의 하위 유형 캄 필로 박터 jejuni와 SSP. doylei은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

MSPP 또는 질량 분석 기반 PhyloProteomics라고 하는 이 질량 분석 절차의 전반적인 목표는 균주 수준에서 박테리아를 아형으로 분류하는 것입니다. 이 방법은 미생물학, 역학 및 위생 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 계통 원생 관련성을 시각화하여 발병 상황을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

다른 입력 방법에 비해 MSPP는 샘플당 저렴하고 매우 빠릅니다. 원내 감염은 점점 더 중요해지고 있는 문제이며, 우리는 MSPP 계획이 다른 박테리아 또는 곰팡이의 역학적 유형화로 확장될 수 있기를 희망합니다. 당사의 MSPP 체계는 균주의 관련성에 대한 통찰력을 제공하므로 약물 내성 또는 독성과 같은 관련 표현형을 예측하기 위해 이러한 표현형이 특정 유전자형과 상관관계가 있는 곳에 적용하는 것이 합리적입니다.

이 절차를 시작하려면 2.5mg의 HCCA를 250마이크로리터의 유기 용매 혼합물인 50% 이소니트릴에 용해시켜 두 개의 매트릭스 용액 튜브를 준비합니다. 그 중 하나에 내부 보정으로 재조합 인간 인슐린을 추가한 다음 47.5%의 이중 증류수와 2.5%의 트리플루오로아세트산을 추가합니다. 다음으로, 기준 균주에서 핀 머리 크기의 콜로니를 maldi 타겟 플레이트에 직접 펴 놓습니다.

교정 피크의 정확한 질량을 측정하려면 테스트 표준의 마이크로리터를 다른 지점에 놓습니다. 박테리아와 표준물질의 각 지점에 1마이크로리터의 HCCA 스파이크 매트릭스 용액을 오버레이하고 실온에서 결정화되도록 둡니다. 분석할 각 균주에 대해 도말 준비를 반복합니다.

각 스폿에 1마이크로리터의 스파이크 HCCA 매트릭스 용액을 바르고 실온에서 결정화되도록 둡니다. 대안적으로, 단백질은 거짓말하기 어려운 세포에서 추출될 수 있다. 이를 위해 접종 루프를 사용하여 Agar plate culture에서 약 5개의 콜로니를 수확합니다.

1.5 밀리리터 반응 튜브에 300 마이크로 리터의 이중 증류수에 현탁시키고 박테리아 집락이 완전히 현탁 될 때까지 반복 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 그런 다음 900 마이크로 리터의 절대 에탄올을 넣고 섞습니다. 샘플을 13, 000g에서 1분 동안 원심분리합니다.

펠릿을 건조시킨 후 50%포름산 50마이크로리터에 위아래로 피펫팅하여 다시 매달립니다. 그런 다음 50마이크로리터의 아세토-니트릴을 넣고 섞습니다. 13, 000g에서 2분 동안 원심분리로 파편을 제거합니다.

완료되면 1마이크로리터의 supernamed를 maldi 타겟 플레이트의 샘플 위치로 옮깁니다. 샘플을 건조시킨 후 각 지점을 1마이크로리터의 HCCA 매트릭스 용액으로 덮고 실온에서 결정화되도록 둡니다. 이 시점에서 각 스폿에 대해 100개의 샷 단계로 600개의 스펙트럼을 수집하여 MALDI-TOF 분석을 수행합니다.

먼저 질량분석기의 구성 소프트웨어에서 자동 실행 탭을 클릭합니다. 방법 버튼을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 풀다운 메뉴에서 방법을 선택하여 방법을 엽니다. 그런 다음 편집 버튼을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 자동 실행 메소드 편집기를 엽니다.

누적 탭에서 만족스러운 샷 값을 100으로 설정하고 합계 값을 600으로 설정합니다. 각 스펙트럼에 대해 목록에서 캘리브런트 피크를 선택하고 자동 할당을 클릭한 다음 OK를 누릅니다.각 스폿에서 질량 스펙트럼을 얻은 후 스펙트럼 브라우저로 스펙트럼을 열고 캘리브런트가 없는 스펙트럼과 비교하여 예상 질량에서 피크를 찾아 보정 피크의 정확한 질량을 실험적으로 결정합니다. calibrant 피크가 관심 유기체의 다른 바이오마커에 의해 가려지지 않는지 확인합니다.

참조 균주의 게놈 염기서열 분석 데이터에서 DNA 염기서열을 해당 아미노산 염기서열로 변환하여 암호화된 각 단백질의 이론적 단일 동위원소 분자량을 계산합니다. 이 단백질 염기서열을 해당 생물정보학 리소스 패널의 입력 상자에 업로드하거나 복사하여 붙여넣고 이론적인 등전점과 분자량을 계산합니다. 결과를 스프레드시트에 복사하고 한 열에는 유전자 식별자가 포함되고 다른 열에는 분자량이 포함됩니다.

질량을 쉽게 찾을 수 있도록 계산된 분자량을 기준으로 행을 정렬합니다. demathianinated 형태의 분자량에 대한 스프레드시트에 추가 열을 삽입하여 mono isotopic 분자량에서 135 dautons를 뺍니다. 게놈 표에서 측정된 질량을 조회하여 측정된 각 주요 바이오마커 질량을 기준 균주에서 계산된 질량에 할당합니다.

다른 스프레드시트에서 각 바이오마커 이온의 질량과 식별자를 기록합니다. 이제 reference strain에 대해 수행된 대로 collection isolates에서 얻은 질량 스펙트럼을 보정합니다. 행당 하나의 분리물의 경우, 질량 스펙트럼에서 변이 바이오마커를 식별하고, 각 바이오마커에 대해 측정된 질량과 예측된 동형을 각 열에 기록합니다.

C-Jejuni 아종 doylei ATCC 49349의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에는 계산된 분자 질량을 기준 스펙트럼과 비교하여 식별할 수 있는 14개의 단일 전하를 띤 바이오마커 이온이 포함되어 있습니다. 컬렉션 내에서 메티오닌이 없는 L32, L33 및 gil152939117, S20 M 및 S15 M에 의해 암호화된 가상 단백질에 대해 다양한 iso 형태가 검출되었으며, 바이오마커 이온에 할당된 나머지 질량은 테스트된 분리물에서 변하지 않았습니다. 질량 이동에 해당하는 아미노산 치환은 여기에 나열된 프라이머를 사용하여 특정 유전자의 PCR 증폭 및 생어 염기서열분석에 의해 확인되었습니다.

MSPP 계획에 포함된 모든 바이오마커 이온의 아미노산 서열과 검출된 alelic isoform이 여기에 표시되어 있습니다. 조사된 C jejuni 아종 doylei isolates에서 구성된 MLST 기반 UPGMA 덴드로그램은 각 분리물이 다른 MLST 서열 유형에 속한다는 것을 보여줍니다. 그리고 균주 LMG7790은 계통 발생 거리가 가장 깁니다.

MLST alaysis에서 볼 수 있듯이, isolate LMG7790는 조사된 C jejuni 아종 doylei isolates의 MSPP 분석에서 가장 긴 계통 개발 거리를 가지고 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 하루 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 따르는 동안 실험 중에 사용된 일부 물질의 독성을 기억하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 아세토-니트릴은 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 또한 MSPP에 DNA 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행하여 내성 유전자의 존재와 같은 추가 매개변수를 분석할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 미생물학 분야의 연구자들이 광발생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 MSPP가 어떻게 작동하고 특정 질문에 어떻게 적용할 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다. 폭력적인 병원체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 S2 실험실 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.