급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

본 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 대퇴동맥에 봉합사 또는 아메로이드 수축기를 배치하여 각각 급성 또는 아급성 후지 허혈을 유도함으로써 인간의 말초동맥질환을 모델링하는 것입니다. 말초동맥질환은 중요한 임상적 문제이며, 인간의 질병을 더 잘 나타내기 위해 이러한 동물 모델 기술이 개발되었습니다. 이 기술들의 주된 장점은 연구자가 사지 허혈의 중증도와 발생 시점을 조절할 수 있다는 점입니다.

시연은 저희 실험실의 기술자인 Mike Padgett가 진행하겠습니다. 시술 1~2일 전에 발가락 꼬집기 반응이 없는 것을 통해 마우스가 완전히 진정되었는지 확인하고, 안연고를 도포하십시오. 그다음, 소형 전기 트리머를 사용하여 양쪽 뒷다리의 털을 깎으십시오.

모든 털을 깎은 후, 미리 데워둔 제모 크림을 도포합니다. 1분 후에 젖은 거즈 패드로 크림을 부드럽게 닦아냅니다. 그 다음, 마우스가 흉복와위(sternal recumbency) 상태를 유지할 수 있을 때까지 종이 타월이 깔린 빈 회복 케이지에 넣습니다.

수술 당일, 완전히 진정된 마우스를 Technic 스테레오 해부 현미경 아래에 배와 닿는 면이 위로 오도록 눕히고, 양쪽 다리를 수술용 테이프로 고정합니다. 온도 조절 가열 패드를 사용하는 경우, 온도 프로브를 부착하고 프로브를 수술 플랫폼 바닥에 수술용 테이프로 고정합니다. 다음으로, 포비돈 요오드와 알코올 솜을 교대로 세 번 사용하여 수술 부위를 세척하고, 절개 부위에 구멍이 있는 멸균 수술용 드레이프로 동물을 덮습니다.

메스를 사용하여 무릎에서 복부를 향해 내측 허벅지 중앙을 따라 초기 절개를 실시합니다. 그 후 미세 가위를 사용하여 절개 부위를 약 1cm까지 넓힙니다. 포셉을 사용하여 절개창을 열고 서혜부 지방 조직을 덮고 있는 막을 노출시킵니다.

그 다음, 닫힌 포셉을 사용하여 막을 뚫고 지방 조직과 복부 사이의 공간으로 진입합니다. 포셉에 가했던 압력을 서서히 풀어 지방 조직을 복근에서 분리하고 신경혈관다발을 노출시킵니다. 신경혈관다발을 박리하기 전에 주요 혈관과 그 분지들을 정확하게 식별하는 것이 매우 중요합니다.

수축기의 위치나 결찰 부위의 변동은 허혈의 심각도를 크게 변화시킬 수 있으며, 결과에 상당한 가변성을 초래할 수 있습니다. 절개창에 리트랙터를 삽입하고 복부 조직을 동물의 머리 방향으로 당겨 외측 대퇴 회선 동맥 바로 근위쪽에 위치한 근위부 아메로이드 수축기 부위를 노출시킵니다. 그런 다음 절개창의 원위부에 내측과 외측 리트랙터를 각각 하나씩 삽입하여 수술 시야를 넓히고, 서혜부 지방 조직을 발 방향 및 수술 부위에서 멀어지는 방향으로 당깁니다.

대퇴동맥의 근위 및 표층 미측 분지들이 쉽게 관찰되어야 합니다. 외측 대퇴회선동맥은 미측 분지에서 근위쪽으로 약 5mm 지점에 위치하며, 막에 의해 가려져 있을 수 있습니다. 이제 핀셋의 끝을 혈관들을 묶고 있는 막 아래로 부드럽게 밀어 넣어, 끝부분의 1/2이 정맥과 동맥 사이에 들어가게 합니다.

그 다음 포셉을 닫고 막을 조심스럽게 떼어냅니다. 막이 모두 제거되면, 닫힌 포셉의 끝을 정맥과 동맥 사이에 삽입하고 포셉의 압력을 풀어 혈관 사이에 틈을 만듭니다. 아급성 사지 허혈의 경우, 포셉 끝을 대퇴동맥 아래로 밀어 넣어 신경혈관다발로부터 혈관을 분리합니다.

두 번째 각도 핀셋을 사용하여 컨스트릭터(constrictor)의 가장자리를 잡고, 컨스트릭터를 대퇴동맥 아래로 안내합니다. 그런 다음 동맥을 컨스트릭터 슬롯에 놓습니다. 다음으로, 대퇴동맥이 슬와동맥(popliteal artery)과 대복재동맥(saphenous artery)으로 분지되는 지점의 바로 근위측에 원위측 컨스트릭터를 배치하고, 대퇴동맥을 컨스트릭터 슬롯에 넣습니다.

급성 사지 허혈을 위해, 근위부 수축기와 동일한 위치의 동맥 아래로 7-0 봉합사를 통과시켜 동맥을 결찰합니다. 그다음 첫 번째 결찰 부위에서 원위부로 약 1mm 떨어진 곳에 두 번째 결찰을 하고, 스프링 가위를 사용하여 두 결찰 사이의 동맥을 절단합니다. 원위부 동맥 절단의 경우, 대퇴동맥이 슬와동맥과 대복사정맥으로 분지되는 지점의 바로 근위부에 결찰선을 약 1mm 간격으로 배치합니다.

그런 다음 interrupted 5-0 vicryl suture로 절개 부위를 봉합하고, 마우스를 레이저 도플러 혈류 영상 장치(laser doppler perfusion imager) 아래의 37 °C 가열 패드로 옮깁니다. 이제 영상 장치를 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 실행합니다. New Single Image 아이콘을 클릭하여 스캐너 설정 창을 열고, 스캔 크기를 large로, 스캔 속도를 pixel당 4 ms로 설정합니다.

스캔 영역(Scan Area) 단위 패널에서 X 및 Y 값을 적절한 값으로 변경한 다음, 비디오 및 거리(Video and Distance) 탭을 클릭하고 두 뒷다리가 모두 스캔 영역 내에 위치하도록 조정하십시오. 자동 거리(Auto Distance)를 클릭한 후, 다음(Next)을 클릭하여 피험자 세부 정보(Subject Details) 창을 열고 피험자 정보를 입력하십시오. 다음(Next)을 클릭하여 스캔 창으로 이동하십시오.

그런 다음 Start Measurement 버튼을 클릭하여 Confirm or Override Scan Distance 대화 상자를 열고, OK를 클릭하여 스캔 프로세스를 시작합니다. 스캔이 완료되면 마우스를 모니터링 장치가 있는 빈 회복 케이지로 옮겨 완전히 회복될 때까지 둡니다. 동물 연구에 내재된 변동성 외에도 체온 및 동물의 자세를 포함한 다른 요인들이 레이저 도플러 혈류 영상법 내에 가변성을 유발할 수 있습니다.

아급성 후지 허혈 모델은 아메로이드 수축기(ameroid constrictors)의 품질에 따라 결과가 달라지며, 이는 동일한 배치 내에서도 큰 차이가 있을 수 있습니다. 수술의 효과를 입증하고 수술 후 기저 관류 수준을 설정하기 위해, 동물이 아직 마취 상태일 때 시술 직후 레이저 도플러 관류 영상 촬영을 수행해야 합니다. 급성 사지 허혈 유도 후에는 후지 관류의 완전한 소실이 관찰되어야 하는 반면, 아급성 모델의 아메로이드 수축기 배치 후에는 일반적으로 관류의 경미한 감소만 관찰됩니다.

이 절차들을 통해 인간 말초 동맥 질환의 모델인 생쥐에서 다양한 정도의 허혈이 혈관 리모델링 및 골격근 재생에 미치는 영향을 탐구할 수 있습니다. 숙련된 경우, 정확하게 수행한다면 약 15분 이내에 이 절차를 완료할 수 있습니다. 수술을 시도하는 동안 동물의 체온과 마취 상태가 적절한지 지속적으로 모니터링하는 것이 중요합니다.

결찰사(ligature) 또는 수축기의 배치 위치를 조정함으로써 허혈성 손상의 정도를 변경할 수 있으며, 이는 동물의 유전적 배경이나 심혈관 위험 요인의 존재 여부에 따라 중요한 변수가 될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 급성 및 아급성 후지 허혈을 유도하는 방법과, 적절한 결과와 절차의 재현성을 보장하기 위해 혈관 해부학적 구조를 정의하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.