는 새로운 기술이다. 추론 된 아미노산 서열은 MSPP 기반 dendrograms을 계산하는 데 사용된다. 여기서 우리는 캄 필로 박터 jejuni와의 SSP를 입력하여 MSPP의 흐름을 설명합니다. 일곱 균주의 분리 수집을 doylei. 모든 일곱 균주는 유전 적 다양성을 보여 인간의 기원과 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)의했다. MSPP-입력 충분히 자신의 PHY를 반영 일곱 가지 MSPP 시퀀스 유형의 결과logenetic 관계. C. jejuni와는 SSP. MSPP 방식은 2 ~ 11 kDa의 질량 범위에서 14 개 바이오 마커 이온, 주로 리보솜 단백질을 포함 doylei. MSPP 원칙적으로, 확장 된 질량 범위와 다른 질량 분석 플랫폼에 적용 할 수있다. 따라서,이 기술은 변형 된 미생물 레벨 입력을위한 유용한 도구가 될 가능성이있다.

이전에, 우리는 성공적으로 C.에 대한 MSPP 체계를 확립 jejuni와의 SSP. 13 jejuni와. 여기서, 우리는 C. 형제를 아종하는 방법을 확장하는 목적 jejuni와의 SSP. doylei. 이 특정 설정에서 일곱 C. jejuni와의 SSP. doylei 분리는 / 연구소 미생물학 UGent BCCM / LMG 겐트, 벨기에의 미생물의 벨기에 컬렉션에서 획득 하였다. 우리의 분석에 사용 된 모든 일곱 분리는 인간의 기원이었다. 설사가 기준으로 봉사와 게놈 염기 서열을 변형 ATCC 49349 (8843 LMG)는 원래 2 세의 호주 아이의 대변에서 분리. LMG 9143, LMG 9243 및 LMG 9255 어린이 설사 고통과 벨기에 브뤼셀에 살고의 대변에서 분리; 컬렉션에서 여섯 추가 균주를 사용할 수 있...

질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다.

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

MSPP 또는 질량 분석 기반 계통 단백질체학(Mass Spectrometry-based PhyloProteomics)이라고 불리는 이 질량 분석법의 전반적인 목표는 박테리아를 균주 수준에서 아형 분류(sub-type)하는 것입니다. 이 방법은 미생물학, 역학 및 위생학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 계통 단백질체적 연관성을 시각화하여 집단 감염 상황을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.다른 타이핑 방법과 비교했을 때, MSPP는 샘플당 비용이 저렴하고 속도가 매우 빠릅니다. 병원 내 감염은 점점 더 중요해지는 문제이며, 본 연구의 MSPP 체계가 다른 박테리아나 심지어 진균의 역학적 타이핑까지 확장될 수 있기를 기대합니다. 본 MSPP 체계는 균주 간의 연관성에 대한 통찰력을 제공하므로, 약물 내성이나 독성과 같은 관련 표현형이 특정 유전형과 상관관계를 갖는 경우, 이를 적용하여 해당 표현형을 예측하는 것이 타당합니다.이 절차를 시작하려면, 250 µL의 유기 용매 혼합물(50% isonitrile, 47.5% 이중 증류수 및 2.5% trifluoroacetic acid)에 2.5 mg의 HCCA를 녹여 두 개의 매트릭스 용액 튜브를 준비합니다. 그중 하나에 내부 보정제로 재조합 인간 인슐린을 첨가합니다. 다음으로, 표준 균주의 콜로니를 핀헤드 크기만큼 MALDI 타겟 플레이트에 직접 도포합니다.교정 피크의 정확한 질량을 결정하기 위해, 다른 지점에 테스트 표준물을 1 µL 도포합니다. 박테리아와 표준물이 도포된 각 지점에 HCCA가 첨가된 매트릭스 용액 1 µL를 덮고 실온에서 결정화될 때까지 둡니다. 분석하려는 각 균주에 대해 도말 표본 준비 과정을 반복합니다.각 스폿 위에 1 µL의 스파이킹된 HCCA 매트릭스 용액을 도포하고 실온에서 결정화되도록 둡니다. 또는, 부착이 어려운 세포에서 단백질을 추출할 수 있습니다. 이를 위해 접종 루프를 사용하여 아가 플레이트 배양물에서 약 5개의 콜로니를 수확합니다.이들을 1.5 milliliter 반응 튜브 내의 300 microliters 2중 증류수에 현탁시키고, 박테리아 콜로니가 완전히 현탁될 때까지 반복적으로 피펫팅하여 충분히 혼합합니다. 그런 다음 900 microliters의 절대 에탄올을 넣고 혼합합니다. 샘플을 13, 000 g's에서 1분 동안 원심 분리합니다.펠렛을 건조시킨 후, 50 µL의 70% formic a

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질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

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우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

캄필로박터의 대변 문화는 부정확하지만, 여전히 식별의 금본위제로 간주됩니다. 인간 대변에서 C. jejuni의 수송 매체에서 검출 및 생존의 한계를 결정하는 방법은 더 나은 정확도로 새로운 면역 분석과 비교하여 기술된다.

인간 배설물 표본에서 캄필로박터 제주니의 수송매체에서 검출과 생존의 한계를 결정하는 문화방법

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

벤치탑 기기를 사용한 전체 게놈 시퀀싱(WGS) 전략의 실현 가능성은 실험실 환경에서 공중 보건과 관련된 모든 미생물의 게놈 조사를 단순화했습니다. 박테리아 WGS에 대한 워크 플로우의 방법 론적 적응이 설명되고 분석을위한 생물 정보학 파이프 라인도 제시됩니다.

전체 게놈 시퀀싱을 사용하는 Oreochromis spp. 농장에서 파생된 병원성 대장균 균주의 특성 분석

캄필로박터는 전 세계적으로 세균성 식인성 위장염의 주요 원인입니다. 시설에서 시설 전체의 유병률을 줄이기 위한 조치를 취하고 있음에도 불구하고 오염된 제품은 지속적으로 소비자에게 도달합니다. 지난 12년 동안 개발된 이 기술은 날고기에서 캄필로박터 종(Campylobacter spp.)을 분리하고 검출하는 기존 방법의 한계를 해결합니다.

Campylobacter spp.의 검출 및 분리 날고기

이 프로토콜은 배양체학과 MALDI-TOF MS를 결합하여 유제품의 미생물 구성을 신속하고 비용 효율적으로 평가할 수 있습니다. 기존 배양 방법보다 짧은 처리 시간으로 16S rRNA 시퀀싱에 필적하는 분류 결과를 제공합니다.

MALDI 접근법 을 통한 박테리아 단백질체학 프로파일링을 이용한 낙농장의 미생물 안전성 평가

학습하세요 질량 분석 기반 PhyloProteomics(MSPP)를 사용하여 Campylobacter jejuni ssp. doylei를 균주 수준에서 하위 유형화하는 방법을. 이 기법은 MLST보다 빠르고 비용 효율적이며 역학 연구에 적용 가능합니다.

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