인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

본 외과적 줄기세포 이식 절차의 전반적인 목표는 약물 대사 획득을 위한 세포 증식, 성숙 및 분화가 가능한 인간 미성숙 간 줄기 전구세포를 사용하여 인간의 간 기능을 갖춘 새로운 키메라 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이 방법은 인간 공여 간 줄기세포 전구체의 증식, 분화 및 손상된 마우스 수용체 간의 재구성을 지원하는 미세 환경을 조성하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 성숙 및 증식된 세포를 사용할 수 있으며 간이 거의 완전히 재세포화된다는 점입니다.

먼저, 1 mg의 DT에 페놀화된 0.85% sodium chloride 용액 1 mL를 첨가하여 1 mg/mL 농도의 디프테리아 독소(DT) 스톡 용액을 제조합니다. Albtrek SCID 마우스를 등쪽으로 눕혀 고정한 뒤, 정중선 좌측 또는 우측의 무릎 굽힘 부위 아래쪽으로 바늘을 체벽과 45도 각도가 되도록 삽입하여 DT를 복강 내 투여합니다. 인슐린 주사기를 사용하여, 20 g 마우스당 갓 제조한 0.3 µg/mL 농도의 DT를 100 µL 주입합니다. DT 주입 48시간 후, 마우스를 보정기에 넣고 30 °C 온수조에서 꼬리를 약 10분 동안 가온하여 혈관을 확장시킵니다.

그다음 꼬리 끝에서 2 cm 떨어진 지점에서 날카로운 메스 날을 사용하여 꼬리에 1 mm 크기의 작은 절개창을 내고, 모세관을 사용하여 혈액을 채취합니다. 혈액이 담긴 모세관을 1500 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 세포 펠렛으로부터 상층액을 분리하여 혈청을 수집합니다. 1:20으로 희석한 혈청 50 µL를 GOT ASTP3 슬라이드에 피펫팅합니다.

그런 다음 제조사의 프로토콜에 따라 다목적 자동 건식 화학 분석기를 사용하여 650 nanometers에서 반응 생성물의 흡광도를 측정합니다. 셀 소터(cell sorter)를 사용하여 인간 일차 태아 간 세포로부터 CDCP1, CD90 및 CD66 세포 항원을 가진 인간 간 줄기세포를 분리하여 CDCP1 양성, CD90 양성, CD66 음성 하위 집단을 얻습니다. 해당 세포를 collagen four 코팅 배양 접시에 분주하고 37 degrees Celsius에서 배양합니다.

세포의 밀도가 80에서 90%의 confluence에 도달하면, PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척하십시오. 그 다음 0.05% Trypsin EDTA를 첨가하고 상온에서 배양하십시오. 현미경 관찰 시 세포가 떠오르거나 자유롭게 흐르는 것처럼 보이면, 10% FBS가 포함된 DMF12 8 mL를 첨가하여 효소 소화를 중단시키십시오.

10 mL 세로로지컬 피펫을 사용하여 세포를 천천히 현탁시킨 후 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 100 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 10% FBS가 포함된 DMF12 10 mL를 사용하여 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁하고, 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

각 마우스당 50 µL의 PBS에 1 × 10⁶개의 세포가 포함되도록 세포를 분주하고, 이식 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취시킨 후, 뒷발 바닥을 가볍게 꼬집어 반사 반응을 확인하십시오. 그 다음, 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 동물용 연고를 도포하십시오.

전기 이발기로 수술 부위를 삭모한 후, 70% ethanol과 포비돈-요오드(povidone-iodine)를 도포하여 소독합니다. 갈비뼈의 늑골 하단 바로 아래 왼쪽 옆구지에 1cm 길이로 피부 절개를 실시합니다. 그다음 왼쪽 복벽을 절개하고, 이어서 복막을 절개합니다.

다음으로, 비장을 조심스럽게 노출시킵니다. 그런 다음 5도 각도로, 32 gauge 1/2 inch 바늘이 장착된 100 µL 마이크로 주입용 주사기를 비장 두께의 절반 깊이까지 삽입하고, 장기의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝으로 50 µL의 PBS에 부유시킨 1 × 10⁶개의 인간 간 줄기세포를 직접 주입한 후 바늘을 제거합니다. 주입 후 세포가 유출되는 것을 방지하기 위해, 손가락을 사용하여 2분 동안 부드럽게 압박합니다.

비장을 마우스 체내로 다시 넣고, 일반적인 연속 봉합법을 사용하여 근육층과 피부를 봉합해 체강을 닫습니다. 즉시 마우스를 옆으로 눕혀 37 °C로 예열된 케이지로 옮깁니다. 케이지 베딩이 수술 부위에 닿지 않도록 주의하며, 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 모니터링합니다.

이식 후 4~6주가 지나면, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시킨 후 수술용 가위를 사용하여 피부와 근막을 동시에 절개하여 복강을 엽니다. 가위를 확장기로 사용하여 백선(linea alba)을 따라 복막 위의 결합 조직을 박리하여 복강을 엽니다. 핀셋으로 흉골을 들어 올립니다.

그런 다음 횡격막을 천공하고 흉골의 양측을 절개하여 경추대까지 절단합니다. 간의 흉곽 쪽에서 대정맥을 절단하고 식도를 간을 통과해 앞방향으로 끌어당깁니다. 횡격막을 제거한 후, 이를 손잡이처럼 이용하여 간을 복강 밖으로 끌어내기 시작합니다.

하대정맥이 간을 고정하고 있을 것입니다. 따라서 우측 부신이 조기에 분리되지 않도록 주의하며 하대정맥을 절단하십시오. 간엽들을 접합부에서 서로 분리한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 OCT에 매립하십시오.

크라이오스탯의 금속 그리드에서 간 조직이 포함된 OCT를 동결시킵니다. 크라이오스탯을 사용하여 -18 °C에서 5 µm 두께로 샘플 섹션을 절단하고, 이를 상온의 현미경 슬라이드에 부착합니다. 스톡은 -80 °C에서 보관하십시오.

마지막으로, 이전에 보고된 절차에 따라 H&E 염색용 슬라이드를 준비하고, 텍스트 프로토콜에 따라 ELISA를 수행합니다. 이 H&E 염색 절편에서 보는 바와 같이, DT 처리된 마우스는 무질서한 간 구조를 보였으며, 혈청 AST 활성 증가와 함께 울혈에 대한 보정 양상을 나타냈습니다. 이식 6주 후, 인간 간 줄기세포 유래 세포들이 기존의 마우스 간세포를 대체함으로써 간 구조를 재구성했습니다.

육안으로 관찰했을 때, 이식 4일 후 간 전체에 균일하게 분포된 작은 인간 간 세포 집단이 검출되었습니다. 45일째에는 이 집단들이 증식하여 큰 집단으로 성장했습니다. 여기서 보는 바와 같이, 이식 6주 후 인간 핵 및 cytokeratin 8/18 항체 염색을 통해 마우스 간 내에 인간 간세포가 존재함이 처음으로 확인되었습니다.

인간 ALB 양성이며 CK19 음성인 간세포는 기능성 간세포와 유사했으며, 인간 ALB와 CK19가 모두 양성으로 공동 염색된 세포는 간세포와 담관세포로 분화할 수 있는 이중 잠재 능력을 나타냈습니다. 뚜렷한 인간 핵과 CK8/18 발현을 보이며 간엽 주변을 둘러싸고 있는 다수의 원형 클러스터가 검출되어, 인간화된 간 내에서 인간 간 줄기세포의 콜로니 형성 능력이 입증되었습니다. 최종적으로, 이식 한 달 후 재구성률은 최대 90%에 도달했으며, 재구성된 마우스 간에서 인간 Albumin 분비가 검출되었습니다.

숙련되면 외과적 세포 이식은 적절하게 수행될 경우 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 간 손상은 보조 간으로 제한되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 세포 누출이 발생하는 경우, 세포 이식은 방지되어야 합니다.

본 절차와 더불어, 인간 세포를 이용한 in vitro 직접 리프로그래밍을 위한 유전자 형질전환과 같은 다른 방법들을 수행하여 현재의 모델과 인간 세포의 수렴성을 탐구할 수 있습니다. 이 기술이 개발된 이후, 간 질환 연구 분야의 연구자들은 인간화된 간 모델을 통해 인간의 약물 대사, 약물 간 상호작용, 간 독성 및 간염 바이러스를 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청한 후, 귀하는 간 줄기세포를 분리 및 확장하고, 간 손상을 유도하며, 비장을 통해 세포를 이식하여 인간 간 기능을 가진 키메라 마우스 모델을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

디프테리아 독소는 제어 가능하며 중요하므로, 이 절차를 수행하는 동안 심장 및 간의 괴사를 방지하는 것과 같은 주의 사항을 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.