Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

이 방법의 전반적인 목표는 관심 유전자 후보에 대한 세포 내적 기능과 세포 외적 기능을 연구하는 데 사용할 수 있는 기생생물 제브라피시 배아를 생성하는 것입니다. 이 방법은 세포 자율성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 조혈계에서 HSC 이동의 중대한 결함은 HSC 또는 틈새 미세환경에 내재

이 프로토콜의 주요 장점은 파라바이오틱 제브라피시 배아를 성공적으로 생성할 수 있는 능력이 향상되었다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 발달 중인 배아가 매우 연약하고 쉽게 손상되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 수술용 스티칭 단계는 높은 수준의 정확성과 정밀도가 필요하기 때문에 배우기 어려울 수 있으므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

여기에서는 발달 중인 포반의 외과적 융합을 통해 파라바이오틱 제브라피시 배아를 생성하는 단계별 지침을 제공합니다. 이 방법은 파라바이오틱 융합체의 효율성을 높이고 결합된 배아의 생존을 향상시키는 방법을 보여줍니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시약과 도구를 준비한 후, 분젠 버너에서 피펫 끝을 잠시 가열하여 2-3개의 수정된 파스퇴르 피펫을 준비합니다.

그런 다음 큰 집게를 사용하여 여전히 뜨거울 때 피펫 끝을 약 45도 구부립니다. 배아를 손상시킬 수 있는 날카로운 모서리가 없도록 피펫 끝을 분젠 버너 위에 1-2초 동안 올려 놓으십시오. 혈장 DNA, mRNA 또는 모르폴리노를 사용하여 채취 후 1시간 이내에 배아를 마이크로 주입하고 256 세포 단계까지 발달할 수 있도록 합니다.

배아가 256 세포 단계에 접근함에 따라 각 유전적 배경을 별도의 아가로스 코팅 접시, 긁힘이 없는 유리 비커 또는 페트리 접시로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 탈호리온한 후, 이전에 준비된 메틸셀룰로오스를 해동하고, 탁상용 원심분리기를 최대 속도로 사용하여 배아를 손상시키거나 난황을 파열시킬 수 있는 용해되지 않은 결정을 펠릿화합니다. 그 동안 마커를 사용하여 100ml 아가로스로 코팅된 페트리 접시의 바닥면에 미리 결정된 12-15개의 지점을 표시합니다.

그런 다음 원심 분리 후 메틸 셀룰로오스의 투명한 상부 분획을 사용하여 페트리 접시의 표시된 지점에 1-1.5cm 방울을 옮깁니다. 다음으로, 방금 준비한 아가로스 코팅 접시당 40ml의 고칼슘 링거 또는 HCR 용액 1개를 준비합니다. 각 분취액에 여기에 나열된 대로 항생제를 첨가하십시오.

포반 융합을 수행할 준비가 되면 HCR의 부분 표본과 항생제를 사용하여 메틸셀룰로오스 방울이 들어 있는 각 접시를 조심스럽게 채우고 방울이 방해받지 않도록 주의합니다. 이전에 준비한 수정 된 유리 파스퇴르 피펫을 10 밀리리터 피펫 펌프에 부착하십시오. 그런 다음 입체경 아래에서 각 배경에서 하나의 배아를 수집합니다.

두 개의 배아를 분배하기 전에 파스퇴르 피펫을 사용하여 메틸셀룰로오스 방울 중간에 작은 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 그런 다음 두 개의 배아를 함몰부에 넣는다. 이제 끝에 젤 로딩 팁이 있는 티징 바늘을 사용하여 배아를 직접 건드리지 않고 부드럽게 쓸어넘기는 동작을 사용하여 배아를 메틸셀룰로오스 내의 배아가 동물의 극이 서로 직접 닿도록 조심스럽게 재배치합니다.

발달 중인 배아의 방향을 적절하게 잡는 것은 배아가 어떻게 융합하고 발달할 것인지를 결정합니다. 머리와 머리를 맞대고 융합하는 경우, 각 융합체가 동물의 극에 정렬되어 있는지 확인하십시오. 메틸셀룰로오스가 배아 주변에 정착할 수 있도록 배아를 5분 동안 그대로 둡니다.

이 시간 동안 다음 쌍을 다른 드롭에 로드합니다. 수술을 수행하려면 유리 바늘 도구를 사용하여 각 배아의 접촉 지점에 조심스럽게 감습니다. 그런 다음 부드러운 꿰매는 동작으로 첫 번째 배아의 세포를 두 번째 배아로 당기고 다시 다시 잡아당깁니다.

동작이 끝나면 바늘을 2-3초 동안 제자리에 고정한 후 매우 천천히 당겨냅니다. 배아가 적절하게 꿰매어지도록 하려면 유리 바늘을 정밀하게 사용하는 것이 중요합니다. 성공적인 융합을 위해 충분한 연결을 유지하면서 난황낭을 손상시키지 않도록 주의해야 합니다.

배아를 실온에서 10-15분 동안 그대로 두십시오. 그 동안 배아 쌍을 추가로 꿰매십시오. 배양 후 배아가 붙어 있는지 평가하고 필요한 경우 상처 단계를 반복합니다.

같은 접시와 배지에 배아를 넣고 섭씨 28.5도에서 하룻밤 동안 배양을 배양합니다. 다음 날 아침쯤이면 배아는 대부분 용해된 메틸셀룰로오스에서 빠져 나올 것입니다. 성공적으로 융합되지 않은 배아를 제거합니다.

그런 다음 매체를 디캔팅하고 25ml의 E3를 사용하여 교체하십시오. 융합된 배아의 이미지를 획득하려면 0.8%low melting point 아가로스를 준비합니다. 여전히 뜨거울 때 1ml의 아가로스를 섭씨 37도의 가열 블록에 설정된 1.5ml 마이크로퓨지 튜브에 분취합니다.

배아를 포함하는 25ml의 E3 배지에 pH 7.0 트리카인 1밀리리터당 4밀리그램을 첨가하여 기생충 배아를 마취합니다. 배아가 가운데에 고이도록 접시를 부드럽게 휘젓습니다. 그런 다음 끝이 넓은 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 액체로 배아를 추출합니다.

다음으로, 피펫을 똑바로 세우고 배아를 부드럽게 튕겨 피펫의 맨 아래에 안착시킵니다. 그런 다음, 아가로스 표면의 피펫 팁을 가볍게 터치하여 배아를 저융점 아가로스의 1ml 분취액으로 옮깁니다. 피펫에서 여분의 액체를 버리고 피펫을 사용하여 아가로스의 배아를 부드럽게 혼합합니다.

그런 다음 피펫을 사용하여 아가로스와 배아를 유리 바닥 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 실체현미경 하에서 티징 바늘 끝에 부착된 젤 로딩 팁을 사용하여 배아를 커버 유리에 가깝게 이미징을 위해 원하는 방향으로 배치합니다. 아가로스가 굳고 트리카인이 함유된 배지를 웰에 첨가한 후 반전된 광시야 에피형광 레이저 스캐닝 컨포칼 또는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.

전체 배아 시야를 위해 4X 대물렌즈를 사용하십시오. 20X 대물렌즈를 사용하여 특정 조직을 이미지화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 처리합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 두 개의 배반구를 동물의 기둥이 서로 마주 보게 한 후, 배아는 접촉 지점에서 조심스럽게 상처를 입었습니다. 상처의 정도가 클수록 배아가 연결을 유지할 가능성이 높아졌고, 그 결과 추가적인 형태학적 결함이나 발달 지연 없이 성공적인 융합이 이루어졌습니다. 이 그림에서 알 수 있듯이, 두 개의 포반을 동물 극이 직접 정렬된 상태로 방향을 잡음으로써, 공유 순환을 통해 신뢰할 수 있는 머리에서 머리로 또는 난황 주머니에서 난황 낭 융합이 생성되었습니다.

대부분의 경우, 배아는 두 개의 심장이 공통의 순환을 공유하며 펌프질을 하고 있었다. 배아가 실제로 순환을 공유하는지 확인하기 위해, GFP 양성 적혈구를 가진 융합된 형질전환 배아를 mCherry 양성 혈관 내피 세포를 가진 배아에 융합했습니다. 이 영화에서 볼 수 있듯이, 수정 후 48시간까지 GFP 양성 적혈구가 Flik 1 HRAS mCherry 파트너 배아를 통해 순환하는 것이 관찰되었습니다.

마지막으로, 유전자 발현의 시간적 조절을 조사하기 위해 두 배아 중 하나에 hsp70 EGFP DNA 구조체를 주입했습니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 짧은 열 충격을 가한 후, 배아 중 하나에서 명확한 GFP 신호가 확립되었으며, 어떤 경우에는 주입되지 않은 파트너 배아에서 GFP 양성 세포가 순환하는 것이 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 두 개의 포반을 함께 꿰맬 때 주의하고 첫 번째 시도에서 수술이 성공적이지 않은 경우 융합을 다시 검토하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 라이브 셀 이미징과 같은 추가 방법을 사용하여 야생형 HSC가 돌연변이 틈새에서 정상적으로 기능할 수 있는지 또는 반대로 돌연변이 HSC가 야생형 틈새에서 기능할 수 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 제브라피시의 혈액 발달 조절을 연구할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다.

삼륜차는 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 안전 복장을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청하고 권장 기술을 따른 후 더 나은 생물 제브라피시 배아를 더 성공적으로 생성할 수 있기를 바랍니다.