Name: 급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 배우세요 쥐 뒷다리 국소 빈혈 유도 방법을 통해 말초동맥질환을 모델링하는 기술을. 아메로이드 수축기를 이용한 점진적 동맥 폐쇄로 조직 괴사를 최소화하여 혈관생성 연구에 활용합니다.

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이 연구는 CDK에 대한 NIH 보조금 R21HL118661, R56HL124444 및 R01HL124444와 JMM에 대한 NIH 보조금 R00HL103797 및 R01HL125695의 지원을 받았습니다.

모든 동물 실험은 공작 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 성별에 사용할 수 있지만, 본 연구의 과학적 목적 바와 같이 수컷 마우스가 본 연구에 사용 하였다. 1. 머리 제거 <ol><li> 37 ° C로 설정 덮여 가열 패드 및 이소 플루 란의 연속적인 흐름으로 연결된 노즈콘 포트 이루어진 수술 전 준비 영역을 설정 마취 유도에 앞서. </li><li> 마취 유도 챔버에서 마우스를 놓습니다. 3 % - 1 1 L / 분, 이소 플루 란에 O 2 유량계를 설정합니다. 주 : 마취 보통 2 % 이소 플루 란과 함께 25g 마우스에서 유도된다. </li><li> 부드럽게 챔버 락과 복원력 반사의 부족을 관찰하여 마우스의 자극 반응을 확인합니다. </li><li> 개방 이전의 이소 플루 란을 취소 O 2 챔버를 플래시합니다. 빠르게 가열 (P)에 마우스를 움직광고 및 원추형 두부를 통해 이소 플루 란에 연결합니다. </li><li> 1.5 %로 이소 플루 란을 조정합니다. 페달 반사 (발가락 핀치)에 의한 자극 반응을 확인합니다. </li><li> 수술 중 건조를 방지하기 위해 두 눈에 자유롭게 안과 윤활제를 적용합니다. </li><li> 작은 전기 트리머를 사용하여 두 뒷다리의 머리를 면도. 피부를 lacerating 피하기 위해 면도하는 동안 팽팽하게 피부를 잡아. </li><li> 미리 예열 머리 제거 크림을 적용하고 1 분 동안 앉아 보자. 부드럽게 젖은 거즈 패드를 사용하여 닦아. </li><li> 나중에 수술의 경우, 이소 플루 란을 끄고 케이지 침대를 대기음하지 않는 마우스를 보장하기 위해 빈 종이 타월 늘어선 복구 케이지에 마우스를 이동합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지할 수있을 때까지 동물을 모니터한다. 그렇지 않으면, 수술 테이블에 마우스를 이동합니다. 주 : 제모 방법은 피부를 자극하고 혈류 측정에 영향을 미칠 수있다. 페이지 전에 동물의 털을 제거한 후 이일 - 일을 기다려야하는 것이 좋습니다미리 수술 관류 스캔을 erforming 또는 수술을 수행. </li></ol> 2. 수술 전 준비 <ol><li> 이 절차를 수행하는 동안 다음과 같은 도구를 사용하여; 작은 직선 수술 가위, 2 뾰족한 각도 집게, 작은 Graefe 씨 집게, 바늘 드라이버 집게, 3 견인기, 작은 봄 가위와 뾰족한 면봉. </li><li> 수술 개시전 오토 클레이브를 사용하여 모든 도구를 소독. 최대 5 동물, 각 수술 전에 사이에 뜨거운 비드 살균기를 사용합니다. 5보다 큰 그룹의 실용 추가적인 수술 도구 패킷을 소독. </li><li> 덮여 가열 패드와 이소 플루 란 포트로 구성된 무균 수술 부위를 준비합니다. 10 스테레오 해부 현미경으로 모든 작업을 수행합니다. </li><li> 마취 및 단계 1.5-1.1에 설명 된대로 마우스를 준비합니다. </li><li> 마우스가 완전히 진정되어 있는지 확인하고 수술 테이블에 앙와위로 배치합니다. 수술 테이프를 사용하여 두 다리를 고정합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 온도 제어 된 가열 패드를 사용하는 경우, 온도 센서를 부착하고이 과정 중에 실수로 인출되지 않도록 외과 테이프를 사용하여 수술 플랫폼의베이스에 고정. </li><li> 3 교대 포비돈 - 요오드와 알코올 잎사귀를 사용하여 절개 부위를 청소합니다. 무균 수술 드레이프와 동물을 커버하고 절개 부위를 노출 구멍을 잘라. </li></ol> 사지 허혈 3. 유도 <ol><li> 복부를 향해 무릎에서 실행, 내측 허벅지의 중심을 따라 초기 절개를하고, 미세 가위 (그림 1A)와 약 1cm에 절개를 연장하기 위해 메스를 사용합니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig1.jpg" /> 그림 1. 수술 부위와 마우스 뒷다리 국소 빈혈 외과 혈관 해부학 적 랜드 마크. (A)의 외부보기앙와위에서 마우스의 뒷다리. 해칭 선 적절히 사지 허혈 절차를 수행하기 위해 절개 부위를 나타낸다. 근위 마우스 뒷다리 혈관의 (B)보기. 대퇴 동맥 (FA)의 기단부는 사타구니 인대 (IL) 아래에서 생긴다. FA의 선단은 슬와 동맥 (PA) 및 복재 동맥 (SA)에 그 분기점에 위치해 있습니다. FA 오프 주요 측부 동맥 측면 곡절 대퇴 동맥 (LCFA), 근위 꼬리 대퇴 동맥 (PCFA) 및 표면 꼬리 상복부 동맥 (SCEA)입니다. 대퇴 정맥 (FV)은 FA에 인접하여 실행하고, 정맥 가지 주요 동맥 가지 평행 알 수있다. 별표 (*)., 아메 로이드 constrictors 또는 합자의 배치 근위 및 원위 사이트를 나타낸다 아 급성 또는 급성 허혈이 유발되는지 여부에 따라 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig1large.jpg" target="_blank">주십시오 CLI</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 (CK). <ol start="2"><li> 집게를 사용하여 절개를 열고 사타구니 지방층 (IFT)를 피복하는 막을 노출. </li><li> 피어스 IFT와 복부 사이의 분리에 막을 통해 폐쇄 집게를 사용. 조심스럽게 아래에있는 신경 혈관 다발을 노출, 복부 근육에서 IFT를 분리하기 위해 집게에 압력을 놓습니다. 중요한 해부학 적 랜드 마크 (그림 1B)와 근위 및 표면 꼬리 가지를 관찰한다. </li><li> 트랙터를 삽입하고 근위 아메 로이드의 뱀 또는 결찰 사이트, 측면 곡절 대퇴 동맥 (그림 1B)에 바로 인접를 노출 근위 복부 조직을 당깁니다. 측면 곡절 동맥의 근위부 및 표면 꼬리 동맥에 약 5mm의 근위 자리 잡고 있습니다. <ol><li> , 절개의 말단 부분에 두 개 더 견인기, 하나의 내측과 외측을 삽입 말단 거리에서 IFT를 당겨수술 부위는 수술 부위를 확대합니다. </li></ol></li><li> 신경 혈관 다발을 덮고있는 가장 바깥 쪽 막을 제거하기 위해 두 개의 미세 집게를 사용합니다. 부드럽게 그들을 함께 결합 막 아래에있는 집게 팁을 슬라이딩, 정맥과 동맥의 미세 집게 팁의 절반을 삽입합니다. 포셉을 닫고 부드럽게 막을 떨어져 눈물. </li><li> 정맥과 동맥 사이의 닫힌 집게의 끝을 삽입하고 집게에 압력을 해제하여 그들 사이의 틈을 만들 수 있습니다. 동맥과 신경 사이의 갭을 ​​만들려면이 방법을 반복합니다. </li><li> 아 급성 사지 허혈의 경우, 근위 대퇴 동맥 (그림 2)에 아메 로이드 뱀을 배치합니다. <ol><li> 근위 아메 로이드의 뱀을 설치하려면 신경 혈관 다발에서 격리하기 위해 대퇴 동맥 아래 집게의 끝을 밀어 넣습니다. 그립에 뱀의 가장자리를 angled- 집게의 두 번째 세트를 사용하고 대퇴 동맥 아래로 안내합니다. </li><li> 의 S에 대퇴 동맥을 놓는다뱀에 많이합니다. 슬와 동맥과 복재 동맥 (그림 2)에 대퇴 동맥의 분기점에 즉시 근위 위치, 말초 뱀을 반복합니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig2.jpg" /> 아메 로이드 Constrictors과 합자 그림 2. 배치. 아 급성 사지 허혈을 유도하기 위해 대퇴 동맥에 배치이 아메 로이드 constrictors의 (A) 예. 근위의 뱀은 측면 곡절 대퇴 동맥 (LCFA)에 바로 인접 배치됩니다. 말단 뱀은 슬와 (PA) 및 복재 동맥 (SA)의 분기점에 바로 인접 배치됩니다. Constrictors은 동맥을 보장하기 위해이 위를 향하도록 슬롯이 제대로 뱀 내에서 설정되어 설치됩니다. 급성 사지 허혈을 유도 할 수있는 대퇴 동맥의 합자의 (B) 예. LigaturES는 (노란 화살표)가 패널 (B)의 constrictors의 측면에 위치하도록 배치하고, 대퇴 동맥 두 합자 (별표)의 각 세트 사이에 횡단된다. 바, 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="8"><li> 급성 사지 허혈의 경우, 결찰 및 근위 대퇴 동맥을 가로로 쪼개다. <ol><li> 대퇴 동맥을 가로로 쪼개다하려면 스레드 (7) - 근위의 뱀의 위치로 바로 근위 동맥에서 O 봉합은 및 결찰 (단계 3.7 참조​​). 처음에 1mm의 말단에 대해 두 번째 합자 타이. </li><li> 두 합자 사이의 동맥을 가로로 쪼개다 봄 가위를 사용합니다. 말초 동맥 절개를 들어, 슬와 동맥과 복재 동맥에 대퇴 동맥의 분기점에 떨어져 바로 인접 1mm 약 2 합자를 배치하지만 그들은 표면 caud에 말단 있다는 보장이 단계를 반복알 상복부 동맥 (그림 1 참조) </li></ol></li><li> O의 vicryl 봉합사 - 절개를 닫 사용하여 5를 중단. </li></ol> 4. 관류 영상 <ol><li> 레이저 도플러 관류 이미 저 (LDPI) 아래 설정 37 ° C 가열 패드에 마우스를 이동하고 이소 플루 란 소스에 원추형 두부를 통해 연결합니다. 어떤 온도 모니터를 사용할 수없는 경우, 마우스가 37 ℃까지 가온을 위해 5 분을 허용한다. </li><li> 이미 저를 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 실행합니다. </li><li> &#39;스캐너 설정&#39;창을 엽니 다 &#39;새 단일 이미지&#39;아이콘을 클릭합니다. &#39;4 MS / 픽셀&#39;에 &#39;큰&#39;와 &#39;스캔 속도&#39;에 &#39;스캔 크기&#39;를 설정합니다. &#39;스캔 영역 (단위)&#39;창에서 x와 y 값을 변경하여 스캔 영역을 설정합니다. </li><li> 비디오 피드를 볼 수있는 &#39;비디오 및 거리&#39;탭을 클릭하고 빨간색 테두리로 표시된 스캔 영역에 맞게 마우스를 정렬합니다. 교정 &#39;자동 거리&#39;를 클릭피사체 레이저의 거리. &#39;제목 세부 정보&#39;창을 엽니 다 &#39;다음&#39;을 클릭합니다. </li><li> 대상 정보 및 모든 관련 설명을 입력합니다. 스캔 창으로 이동하는 &#39;다음&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> &#39;확인 또는 스캔 거리 무시&#39;열기 대화 상자를 위해 &#39;시작 측정&#39;버튼을 클릭합니다. 스캔 거리를 확인하는 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. 스캔 영역의 크기에 따라 8 분 - 스캐닝 프로세스를 시작하고 4 실행 관찰한다. </li><li> 스캔이 완료되면 &#39;저장&#39;창을 관찰합니다. 파일 이름을 지정하고 저장합니다. </li><li> 이소 플루 란을 차단하고 빈 복구 케이지에 마우스를 이동하고 동물 흉골 드러 누움을 유지 할 수있을 때까지 모니터링 할 수 있습니다. 다른 마우스와 케이지에 마취에서 회복 마우스를 놓지 마십시오. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 엽니 다. &#39;열기&#39;아이콘을 클릭하고 찾아 분석을 위해 이미지 파일을 엽니 다. 파일 창에서 플럭스를 관찰,마우스의 사진, 색상 이​​미지. </li><li> 플럭스 이미지에 대한이자 (ROI)의 영역을 표시하려면 &#39;쇼 로아&#39;아이콘을 클릭합니다. 다음 &#39;추가 다각형&#39;버튼을 클릭하고 투자 수익 (ROI)을 그립니다 비 외과 사지 주위에 커서를 끕니다. 모양을 닫으려면 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 선택 다시 &#39;다각형 추가&#39;및 수술 사지 주위에 일치하는 투자 수익 (ROI)을 그립니다. </li><li> &#39;이미지 로아 통계 결과 (PU)&#39;창을 엽니 다 &#39;통계&#39;아이콘을 클릭합니다. &#39;플럭스 %&#39;열의 플럭스의 %의 차이를 관찰한다. 참고 : 참고가 될 것입니다 그린 최초의 ROI. 참고 : 각각의 후속 관류 스캔하기 전에 마우스를 마취하는 제 1 절에 설명 된 단계를 따라 단계 이미지 4.11-4.1 동물이다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

아마도이 과정에서 가장 어려운 단계는 대퇴 정맥의 대퇴 동맥의 분리이다. 큰 직경 및 동맥와 비교 대퇴 정맥의 얇은 벽은 천공의 감수성을 증가시키고 수술 조작시 찢어. 정맥을 방해의 가능성은 PBS에 적신 멸균 면봉을 사용하여 습윤 상처를 유지함으로써 감소 될 수있다. 모든 집게가, 날카롭게 정렬 및 혈관과 주변 조직의 정확한 조작을 허용하기 위해 휴식을 무료로되어 있는지 확인하는 것도 중요합니다. 출혈이 멈출 때까지 발생합니까 출혈 경우, 멸균 거즈와 지역에 압력을 적용합니다. 장기에서 실수로 더 심한 허혈 손상을 나타낼 수있는 &#39;작은&#39;출혈 이벤트로 인식 될 수 무엇으로 자세한 수술 노트, 각 동물에 대한 유지되어야한다. 데이터 일관성을 위해, 수술은 정맥 또는 담보 동맥 출혈을 포함하지보내고 이벤트는 매우 중요하다. 이 기술의 한계는 심각성 및 / 또는합니다 (아 급성 아메 로이드의 뱀 모델) 허혈 증상은 여러 가지 요인에 따라 광범위하게 변할 수 있다는 것...

주변 동맥 질환 (PAD)은 ​​선진국 (1) 심혈 관계 이환율과 사망률의 주요 원인이다. 결과 운동시 또는 휴식 고통과 때때로 사지 절단을 필요로 궤양과 괴저 비 치료와 사지 허혈에 이르게 주변 동맥의 동맥 경화 방해에서 PAD 결과. 기본적으로 효과적인 의료 치료 4 존재하지 않기 때문에 PAD를 대상으로 치료는 주로 혈관이 또는 외과 적 재관류 3으로 연결됩니다. 바이 패스 이식 일부 집단 (예를 들어, 흡연자, 여성, 비 복재 정맥 이식편) 6,7에 더 나쁘다 5 (5 년 이내 50 %까지) 높은 실패율이 불행하게도, 재관류 술은 종종 제한된 혜택입니다. 이러한 혈관 성형술 및 스텐트 삽입술과 같은 혈관 접근 방법은,도 (1 년 이내 50 % 초과) 높은 재 협착 비율에 의해 손상되어, 내가 서 특히약물 방출 풍선과 스텐트의 사용이 다소 9-11 성과를 개선했지만, N, 질병 8 대퇴 슬와. PAD 새로운 치료제를 개발하기 위해서는 확실하게 인간의 질병을 재현 동물 모델을 개발하는 것이 필수적이다. 현재까지, PAD의 가장 일반적인 모델 자주 마우스 (12, 13)에서 수행되는 사지 허혈 모델 (HLI)이다. 가장 흔한 증상에서, 모델은 근위 및 원위 대퇴 동맥 수술 결찰을 수반하고 그 중간 측 분기 혈류 급성 사지 허혈 유도 교합의 결과로 용기의 절제 하였다. HLI 말초 사지 근육 조직에서의 혈관 신생 및 동맥 신생 반응 및 이들 반응에 대한 다양한 치료 (예를 들면, 약물, 유전자 전달은, 줄기 세포)의 효과를 연구하기 위해 주로 사용되어왔다. 최근 우리 그룹 골격근 세포의 역할을 조사하기 위해 모델을 사용한 전해당 반응은 허혈 및 결과 (14)에 유전 적 차이의 영향을 사지. HLI 모델은 현재 허혈, 혈관 근육 응답 유전자 (즉, 근친 주) (15)에 의존 이해 16 세, 당뇨병 (17)을 포함하는 다른 질환 또는 동맥 경화증 관련 조건의 유무를 촉진했다 고 콜레스테롤 혈증 18. 그러나, 전통적인 HLI 모델의 중요한 약점은 인간 PAD는 말초 동맥 폐색 성 동맥 경화성 병변의 점진적인 발전의 결과로서 만성 허혈을 야기하는 반면이 급성 사지 허혈 (12, 13)의 모델이라는 것이다. 이 약점을 회피하기위한 시도로, 당과 동료들은 초기 constrictors 아메 로이드 (19)를 사용하여 점진적으로 대퇴 동맥 폐색의 쥐 모델,이어서 D 동일한기를 개발유사한 마우스 모델 (20) eveloped. 아메 로이드 constrictors 만성 심근 허혈 (21, 22)의 개 모델에서 1950 년대에 처음 기술되었다. 이러한 장치는 일반적으로 카제인, 흡습성 물질의 내부 층을 감싸는 외측 금속 슬리브를 가지며, 동맥 주위에 배치 할 때의 주위의 조직으로부터 수분을 흡수대로 점진적 혈관 폐색을 유도한다. 모델들의 변형에서, 양 등의 Al을. 근위 및 외과 용 결찰 사이트 유사 사이트의 원위 대퇴 동맥 모두 constrictors 배치, 이들은 전통적인 모델에서와 같이, 대퇴 동맥의 곁가지를 결찰. 수술 후 5주, 적은 근육 괴사 20 - 급성 HLI에 비해 아메 로이드 뱀 허혈 유발 염증 및 전단 응력 의존성 유전자의 낮은 발현 낮은 혈류 복구 4 결과. 이러한 관찰에 기초하여, 그 완만 한 동맥 폐색 P의 모델을 제공 할 수 느꼈다인간의 질병에 관련성 AD. 특히, 원래의 보고서에서, 아메 로이드 뱀에 의한 허혈의 효과는 허혈에 의한 근육의 괴사 (15)에 상대적으로 내성 C57BL / 6 마우스 (19)에 조사 하였다. 우리는 최근에 더 점진적 허혈 모델을 수정하고 더 허혈 취약 BALB / C 마우스 스트레인 (23)에 미치는 영향을 탐구. 모델의 첫 번째 표현에서 우리는 근위 및 원위 대퇴 동맥에 모두 constrictors을 배치하지만 그대로 모든 측면 가지를 떠났다. 두 번째, 온화한 변형에서, 우리는 근위 대퇴 동맥에 하나의 뱀을 넣고 다시 그대로 동​​맥의 모든 측면로 분기를 떠났습니다. 이 모델의 두 변형에서, 우리는 해당 BALB / c 마우스가 아닌 C57BL / 6 쥐를 발견 유사한 혈류 및 혈관 밀도에도 불구하고 상당한 근육의 괴사를 표시. 우리의 이전 연구 (14)와 마찬가지로, 이러한 연구 결과는 사지 근육을 보여 주었다부상은 전적으로 혈액의 흐름에 영향을하지만, 일부 유전 적 배경에 의존하지 않습니다. 또한, 우리는 사지 혈류 따라서 모델이 더 한 &#39;아 급성&#39;보다는 점진적인 사지 허혈의이 나타납니다, 3 일 이내에 그 최저점으로 떨어졌습니다 것을 발견했다. 이러한 종래의 연구에 기초하여, 뒷다리 허혈을 유도하기위한 하나의 방법은 모든 경우에 적합하지 않을 수 있음을 분명히 나타난다. 조건 (예를 들면, 유전 적 차이와 존재 또는 공동 병적 상태의 유무) 영향 혈관 및 골격 근육 별 반응 모두의 다양한 연구자 찾을 수 있기 때문에이 필요한 만성 및 / 또는 최선을 사지 허혈의 정도를 수정 자신의 목적에 맞게. 또한, 모델의 사전 설명은 일반적으로 기술의 신뢰성 간 연구자 재현성을 용이하게하기 위해 적당한 해부학 부족. 본 논문에서는, 마우스에 급성 또는 아 급성 중 하나 사지 허혈을 유도하는 방법설명하고, 정확한 해부학 적 랜드 마크가 제공된다.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5/45 포셉스</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-35</td><td>Dumoxel</td></tr><tr><td>Dumont 스타일 5 미니 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11200-14</td><td>Inox</td></tr><tr><td>엑스트라 파인 본 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>7 - 0 실크 봉합</td>사 <td>샤퍼 포인트</td><td>DA-2527N</td><td></td></tr><tr><td>5 - 0 코팅 Vicryl 봉합</td><td>사 Ethicon</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>인공 눈물 연고</td><td>럭비 연구소</td><td>0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>수술 테이프</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>파인 코튼 면봉</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2DF</td><td></td></tr><tr><td>아메로이드 수축기</td><td>연구 기기 SW</td><td>MMC-0.25 x 1.00-SS</td><td></td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase 등온 패드</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>바늘 드라이버</td><td>파인 사이언스 도구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Moor LDPI</td><td>무어 악기</td><td>moorLDI2</td><td></td></tr><tr><td>moorLDI 측정 소프트웨어</td><td>Moor Instruments</td><td>v. 6.0</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

말초 동맥 질환 (PAD)는 신뢰성이 질병에 대한 새로운 치료 개발에 필요한 인간 질병을 재현 심혈관 질병률과 사망률 선진국 및 동물 모델의 주요 원인이다. 마우스 뒷다리 허혈 모델은 광범위 이러한 목적을 위해 사용 되었으나, 대퇴 동맥 결찰에 의해 급성 사지 허혈을 유도하는 표준 방법은 허혈, 혈관 및 골격 근육 조직 반응을 연구하는 연구자의 능력을 손상 실질적인 조직 괴사 될 수 . 대퇴부 동맥 결찰 다른 방법은 아메 로이드 constrictors의 사용을 통해 점진적 대퇴 동맥 폐쇄의 유도이다. 완만, 급성 허혈 결과, 3 일 - 대퇴 동맥 결찰의 위치와 동일하거나 상이한 위치에서 대퇴 동맥 주위에 배치 될 경우,이 장치는 하나 이상 동맥 폐색. 이 w는, 이하 실질적인 골격근 조직 괴사를 초래HICH 더 밀접하게, 인간에서 본 PAD 응답을 모방 할 수있다. 유전 적 배경에 영향 모두 급성 및 아 급성 허혈 모델에서 성과 때문에 마우스 균주 고려 최상의 모델을 선택하는 중요한 연구되고있다. 이 논문은 마우스에서 아 급성 또는 급성 사지 허혈을 유도하는 적절한 절차와 마우스 대퇴 동맥에 합자 또는 아메 로이드 constrictors의 해부학 적 위치를 설명합니다.

마우스 뒷다리 혈관의 정확한 식별은 여기에 설명 된 바와 같이, 급성 및 급성 사지 허혈 모두를 유도하는 기술의 재현성을 보장하는 데 중요하다. 동물 연구에서 본래의 변동뿐만 아니라, 다른 요인은 마취 유형, 동물의 위치 (앙와위 대 경향), 체온 (도 3 참조)을 포함하여, 레이저 도플러 관류 영상 (LDPI)에 변화를 도입 할 수있다. 또한, 아 급성 사지 허혈 모델은 주어진 배치 내에 광범위하게 변할 수 아메 로이드 constrictors의 품질에 의존한다 (도 4 참조). 이러한 문제는 각각 LDPI 측정 유량의 정량화에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 이하에서보다 상세히 논의된다. 아 급성 사지 허혈 모델 또는 결찰에 아메 로이드 constrictors의 위치에 따라동물이 정...

마우스에서 뒷다리 허혈의 외과적 유도는 혈관 신생을 검사하는 데 유용하지만, 현저한 허혈 유발 조직 괴사를 나타내는 특정 근친 마우스 균주에서는 손상됩니다. 점진적인 동맥 폐색의 유도를 통해 이 문제를 회피하기 위해 아메로이드 수축기를 사용하여 아급성 사지 허혈을 유도하는 방법이 설명되어 있습니다.

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 대퇴동맥에 봉합사 또는 아메로이드 수축기를 배치하여 각각 급성 또는 아급성 후지 허혈을 유도함으로써 인간의 말초동맥질환을 모델링하는 것입니다. 말초동맥질환은 중요한 임상적 문제이며, 인간의 질병을 더 잘 나타내기 위해 이러한 동물 모델 기술이 개발되었습니다. 이 기술들의 주된 장점은 연구자가 사지 허혈의 중증도와 발생 시점을 조절할 수 있다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 기술자인 Mike Padgett가 진행하겠습니다. 시술 1~2일 전에 발가락 꼬집기 반응이 없는 것을 통해 마우스가 완전히 진정되었는지 확인하고, 안연고를 도포하십시오. 그다음, 소형 전기 트리머를 사용하여 양쪽 뒷다리의 털을 깎으십시오.모든 털을 깎은 후, 미리 데워둔 제모 크림을 도포합니다. 1분 후에 젖은 거즈 패드로 크림을 부드럽게 닦아냅니다. 그 다음, 마우스가 흉복와위(sternal recumbency) 상태를 유지할 수 있을 때까지 종이 타월이 깔린 빈 회복 케이지에 넣습니다.수술 당일, 완전히 진정된 마우스를 Technic 스테레오 해부 현미경 아래에 배와 닿는 면이 위로 오도록 눕히고, 양쪽 다리를 수술용 테이프로 고정합니다. 온도 조절 가열 패드를 사용하는 경우, 온도 프로브를 부착하고 프로브를 수술 플랫폼 바닥에 수술용 테이프로 고정합니다. 다음으로, 포비돈 요오드와 알코올 솜을 교대로 세 번 사용하여 수술 부위를 세척하고, 절개 부위에 구멍이 있는 멸균 수술용 드레이프로 동물을 덮습니다.메스를 사용하여 무릎에서 복부를 향해 내측 허벅지 중앙을 따라 초기 절개를 실시합니다. 그 후 미세 가위를 사용하여 절개 부위를 약 1cm까지 넓힙니다. 포셉을 사용하여 절개창을 열고 서혜부 지방 조직을 덮고 있는 막을 노출시킵니다.그 다음, 닫힌 포셉을 사용하여 막을 뚫고 지방 조직과 복부 사이의 공간으로 진입합니다. 포셉에 가했던 압력을 서서히 풀어 지방 조직을 복근에서 분리하고 신경혈관다발을 노출시킵니다. 신경혈관다발을 박리하기 전에 주요 혈관과 그 분지들을 정확하게 식별하는 것이 매우 중요합니다.수축기의 위치나 결찰 부위의 변동은 허혈의 심각도를 크게 변화시킬 수 있으며, 결과에 상당한 가변성을 초래할 수 있습니다. 절개창에 리트랙터를 삽입하고 복부 조직을 동물의 머리 방향으로 당겨 외측 대퇴 회선 동맥 바로 근위쪽에 위치한 근위부 아메로이드 수축기 부위를 노출시킵니다. 그런 다음 절개창의 원위부에 내측과 외측 리트랙터를 각각 하나씩 삽입하여 수술 시야를 넓히고, 서혜부 지방 조직을 발 방향 및 수술 부위에서 멀어지는 방향으로 당깁니다.대퇴동맥의 근위 및 표층 미측 분지들이 쉽게 관찰되어야 합니다. 외측 대퇴회선동맥은 미측 분지에서 근위쪽으로 약 5mm 지점에 위치하며, 막에 의해 가려져 있을 수 있습니다. 이제 핀셋의 끝을 혈관들을 묶고 있는 막 아래로 부드럽게 밀어 넣어, 끝부분의 1/2이 정맥과 동맥 사이에 들어가게 합니다.그 다음 포셉을 닫고 막을 조심스럽게 떼어냅니다. 막이 모두 제거되면, 닫힌 포셉의 끝을 정맥과 동맥 사이에 삽입하고 포셉의 압력을 풀어 혈관 사이에 틈을 만듭니다. 아급성 사지 허혈의 경우, 포셉 끝을 대퇴동맥 아래로 밀어 넣어 신경혈관다발로부터 혈관을 분리합니다.두 번째 각도 핀셋을 사용하여 컨스트릭터(constrictor)의 가장자리를 잡고, 컨스트릭터를 대퇴동맥 아래로 안내합니다. 그런 다음 동맥을 컨스트릭터 슬롯에 놓습니다. 다음으로, 대퇴동맥이 슬와동맥(popliteal artery)과 대복재동맥(saphenous artery)으로 분지되는 지점의 바로 근위측에 원위측 컨스트릭터를 배치하고, 대퇴동맥을 컨스트릭터 슬롯에 넣습니다.급성 사지 허혈을 위해, 근위부 수축기와 동일한 위치의 동맥 아래로 7-0 봉합사를 통과시켜 동맥을 결찰합니다. 그다음 첫 번째 결찰 부위에서 원위부로 약 1mm 떨어진 곳에 두 번째 결찰을 하고, 스프링 가위를 사용하여 두 결찰 사이의 동맥을 절단합니다. 원위부 동맥 절단의 경우, 대퇴동맥이 슬와동맥과 대복사정맥으로 분지되는 지점의 바로 근위부에 결찰선을 약 1mm 간격으로 배치합니다.그런 다음 interrupted 5-0 vicryl suture로 절개 부위를 봉합하고, 마우스를 레이저 도플러 혈류 영상 장치(laser doppler perfusion imager) 아래의 37 °C 가열 패드로 옮깁니다. 이제 영상 장치를 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 실행합니다. New Single Image 아이콘을 클릭하여 스캐너 설정 창을 열고, 스캔 크기를 large로, 스캔 속도를 pixel당 4 ms로 설정합니다.스캔 영역(Scan Area) 단위 패널에서 X 및 Y 값을 적절한 값으로 변경한 다음, 비디오 및 거리(Video and Distance) 탭을 클릭하고 두 뒷다리가 모두 스캔 영역 내에 위치하도록 조정하십시오. 자동 거리(Auto Distance)를 클릭한 후, 다음(Next)을 클릭하여 피험자 세부 정보(Subject Details) 창을 열고 피험자 정보를 입력하십시오. 다음(Next)을 클릭하여 스캔 창으로 이동하십시오.그런 다음 Start Measurement 버튼을 클릭하여 Confirm or Override Scan Distance 대화 상자를 열고, OK를 클릭하여 스캔 프로세스를 시작합니다. 스캔이 완료되면 마우스를 모니터링 장치가 있는 빈 회복 케이지로 옮겨 완전히 회복될 때까지 둡니다. 동물 연구에 내재된 변동성 외에도 체온 및 동물의 자세를 포함한 다른 요인들이 레이저 도플러 혈류 영상법 내에 가변성을 유발할 수 있습니다.아급성 후지 허혈 모델은 아메로이드 수축기(ameroid constrictors)의 품질에 따라 결과가 달라지며, 이는 동일한 배치 내에서도 큰 차이가 있을 수 있습니다. 수술의 효과를 입증하고 수술 후 기저 관류 수준을 설정하기 위해, 동물이 아직 마취 상태일 때 시술 직후 레이저 도플러 관류 영상 촬영을 수행해야 합니다. 급성 사지 허혈 유도 후에는 후지 관류의 완전한 소실이 관찰되어야 하는 반면, 아급성 모델의 아메로이드 수축기 배치 후에는 일반적으로 관류의 경미한 감소만 관찰됩니다.이 절차들을 통해 인간 말초 동맥 질환의 모델인 생쥐에서 다양한 정도의 허혈이 혈관 리모델링 및 골격근 재생에 미치는 영향을 탐구할 수 있습니다. 숙련된 경우, 정확하게 수행한다면 약 15분 이내에 이 절차를 완료할 수 있습니다. 수술을 시도하는 동안 동물의 체온과 마취 상태가 적절한지 지속적으로 모니터링하는 것이 중요합니다.결찰사(ligature) 또는 수축기의 배치 위치를 조정함으로써 허혈성 손상의 정도를 변경할 수 있으며, 이는 동물의 유전적 배경이나 심혈관 위험 요인의 존재 여부에 따라 중요한 변수가 될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 급성 및 아급성 후지 허혈을 유도하는 방법과, 적절한 결과와 절차의 재현성을 보장하기 위해 혈관 해부학적 구조를 정의하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

일방적 hindlimb의 국소 빈혈의 유도에 대한 수술은 레이저 도플러 재관류 이미징에 의해 국소 빈혈의 확인과 증명합니다.

Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델

수많은 유전자 조작 및 / 또는 유전자, 단백질, 세포 및 / 또는 biomaterials의 intramyocardial 주사는 급성 국소 빈혈 / reperfusion 부상과 생쥐의 만성 리모델링의 연구에 시간의 차원에 따라 겹쳐있다. 이 동영상은 국소 빈혈 / reperfusion에 대한 microsurgical 절차, 영구적인 관상 동맥 내고, 그리고 intramyocardial 사출 공부를 보여줍니다.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

여기에서 우리는 들판을 가로 질러이 기술의 표준화를 장려하기 위해 사망률없이 재현 부상 결과 생쥐의 장 허혈 - 재관류의 상세 절차를 설명합니다. 창자 허혈 재관류 손상이 모델은 부상 및 재생의 세포 및 분자 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

창자 허혈 - 재관류 손상의 쥐 모델

우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 가진 토끼에 있는 말 초 허 혈을 유도 하기 위하여 이용 된 외과 절차를 기술 합니다. 이 수술은 환자의 말 초 동맥 질환에서 경험 하는 조건에 대 한 전 임상 모델 역할. 혈관 조 영 법은 또한 관류의 도입 된 허 혈 및 회수의 정도를 측정 하는 수단으로 서 기술 된다.

당뇨병 토끼에서의 뒷 사지의 전 임상 모델

여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

여기서 우리는 마우스에서 좌측 전방 의 관상 동맥의 영구적 인 결찰을 달성하는 방법을 보여주는 외과 적 절차를 설명합니다. 이 모형은 심근 경색의 병리생리학 및 수반되는 생물학 프로세스를 조사하기 위하여 높은 관련성입니다.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

여기에서, 우리는 마우스 뒷다리에 있는 혈류를 측정하기 위하여 레이저 도플러 관류 화상 진찰을 위한 기술 그리고 필요한 통제를 보여주는 프로토콜을 제시합니다.

마우스 힌드림에 있는 레이저 도플러 관류 화상 진찰

이 문서는 작은 절개를 가진 마우스에 있는 심각한 허혈을 확립하기 위하여 능률적인 외과 접근을 보여줍니다. 이 방법은 실험실 업그레이드없이 대부분의 연구 그룹에 의해 적용 될 수있다.

ApoE에서 뒷다리 허혈의 변형 된 수술 모델-/- 소형 절개를 사용하여 마우스

본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

배우세요 쥐 뒷다리 국소 빈혈 유도 방법을 통해 말초동맥질환을 모델링하는 기술을. 아메로이드 수축기를 이용한 점진적 동맥 폐쇄로 조직 괴사를 최소화하여 혈관생성 연구에 활용합니다.

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

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