Name: Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 배아의 외과적 융합을 통한 parabiotic 배아 생성 방법으로 세포 자율성과 비자율성 유전자 기능을 연구하세요. 이 기술은 발달생물학 및 혈액학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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원고에 대한 유용한 의견을 주신 Julie R. Perlin에게 감사드립니다. D.I.S.는 미국 혈액학회, Cooley's Anemia Foundation, 그리고 NIH (K01DK085217와 R03DK100672)로부터의 보조금에 의해 지원됩니다. E.J.H.는 Helen Hay Whitney Foundation의 Howard Hughes Medical Institute Fellow입니다. B.L.은 Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow입니다. B.W.B.는 Cancer Research Institute의 Irvington Fellowship과 Young Investigator에 의해 지원됩니다. ASCO의 Conquer Cancer Foundation에서 수여하는 상입니다. L.I.Z.는 NIH(R01CA103846, P01HL032262, R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute의 보조금을 지원받고 있으며, Howard Hughes Medical Institute의 연구원입니다.

이 프로토콜은 보스턴 아동 병원 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시 된 방법 (15)에서 수정됩니다. 시약 1. 준비 (사전에 일 또는 주) <ol><li> 1.5 % 아가 로스 코팅 요리를 준비합니다. 삼각 플라스크에 100 ㎖ Zebrafish의 E3 매체에 1.5 g 아가로 오스를 추가합니다. 열, 아가로 오스를 분해 한 후 약 5 ml의 100mm 직경 X 20mm 깊은 페트리 접시에 붓는다. 참고 :이 배아의 dechorionation에 사용 (3.1 단계)과 parabiotic 수술 (3.3 단계)된다. 몇 주 동안 4 ° C에서 아가 로스 코팅 요리를 저장; 냉장고 밖으로 데리고와 따뜻한 parabiotic 수술 당일의 아침을 실온으로. </li><li> 4 % 메틸 셀룰로오스를 준비합니다. 교반 막대와 함께 삼각 플라스크에 E3 100ml에 메틸 셀룰로오스 분말 4g을 녹인다. 최저 속도로 설정 4 ° C에서 교반 접시에 플라스크를 놓고는 혼합 할 수최대 2 일. <ol><li> 일시적으로 메틸 셀룰로오스의 흰색 덩어리를 헤어 주걱을 사용합니다. 메틸 셀룰로오스 결정은 완전히이 농도에서 용해되지 않습니다. 용액을 명확하게 더 흰색 덩어리가 분취 액을 장기 저장을 위해 -20 ℃에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 용액을 동결 나머지 없음으로 균질 나타나면. 주 : 메틸 셀룰로오스의 낮은 농도가 사용될 수있다; 그러나, 이러한 높은 비율은 점성 메틸 셀룰로오스가 최상의 결과를 산출 하였다. </li></ol></li><li> 높은 칼슘 벨소리 (HCR) 솔루션을 준비합니다. (5M NaCl을 8 ㎖ (116 mM의 최종), 3M KCl을 400 μL (2.9 mM의 최종), 1M HEPES의 500 염화칼슘 2 (10 최종 mM)을, 그리고 2 ㎖의 800 μl를 혼합, 5 HCR 용액 400 mL로한다 E3 미디어의 390 mL를 mM의 최종). 참고 : 몇 주 동안 4 ° C에서 보관 HCR 솔루션을; parabiotic 수술 당일의 아침을 실온으로 따뜻한. </li><li> 전송을위한 6 수정 파스퇴르 피펫 - (5) 준비포배 쌍 반지. 간단히 분젠 버너를 통해 피펫의 끝을 가열한다. 여전히 뜨거운시키면서 큰 집게를 사용하여 약 45 ° C로 피펫의 끝을 구부리. <ol><li> 배아에 손상을 약 3 초 동안 화염에 간단히 피펫의 끝을 잡고 있습니다 날카로운 모서리가 없는지 확인합니다. 이는 피펫의 끝 / 폴란드을 매끄럽게한다. 이 변형 유리 파스퇴르 피펫 아래 단계 3.5에서 10 ㎖ 피펫 펌프 (도 1)와 함께 사용된다. </li></ol></li><li> 포배 쌍 수술 봉합 용 유리 바늘 도구를 준비합니다. 제브라 피쉬 배아의 미세 주입에 대해 수행으로 3 유리 바늘 - 2 당깁니다. 나무 - 또는 플라스틱 처리 괴롭 히고 바늘 (그림 1A)의 끝 부분에 각각의 유리 바늘을 해결하기 위해 랩 필름을 사용합니다. 30 μm의 - 집게를 사용하여, 약 20의 직경의 바늘 끝을 분해. 이 단계 (그림 1B)를 안내하는 스테이지 마이크로 미터를 사용합니다. 참고 : 북동의 크기edle 팁은 중요하다. 선단이 너무 크면 정밀하게 제어하는​​ 것이 곤란해진다 과도한 손상을 일으킬 수있다. 선단이 너무 적 으면 충분히 배아 상처가 어렵다. </li></ol> 2. (주 0 일 -1) 배아의 제브라 피쉬와 컬렉션의 번식 쌍을 설정 <ol><li> 성인 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정합니다. parabiosis 수술이 실시하는 전날 밤에 물고기를 설정합니다. 남성과 여성을 구분하는 칸막이를 사용합니다. 원하는 배아를 얻을 각 행의 여러 쌍을 설정할 수 확률이 증가합니다. 쌍의 50 % 스폰 - 우리는 일반적으로 20 것을 찾을 수 있습니다. </li><li> 다음날 아침, 디바이더를 끌어와 짝짓기를 할 수 있습니다. 미세 메쉬 차 여과기를 사용하여 태아를 수집하고 E3 배아 매체 (18)를 함유하는 페트리 접시로 옮긴다. </li><li> 원하는 배아를 마이크로-주입 (예를 들어, 25 페이지의 플라스미드 DNA, 또는 1 200 페이지의 mRNA를 가진 - 6 NG의 모르 폴리 노) 컬렉션의 1 시간 이내. 에이를 허용256 세포 단계까지 성장한다. DNA의 발현 구조체는 열 충격 프로모터의 조절하에 배치되는 경우 (예를 들어, HSP70는도 4b) (이후 단계에서 37 ° C에서 parabionts 충격을 열에 의해 유전자 발현의 타이밍을 제어하는 예. 36 HPF에서 ). 주 : 형광 유전자의 대안은 형광 덱스 트란 (2 ㎎ / ㎖로 예를 들면, 덱스 트란, 캐스케이드 블루)이 DNA, RNA, 또는 모르 폴리 분사 혼합물에 첨가 될 수있다. 덱스 트란 염료 정상적인 발달을 방해하지 않으며, 주입 된 배아 parabiotic 융합 후 적절한 형광등 아래에서 확인되는 것을 허용한다. 대안 적으로, 비 착색 된 균주와 균주의 착색 parabiosis (예 AB) (예 캐스퍼) 이후 단계에서 주입 된 배아를 식별하는 데 사용될 수있다. </li><li> 주기적으로 자신의 발전을 모니터링하는 28.5 ° C.Use에서 입체경을 배아를 품어 256 셀 dev에 가까운 그들elopmental 단계 (약 2.5 HPF). 주 :. 필요한 경우 모르 주입 배아가 배치되어 있지만, parabiotic 파트너 (예를 들면, 모르 폴리 노 주입 배아 종종 비 - 주입에 비해 느린 개발 RT로 미 주입 배아 쉬프팅 사이 단 매칭을 보장하기 위해 서로 다른 온도로 배아 시프트 28.5 °에서 C 개발의 몇 시간) 후 정렬 자신의 단계에서 발생합니다. </li></ol> Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 3 세대 <ol><li> 배아가 256 세포 단계 (약 2.5 HPF)를 접근 할 때, 별도의 아가로 오스 - 코팅 요리 (모르 폴리 노에 대한 예를 들어, 하나의 접시에 각각의 유전 적 배경 (즉, 유전자 돌연변이, 유전자 변형 라인 및 / 또는 유전자 조작)에서 배아를 전송 주입 된 배아 및 제어 배아에 대한 두 번째 요리). 또한, 스크래치가없는 유리 비커, 유리 페트리 접시를 청소 배아를 전송합니다. 참고 : 배아는 플라스틱에 충실하고 자신의 chorions에서 한 번 손상으로 코팅 플라스틱 접시를 사용하지 마십시오. </li><li> (- 10 ml의 약 7) 충분한 액체가 배아를 충당하기 위해 남아 때까지 E3 미디어를 가만히 따르다. 50 밀리그램 / 스트렙토 griseus의 (단백질 분해 효소)의 세포 외액에서 분리 된 단백질 분해 효소 ml의 혼합물 200 μl를 추가합니다. 부드럽게 배아 분마다 몇 소용돌이 친다. <ol><li> 배아의 50 %는 일반적으로 5 소요 자신의 chorions, 나올 때 - 신선한 E3 배아 매체의 - (20 ㎖ 약 15) 10 분, 관대 한 부피로 세 번 씻어. <ol><li> 부드럽게를 밝혀 부드럽게 한 후 수정 된 유리 파스퇴르 피펫으로 그들을 그리기에 의해 자신의 chorions에 남아있는 배아를 Dechorionate. 배아는 dechorionated 세척 한 후, HCR 용액으로 E3 미디어를 교체합니다. 단백질 분해 효소에 대한 대안으로, 수동으로 미세 집게를 사용하여 chorions를 제거합니다. 100 dechor - 60을 목표로각 실험 조건에 사용할 수 ionated 배아. 참고 :이 궁극적으로 사용될 것보다 배 더 여러 가지이지만, 많은 배아는 취급 또는 parabiosis에 대한 수술 중 손상 될 가능성이 높다. 배아는 dechorionated되면, 그들이 침수 유지하고 표면 장력이 그들을 파괴하는 원인이됩니다 그들에게, 물의 표면을 터치하는 것을 허용하지 않습니다. 단백질 분해 효소의 높은 복용량을 사용하여 배아 빨리 자신의 chorions에서 그리고 더 동기화 된 방식으로 제공 할 수 있음을 유의하십시오. 단백질 분해 효소의 낮은 복용량을 사용하는 경우, 배아는 chorions에서 등장하는 데 시간이 오래 걸릴 및 단백질 분해 효소에 장기간 노출에 의해 손상되는 배아의 일부 발생할 수 있습니다 덜 동기 방식에서 이렇게. </li></ol></li></ol></li><li> 배아를 손상 시키거나 자신의 노른자를 파열 것이다 용해되지 않은 결정을 펠렛 10 분 동안 최대 속도에 탁상 원심 분리기에서 (위의 단계 1.2에서 만든) 메틸 원심 분리기를 해동에스. <ol><li> 원심 분리 후, 투명한 상부 분획 (용적의 약 75 %)를 사용한다. 전송 - 1을 1.5 % 아가 로스 코팅 페트리 접시에 메틸 셀룰로오스 1.5 cm 직경 방울. 튜브의 바닥에서 펠렛 결정 중 하나를 그리기 않도록주의하십시오. </li><li> 접시의 바닥면 각 액체 방울의 위치를​​ 미리 결정 마커를 사용한다. 100mm 직경 페트리 접시 당 메틸 셀룰로오스 - (3 분취 &#39;가치 2) 15 방울 - 12 놓습니다. 실험에 따라 필요한만큼 접시를 준비합니다. 참고 : 하나의 포배 쌍의 융합에 대한 각각의 방울을 사용합니다. 마크는 미디어가 부가로되어있는 점 방울 거의 보이지 않게되면 각 방울의 위치를​​ 지정합니다. </li></ol></li><li> 단계 3.3에서 상기 제조 된 아가로 오스 - 코팅 접시 당 항생제 보충 HCR 솔루션 중 하나를 40 ml의 분취 량을 준비합니다. HCR 각각 40 ml의 분취 량 0.5 μg의 50 U / ㎖, 50 U / ㎖의 앰피 실린, 카나마이신에 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가/ ㎖. <ol><li> 준비 포배 융합체를 수행 할 때는 신중 항생제 첨가 HCR 용액 40 ㎖로 메틸 셀룰로오스 방울을 함유하는 접시의 각 채운다. HCR 용액을 너무 빨리 첨가하면 방울을 방해 할 수있다. </li></ol></li><li> 10 ml를 피펫 펌프 (위의 단계 1.4에서 만든) 수정 유리 파스퇴르 피펫을 연결합니다. 입체경에서 각각의 배경 (예를 들어, 하나의 모르 폴리 노 주입 배아 한 야생 형 배아)에서 한 dechorionated 배아를 수집합니다. <ol><li> 두 태아 분배 전에 부드럽게이어서, 메틸 셀룰로오스 강하의 중간에 작은 오목 있도록 파스퇴르 피펫을 사용하여 오목 부에 모두 배아 증착. 참고 이어질 수있는 피펫의 상단 또는 하단의 액체의 표면과 그 결정 연락 (피하도록 전사 과정에서 약간 위쪽으로 배아 파스퇴르 피펫의 굴곡에 정착되도록 파스퇴르 피펫 차례 파묻혀에R 파열). </li></ol></li><li> 자신의 동물 극은 직접적 즉시 메틸 셀룰로오스로 배아를 증착 한 후, 조심스럽게 메틸 셀룰로오스에서 배아의 위치를 변경하는 말 (그림 1A)에 젤 로딩 피펫 팁으로 나무 - 또는 플라스틱 처리 괴롭 히고 바늘을 사용하도록 서로를 만지고. <ol><li> 직접 건드리지 않고 그 위치를 변경하기 위해 배아로 메틸 셀룰로오스 가까이를 통해 부드러운 청소 동작을 활용합니다. 메틸 셀룰로오스가 그들 주위에 정착 할 수 있도록 배아가 5 분 동안 앉아 보자. 이 기간 동안, 다른 드롭으로 다음 쌍을로드합니다. 참고 : 배아와 직접 접촉을 피하고 쉽게 파열 될 난황의 어떤 부분을 건드리지 않도록 특별한주의를 기울입니다. </li></ol></li><li> 유리 바늘 도구를 사용하여 조심스럽게 접촉 그 지점에서 각각의 배아 상처. 부드러운 봉제 운동으로, 최초의 배아에서 세포는 다시 다음 두 번째 배아에 들어갔습니다 될 수 있습니다.이 운동의 끝에서, 2 곳의 바늘을 잡고 - 3 초 후 아주 천천히 떨어져립니다. 참고 : 약 2의 기간이 있습니다 - 두 조직이 더 접착제 서로에 연결할 가능성이있을 것으로 보인다 곳 배아가 부상 후 3 초. 따라서, 우리는 간단히 부상 후 자리에 바늘을 유지하는 것은 바로 부상 후 시간의 초기 기간 동안 접촉 각 배아의 상처 조직을 유지하는 데 도움이 있다고 생각합니다. </li><li> RT에서 15 분 -이 배아가 10 앉아서 할 수 있습니다. 한편, 메틸 셀룰로오스의 다른 방울의 새로운 쌍을 스티치로 진행합니다. 10 후 - 15 분, 첫 번째 쌍은 첨부 (그림 2A)을 유지하고 있는지 여부를 평가합니다. 참고 : 배아가 더 이상 연결된 경우, 한 배아가 30 % epiboly 무대 주위 세 미만으로의 봉합 과정을 반복합니다. 세 번까지 함께 배아를 스티치하는 일반적이 있습니다. 배아는 첨부하지만 C를 유지 한 것으로 나타날 경우통해서만 이루어진다없는 충실이를 강화하는 연결 가장자리 부가 봉합을 수행한다. 진동 또는 parabiotic 수술과 배양 기간 동안 요리를 이동하지 마십시오. 참고 : 자신의 초기 발달 단계 및 인식 취약성에도 불구하고, 배아의 세포 대중 조작의 상당한 양 (즉, 상처와 스티치)을 허용하고, 정상적으로 개발할 수 있습니다. 노른자는, 그러나, 배아를 죽이는 만 조금 터치 파열 할 수 있습니다. 유리 바늘 두 blastulae 스티치 때 각 배아 균체 및 난황의 계면에 접촉하게하지 않는다. </li><li> 같은 요리와 미디어 (미디어를 변경하지 마십시오)에서 28.5 ° C에서 배아 O / N을 품어. 다음 아침, 배아는 대부분 용해 메틸 셀룰로오스 방울 밖으로 이동 한 것입니다. 성공적으로 융합되지 않은 모든 배아를 제거합니다. 미디어를 가만히 따르다하고 신선한 25 ml의 E3로 교체합니다. 참고 : 작업하는 경우착색 균주 염색을 차단하는 0.003 %의 최종 농도로 500 ㎕를 0.15 % (50X) 페닐 티오 (PTU)를 추가한다. 배아 착색 억제를 유지 PTU 연속적으로 유지해야한다. </li></ol> 4. 현미경 설정, 이미지 획득, 처리 및 분석 <ol><li> 0.8 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스를 준비 : 완전히 용해 될 때까지 0.8 g 아가로 오스 100 ㎖ E3에 LMP와 열을 추가합니다. 뜨거운 반면, 나누어지는 아가로 오스 37 ° C 가열 블록에 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 LMP 1 ㎖. LMP 아가로 오스는 37 ℃에서 용융 유지됩니다. 아가로 오스 37 ° C에서 4 ㎎ / ㎖ (25 배), pH를 LMP 각각 1 ml의 분취 7.0 tricaine의 40 μl를 추가합니다. 참고 : 색소 변형 작업을 각각 1ml를 나누어 0.15 % (50 배) PTU의 20 μl를 추가합니다. <ol><li> 4 ℃에서 밀봉 된 50 ㎖ 튜브에 몇 달 동안 나머지 LMP 아가로 오스를 저장합니다. </li></ol></li><li> parabiotic 배아 마취 4 ㎎ / ㎖ 1 ㎖ (25 배), pH를 7.0 tricaine 추가하여 묘화 될E3의 25 ml의 배아는 이미 있음. </li><li> 배아가 중간​​에 풀 수 있도록 조심스럽게 접시를 소용돌이 친다. 그런 다음, 넓은 만들어진 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 가능한 한 작은 액체의 배아를 그립니다. 똑바로 피펫을 켜고 그들이 피펫의 맨 아래에 정착되도록 부드럽게 배아를 반송. <ol><li> 피펫 아래쪽의 배아 가볍게 아가의 표면에 피펫 팁을 터치하여 LMP 아가 로스의 1 mL의 분취 량으로 옮긴다. 아가로 오스를 희석 것이로 물기를 전송하지 마십시오. </li></ol></li><li> 피펫으로부터 과량의 액체를 배출하기 후에 부드럽게 6- 후, 아가로 오스에서 배아를 혼합 유리 바닥 웰 (제 1.5 커버 슬립)로 오스 및 배아를 모두 전송하기 위해 피펫을 사용하여 피펫을 사용하여 웰 플레이트. 참고 : 이미징 플레이트에 배아를 전송 한 후 피펫을 폐기해야합니다. 잔류 아가로 오스는 피펫 내부 설정하며, rendering는 추가 사용에 대한 효과. 오히려 새로운 피펫 때마다 사용합니다. </li><li> 입체경에서 아래로 커버 유리를 향해 배아의 위치를​​ 나무 손잡이 괴롭 히고 바늘의 끝 부분에 고정 된 겔 로딩 피펫 팁을 사용 (그들은 현미경 목적의 작동 거리 내에있는 보장)하고 원하는 방향으로 이미징. 참고 : 아가로 오스가 완전히 설정 될 때까지 지속적으로 위치를 조정합니다. 한 쌍의 어떤 배아에 따라 parabiotic 배아를 장착하는데주의를 기울여야하는 것은 몇 군데한다. 결합 된 배아의 임의의 방향을 감안할 때, 일부 쌍을 위해 모두 배아 이미지 어려울 수 있습니다. 이 경우, 겸자 넓은 만들어진 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 아가로 오스로부터 배아를 복구하고 다른 관점에서 이미징 마운트. </li><li> tricaine (과 PTU 필요한 경우)로 보충 E3의 3 ㎖ - 아가로 오스가 설정되면, 2 다룹니다. </li><li> 라스를 거꾸로 넓은 필드 에피 형광을 사용하여 이미지 배아공 초점을 어 - 스캔 또는 디스크 공 초점 현미경을 회전합니다. 원하는 이미지에 가장 적합한 목표를 선택합니다. 보기의 전체 배아 필드를 들어, 4 배 목표를 사용합니다. 이미지 같은 20 배 대물 같은 특정 조직 (16), (19) 높은 배율을 선택한다. 참고 : 직립 현미경을 사용하는 경우, 유리 커버 슬립에 (위 유사) LMP 아가로 오스에 탑재합니다. 같은 E3-tricaine - PTU 16, 19로 채워진 진공 그리스의 링이 유리 현미경 슬라이드에 유리 커버 슬립을 반전. </li><li> 공정은 NIH 이미지 J / 피지 16 19 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 획득. 참고 : 세포 수를 계산 및 세포 이동 및 세포 분열이 분할을 사용하여 알고리즘 (16), (19)를 추적하는 등의 역 동성을 정량화. </li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Parabiotic 융합은 성인 쥐 모델과 병아리 배아 10-14에서 후보 유전자의 세포 기능을 조사하는 강력한 도구왔다. 더 최근, 포배 융합 방법 연결형 제브라 배아 15를 생성하기위한 설명되었다. 본 프로토콜에서는, 비디오 기반 자습서 보여 더 나은 조혈 개발에 대한 관심의 후보 유전자의 시간적 세포 고유하고, 세포 외부의 역할을 연구하기 위해 서로 다른 유전 적 배경 parabiotic 제브라 피쉬 배아를 만들기위한 방법을 설명하는 데 사용되는 이후. 이 논문에 기술 된 방법은 최근 서로 다른 유전 적 배경의 배아, 이후 생착 및 분화 16, 하나의 배아 혈액 순환을 통해 마이그레이션을 HSC의 출현을 추적하는 데 사용되었다. Kissa 그룹의 조사 결과, 준비 및 배아의 위치와 일치 성공률을 결정하기 위해 발견그리고 parabiotic 융합의 해부학 적 특성. 프로토콜에 대한 몇 가지 주요 변경으로 parab...

야생 형 및 유전자 변형 동물 사이의 유전 적 모자이크 (키메라)의 생성은 세포 고유의 후보 유전자 1-6의 세포 외부 기능에 대 조사하는 잘 설립하고 고전적인 전략이다. 제브라 피쉬의 포배 이식 널리 세포 자율성 7-9의 연구를위한 키메라 배아를 생성하는 데 이용되고있다. 관심있는 조직에 따라, 그러나, 예측 원하는 조직 (예컨대, 혈액) 1-3, 7-9에 공여 세포를 대상으로 어려울 수있다. 마우스 유전 학자 긴 공유 순환 10-14으로 결합 된 유기체를 생성하는 parabiotic 수술 방법을 이용했다. parabiotic 동물이 공통의 혈류를 공유하기 때문에, 다른 유전 적 배경의 다른 동물의 세포 하나의 동물에서 유래 세포 사이의 상호 작용은 10 ~ 16를 공부하실 수 있습니다. 최근, 카 리마 Kissa의 그룹은 우아하게 CRE 할 수있는 능력을 입증결합 된 제브라 피쉬 배아를 먹은 후 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 마이그레이션 (15)을 연구하기 위해이 시스템을 사용합니다. 또한, 피쉬 parabiosis 최근 조혈 줄기 세포 (HSC) 출현 이전 16 내피 헤린 (5)의 역할을 조사하고 제브라 개발 17 중 HSPC 틈새 간질 세포의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 마우스와 달리, 제브라 피쉬 배아 투명 시스템 고유 강력하게 parabiotic 발달 동안 세포의 직접적인 시각화를 허용한다. 제브라 피쉬의 parabiosis의 유틸리티는, 그러나, 자세한 지침 및 시각적 데모없이 기술적으로 어려울 수 있습니다 섬세한 배아에 가파른 학습 곡선, 그리고 parabiotic 수술에 의해 제한된다. 이 프로토콜의 목표는 공부에 대한 parabiotic 제브라 피쉬의 배아를 생성하는 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반 명확하고 단계별 지침 세트를 제공하는 것입니다시간, 셀 고유 또는 blastulae 개발 수술 융착 후보 유전자 (들)의 세포 외부 기능한다. 주요 수정 및 증가 parabiont의 생존과 새로운 실험 응용 프로그램에 대한 추가 권장 사항이 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>메틸 셀룰로오스</td><td>시그마</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>E3/HCR용 개별 구성 요소:</td><td></td> <td>1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl(염화나트륨)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl(염화칼륨)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (염화칼슘 이수화물)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4(황산마그네슘 헵타하이드레이트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M) 완충 용액</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog 번호</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco by Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin sodium salt</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td></td>의 프로나제 11459643001 <td></td></tr><tr><td>바늘에 사용되는 모세관 유리(Capillary Glass & 필라멘트)</td><td>셔터 기기</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>나무 손잡이가 있는 티징 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10ml 피펫 펌프(녹색) (피펫 펌프 피펫터)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>직경 100mm/ 깊이 20mm의 플라스틱 페트리 접시(PETRI 접시, 100/20MM, PS, CLEAR, 통풍구 포함, HEAVY DESIGN, 15개/봉지)</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000MW, 음이온성, 라이신 고정성</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. 작업 재고는 0.003%(50x는 0.15%)입니다. 500ml의 경우 0.75g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 (분말) (트리카인 메탄 설포나토, 트리카인 -S)</td> <td>웨스턴 케미컬 Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP 아가 로스 (초순수 LMP 아가 로스)</td> <td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 전사 피펫 (내가 생각하기에 넓은 끝)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>이미징에 사용되는 유리 바닥 6 웰 플레이트</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>나무 손잡이 해부 바늘 끝에 고정된 플라스틱 웨스턴 젤 로딩 팁(GELoader 팁)</td><td></td>Upright 현미경에 장착하는 <td>경우 Eppendorf</td> 22351656 <td></td></tr><tr><td>Glass 커버 슬립, 슬라이드 및 진공 그리스:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스(Dow Corning® reg; 고진공 실리콘 그리스 무색, 무게 5.3oz(튜브)) Dow</td> <td>Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Glass 커버 슬립</td><td>코닝 생명과학</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

blastulae 개발의 외과 융합에 의해 parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

다른 유전 적 배경이 동물의 수술 parabiosis는 세포 고유의 독특한 유전 적 설정에서 후보의 관심의 유전자, 세포의 철새 행동 및 분비 신호에 대한 세포 외부의 역할 비교 연구하는 독특한 시나리오를 작성합니다. parabiotic 동물이 공통의 순환을 공유하기 때문에, 하나의 동물에서 어떤 혈액 또는 혈액 매개 인자는 파트너와 그 반대의 경우도 마찬가지 교환 해주는 서비스입니다. 따라서, 하나의 유전 적 배경으로부터 유래 세포 및 분자 요인 제 유전 적 배경과 관련하여 연구 될 수있다. 성인 쥐 Parabiosis는 연구 노화, 암, 당뇨병, 비만, 뇌 발달에 광범위하게 사용되어왔다. 최근 제브라 피쉬 배아의 parabiosis는 조혈의 발달 생물학을 연구하는 데 사용되었습니다. 마우스와 대조적으로, 제브라 피쉬 배아의 투명한 성질은 F를 조사하기위한 고유 강력한 방법 만드는 parabiotic 맥락에서 세포의 직접적인 시각화를 허용undamental 세포 및 분자 메커니즘. 이 방법의 유용성은, 그러나, parabiotic 제브라 피쉬 배아 발생 가파른 학습 곡선에 의해 제한된다. 이 프로토콜은 관심의 후보 유전자의 역할을 조사하기 위해 서로 다른 유전 적 배경이 제브라 배아 blastulae 융합 수술 방법에 대한 단계적인 방법을 제공한다. 또한, 상기 제브라 parabiotic 배아 가능한 유전자 발현의 시간적 제어하게 열충격 내성이다. 이 방법은 복잡한 셋업이 필요하며 배아 개발하는 동안 생체 내에서 세포 이동, 운명 사양 및 분화 연구를위한 다양한 응용 프로그램을 가지고 있지 않습니다.

이전에 발표 된 연구 (15)과 일치, 제브라 피쉬 배아의 성공적인 parabiotic 융합 준비와 방향 두 개의 배아 및 메틸의 농도에 따라 달라집니다. 몇 가지 간단한으로 저렴한 도구는 수술 융합 개발 blastulae 공유 순환 parabiotic 배아로 성장이 발생했다. 이 도구는 수정 된 파스퇴르 피펫, 10 ml를 피펫 펌프, 단독 또는 실험실 필름에 의해 단부에 고정 겔 로딩 팁 또는 유리 미세 주사 바늘 (그림 1)과 중 사용 된 목재 처리 괴롭 히고 바늘을 포함했다. 4 % 메틸 셀룰로오스에 두 blastulae을 배치하고 서로 (그림 2A)을 마주 보는 그들의 동물 극로 방향을 젤 로딩 팁을 사용 후, 배아는 신중하게 유리 마이크로 인젝션 N과의 접촉 자신의 지점...

이 프로토콜은 서로 다른 유전적 배경을 가진 기생충 제브라피시 배아를 생성하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 제브라피시 배아의 탁월한 이미징 기능과 결합하면 이 방법은 관심 후보 유전자에 대한 세포 자율 기능과 비세포 자율 기능을 조사할 수 있는 독특하고 강력한 수단을 제공합니다.

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

이 방법의 전반적인 목표는 파라바이오틱(parabiotic) 제브라피쉬 배아를 생성하여, 관심 있는 후보 유전자의 세포 내적 기능 대 세포 외적 기능을 연구하는 것입니다. 이 방법은 세포 자율성에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 조혈 시스템에서 HSC 이동의 치명적인 결함이 HSC 자체의 내재적 문제인지 아니면 니치 미세환경의 문제인지를 확인할 수 있습니다.이 프로토콜의 주요 장점은 파라바이오틱(parabiotic) 제브라피시 배아를 성공적으로 생성하는 능력이 향상된다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 발달 중인 배아가 매우 취약하여 쉽게 손상되기 때문입니다. 수술적 봉합 단계는 높은 수준의 정확성과 정밀도를 요구하므로 학습하기 어려울 수 있어, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.본 과정에서는 발달 중인 포배기를 외과적으로 융합하여 파라바이오틱(parabiotic) 제브라피쉬 배아를 생성하는 단계별 지침을 제공합니다. 이 방법은 파라바이오틱 융합의 효율성을 높이고 결합된 배아의 생존율을 향상시키는 방법을 보여줍니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시약과 도구를 준비한 후, 분젠 버너 위에서 파스퇴르 피펫의 끝부분을 짧게 가열하여 2~3개의 수정된 파스퇴르 피펫을 준비하십시오.그다음, 피펫이 여전히 뜨거울 때 대형 포셉을 사용하여 피펫 끝을 약 45도 각도로 구부립니다. 배아에 손상을 줄 수 있는 날카로운 모서리가 없는지 확인하기 위해, 피펫 끝을 분젠 버너 위에 1~2초 동안 둡니다. 플라스마 DNA, mRNA 또는 morpholino를 사용하여 수집 후 1시간 이내에 배아에 미세주입하고, 256세포기까지 발달하도록 둡니다.배아가 256 세포기에 도달하면, 각 유전적 배경의 배아를 각각 별도의 아가로스 코팅 접시, 스크래치가 없는 유리 비커 또는 페트리 접시로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아의 난막을 제거한 후, 미리 준비한 메틸셀룰로스를 해동하고, 테이블탑 원심분리기를 최대 속도로 사용하여 녹지 않은 결정들을 펠릿화합니다. 이러한 결정들은 배아에 손상을 주거나 난황을 파열시킬 수 있습니다. 그동안 마커를 사용하여 100 mL 아가로스 코팅 페트리 접시 바닥면에 미리 정해둔 12~15개의 지점을 표시합니다.그 다음, 원심분리 후 메틸셀룰로오스의 투명한 상층액을 사용하여, 페트리 접시의 표시된 지점에 1.5 centimeter 크기의 방울을 하나씩 옮깁니다. 다음으로, 방금 준비한 아가로스 코팅 접시당 40 milliliter의 고칼슘 링거액(high-calcium ringer, HCR 용액) 분주액을 준비합니다. 각 분주액에 여기에 나열된 항생제를 첨가합니다.포배기 융합을 수행할 준비가 되면, 항생제가 포함된 HCR 분주액을 사용하여 메틸셀룰로오스 액적이 담긴 각 접시를 조심스럽게 채우되, 액적이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 이전에 준비한 변형 유리 파스퇴르 피펫을 10 milliliter 피펫 펌프에 연결하십시오. 그런 다음, 실체현미경 하에서 각 배경군으로부터 난막이 제거된 배아를 하나씩 수집하십시오.두 배아를 분주하기 전에, 파스퇴르 피펫을 사용하여 메틸셀룰로오스 방울 중앙에 작은 홈을 만듭니다. 그런 다음, 그 홈 안에 두 배아를 놓습니다. 이제 끝에 겔 로딩 팁이 달린 티징 니들을 사용하여 배아에 직접 닿지 않도록 조심스럽게 쓰는 동작으로 메틸셀룰로오스 내에서 배아의 위치를 조정하여, 두 배아의 동물극이 서로 직접 맞닿게 합니다.발달 중인 배아를 적절하게 정렬하는 것은 배아가 어떻게 융합되고 발달할지를 결정합니다. 머리와 머리가 맞닿는 융합의 경우, 각 융합 부위가 동물극에서 정렬되었는지 확인하십시오. 메틸셀룰로오스가 배아 주변으로 가라앉을 수 있도록 5분 동안 그대로 둡니다.이 시간 동안, 다음 쌍을 다른 방울에 로딩하십시오. 수술을 수행하려면 유리 바늘 도구를 사용하여 각 배아의 접촉 지점에 조심스럽게 상처를 냅니다. 그런 다음, 부드럽게 꿰매는 동작으로 첫 번째 배아의 세포를 두 번째 배아로 끌어당겼다가 다시 원래대로 되돌립니다.동작이 끝난 후, 바늘을 2~3초 동안 그대로 유지한 다음 매우 천천히 제거하십시오. 배아가 적절하게 결합되도록 하기 위해서는 유리 바늘을 정밀하게 조작하는 것이 매우 중요합니다. 성공적인 융합을 위해 충분한 연결 상태를 유지하면서도 난황낭이 손상되지 않도록 주의해야 합니다.배아를 상온에서 10~15분 동안 그대로 둡니다. 그동안 추가 배아 쌍을 봉합합니다. 배양 후 배아가 계속 부착되어 있는지 확인하고, 필요한 경우 상처 유발 단계를 반복합니다.배아를 동일한 디쉬와 배지에서 28.5 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침이면 배아들이 대부분 용해된 메틸셀룰로스 밖으로 이동해 있을 것입니다. 성공적으로 융합되지 않은 배아는 모두 제거하십시오.그 다음, 배지를 따라내고 25 milliliters의 E3로 교체합니다. 융합된 배아의 이미지를 얻기 위해 0.8% 저융점 아가로스(low melting point agarose)를 준비합니다. 아가로스가 뜨거울 때, 37 degree Celsius 가열 블록에 배치된 1.5 milliliter 마이크로 튜브에 1 milliliter씩 분주합니다.배아가 들어 있는 25 mL의 E3 배지에 4 mg/mL pH 7.0 tricaine 1 mL를 첨가하여 파라바이오틱(parabiotic) 배아를 마취시킵니다. 배아가 중앙으로 모이도록 접시를 살살 흔들어 줍니다. 그런 다음, 끝이 넓은 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 액체를 최소한으로 포함하여 배아를 빨아들입니다.다음으로, 피펫을 수직으로 세우고 배아를 가볍게 튕겨 피펫의 맨 바닥에 가라앉도록 합니다. 그런 다음, 피펫 팁을 저융점 아가로스 표면에 가볍게 접촉시켜 배아를 1 milliliter의 저융점 아가로스 분주액으로 옮깁니다. 피펫에 남은 과잉 액체는 제거하고, 피펫을 사용하여 아가로스 내의 배아를 부드럽게 혼합합니다.그다음, 피펫을 사용하여 아가로스와 배아를 유리 바닥 6-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 실체 현미경 하에서, 티징 니들 끝에 부착된 겔 로딩 팁을 사용하여 배아를 커버 글라스에 가깝게 위치시키고 이미징에 원하는 방향으로 조정합니다. 아가로스가 굳고 트리케인이 포함된 배지를 웰에 추가한 후, 도립 광시야 에피형광 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.배아 전체 시야를 관찰하려면 4X 대상을 사용하십시오. 특정 조직을 촬영하려면 20X 대상을 사용하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 처리하십시오.여기에서 보여주는 바와 같이, 두 포배의 동물극이 서로 마주 보게 배치한 후, 접촉 지점에서 배아에 조심스럽게 상처를 냈습니다. 상처의 정도가 클수록 추가적인 형태학적 결함이나 발달 지연 없이 성공적인 융합으로 이어지는 배아 간 연결 유지 가능성이 높아졌습니다. 이 그림에서 입증된 것처럼, 두 포배의 동물극을 직접 정렬하여 배치함으로써, 혈액 순환을 공유하는 안정적인 머리-머리 또는 난황낭-난황낭 융합체가 생성되었습니다.대부분의 경우, 배아는 공통의 순환계를 공유하며 펌핑하는 두 개의 심장을 가지고 있었습니다. 배아들이 실제로 순환계를 공유하고 있는지 확인하기 위해, GFP 양성 적혈구를 가진 형질전환 융합 배아를 mCherry 양성 혈관 내피 세포를 가진 배아와 융합시켰습니다. 본 영상에서 볼 수 있듯이, 수정 후 48시간이 되었을 때 GFP 양성 적혈구가 Flik 1 HRAS mCherry 파트너 배아를 통해 순환하는 것이 관찰되었습니다.마지막으로, 유전자 발현의 시간적 제어를 조사하기 위해 두 배아 중 하나에 hsp70 EGFP DNA 컨스트럭트를 주입하였습니다. 37 °C에서 30분 동안 짧게 열 충격을 가한 후, 배아 중 하나에서 명확한 GFP 신호가 형성되었으며, 일부 사례에서는 GFP 양성 세포가 주입되지 않은 상대 배아 내에서 순환하는 것이 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때 두 개의 포배를 함께 봉합하는 과정에서 주의를 기울이는 것이 중요하며, 첫 번째 시도에서 수술이 성공하지 않았다면 융합 과정을 다시 검토해야 합니다. 이 절차 이후에는 살아있는 세포 이미징과 같은 추가 방법을 사용하여, 야생형 HSC가 돌연변이 틈새(niche)에서 정상적으로 기능할 수 있는지, 또는 반대로 돌연변이 HSC가 야생형 틈새에서 기능할 수 있는지와 같은 추가적인 의문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 제브라피시의 혈액 발달 조절을 연구하는 데 있어 강력한 방법을 제공합니다.tricaince는 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 안전 복장을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청하고 권장 기술을 따름으로써, 더 성공적으로 더 우수한 생물학적 제브라피시 배아를 생성하실 수 있기를 바랍니다.

generation-parabiotic-zebrafish-embryos-surgical-fusion-developing

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

Zebrafish 세포 이식은 조직 특정 chimeras를 생성하는 유전 발생학의 조합이 가능합니다. 이 비디오는 gastrula 우리 연구실은 forebrain의 접합면의 형성 중에 astroglial 인구와 구체적인지도 단서의 역할을 조사하기 위해 허용해야 세포 transplantations를 개최 보여줍니다.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

이 비디오는 저융점 아가로스를 사용하여 6웰 플레이트에 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대한 단계별 지침을 설명합니다. 또한 살아있는 배아의 이미지를 획득하고 소프트웨어를 사용하여 분석하는 프로세스를 제공합니다.

한천 장착(Agar Mounting): 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 기본 방법

제브라피쉬는 고등 척추동물과의 유전적 유사성으로 인해 발생 생물학 및 인간 질병 연구를 위한 강력한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 초기 배발생에 필수적인 유전자의 열성 돌연변이를 식별하기 위한 전방 스크리닝 전략에 활용할 수 있는 반수체 제브라피시 배아를 만드는 방법론을 설명합니다.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

제브라피쉬는 유전 및 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 비드 이식은 국소 세포 환경에 변화를 일으켜 발달 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 귀중한 조직 조작 기술입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 마이크로비드 이식을 수행하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

세포의 해출 및 이식과 같은 배아 조작은 초기 발달을 연구하기 위한 중요한 도구입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 이러한 조작을 수행하기 위해 간단하고 효과적인 이식 장치를 설명합니다.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

Zebrafish blastoderm explant는 초기 배아 내내 내인성 신호 센터에서 배아 세포를 분리하여 생성되며, 상대적으로 순진한 세포 클러스터를 쉽게 조작하고 배양하여 ex vivo를배양한다. 이 문서에서는 이러한 각질에 대한 지침을 제공하고 위장 중에 Nodal 신호에 대한 역할을 심문하여 유용성을 입증합니다.

제브라피시 배아에서 나이브 Blastoderm 의 세대

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

배우세요 제브라피쉬 배아의 외과적 융합을 통한 parabiotic 배아 생성 방법으로 세포 자율성과 비자율성 유전자 기능을 연구하세요. 이 기술은 발달생물학 및 혈액학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

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