사용하여 셀 - 무료 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 Xenopus 난자와 배아 추출물을 사용하여 큰 핵의 크기가 감소하는 분석법을 구축하는 것입니다. 이 방법은 핵 크기를 조절하는 메커니즘은 무엇인가와 같은 핵 세포 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Xenopus 무세포 추출물의 조성과 활성을 쉽게 조작하여 핵 크기에 관한 사실들을 평가할 수 있다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 Xenopus 난자 추출물, 탈막 정자 및 조립된 핵을 준비한 후, 개구리를 유리 재사용 페트리 접시 위에 올려놓아 갓 산란된 난자를 수집합니다. 배설강 근처의 하부 등 부분에 가벼운 압력을 가하여 산란을 촉진합니다. 접시를 약 45도 각도로 기울여 난자가 접시 가장자리를 따라 모이도록 합니다.

그 다음, 과량의 완충액을 제거하고 알이 겨우 잠길 정도의 1/3 X MMR을 첨가합니다. 1.5 milliliter 튜브에 500 microliters의 고염 Modified Barth's Saline(MBS)을 넣고, 밀착되는 페스틀을 사용하여 정소의 1/4 분량을 마쇄 및 균질화합니다. 그런 다음 마쇄된 정소를 알에 넣고 상온에서 15분 동안 수정이 일어나도록 둡니다.

배양 후, 알에 1/3 X MMR을 가득 채웁니다. 그런 다음 5~10분 후에, 어두운 색소의 동물극이 수축하는지 확인하고 배아의 동물극이 위를 향하도록 회전시켜 수정 여부를 확인합니다. 광구 플라스틱 피펫을 사용하여 죽었거나 용해된 알, 또는 수정되지 않았거나 분할되지 않은 알을 꼼꼼하게 제거하십시오. 이러한 알들은 주변 배아의 사망을 빠르게 유도하기 때문입니다.

수정 후 1시간에서 2.5시간 사이에 pH 7.9로 조정된 1/3 X MMR에 용해된 2~3% cysteine을 사용하여 배아의 젤 막을 제거합니다. 젤 제거 전의 배아는 상대적으로 큰 부피를 차지합니다. 버퍼 교체를 3~4분씩 두 차례 수행합니다.

그 후, 시스테인의 모든 흔적을 제거하기 위해 1/3 X MMR을 6~10회 짧게 교체하며 배아를 철저히 세척합니다. 난막 제거 후 배아들은 서로 밀착되어 상대적으로 작은 부피를 차지하게 됩니다. 다음으로, 광구경 유리 피펫을 사용하여 건강하게 수정된 배아를 신선한 1/3 X MMR이 담긴 페트리 접시로 옮깁니다.

실온에서 배아를 원하는 단계까지 발달시킵니다. 첫 번째 분열이 일어나지 않거나 하얗고 부풀어 오른 모습으로 나타나는 죽거나 용해된 배아를 계속해서 제거하십시오. 배아가 11.5에서 12단계에 도달하면, 0.5 mM cycloheximide가 첨가된 신선한 1/3 X MMR로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양하여 간기 후기에 정지시킵니다.

입구가 넓은 유리 또는 플라스틱 피펫을 사용하여, 최소 15개의 중기 정지 배아를 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 1 µL의 LPC 스톡이 첨가된 1 mL의 난자 용해 완충액(egg lysis buffer, ELB)을 배아에 추가합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 배아를 세척합니다.

그런 다음 배아가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 기다립니다. 버퍼를 제거하기 전, 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 배아를 500 µL의 ELB와 0.5 µL의 LPC stock, 5 µL의 19.7 mM cycloheximide, 그리고 액틴 중합을 억제하기 위한 5 µL의 35.5 mM cytochalasin D가 혼합된 용액에 다시 현탁합니다.

탁상 원심분리기를 사용하여 샘플을 200 ×g에서 1분 동안 원심분리한 후, 과량의 버퍼를 제거하고 막자로 배아를 완전히 분쇄합니다. 분쇄된 샘플을 스윙 버킷 로터에 넣고 10,000 ×g, 16 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 200 µL 피펫 팁으로 상단의 지질층을 뚫고, 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 중간의 황색 세포질 층을 적절한 크기의 튜브로 옮깁니다.

배아 추출물에 다음 시약들을 첨가하십시오. 그 다음, 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 스쿼시(squash) 표본을 제작하여 추출물 내의 내인성 배아 핵을 확인한 후, 여기에 나열된 시약들이 포함된 ELB를 동일한 부피로 먼저 첨가하여 추출물에서 핵을 제거하십시오.

튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 16 °C에서 17,000 ×g로 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 그 다음, 상단의 남은 지질이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 수집하고, 바닥에 가라앉은 핵 펠릿은 건드리지 않은 상태로 둡니다.

대부분의 핵이 제거되었는지 확인하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스쿼시(squash)를 준비합니다. 그런 다음 신선한 추출물을 사용하거나, 샘플을 소분하여 -80 °C에 보관합니다. 1.5 mL 튜브에 ELB 1 mL를 넣고, 미리 조립된 핵 25~150 µL를 희석하여 난자 추출물 내에서 조립된 핵을 분리합니다.

1600 ×g, 4 °C에서 3분 동안 원심분리합니다. 그 다음 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 버퍼를 제거합니다. 펠릿에 원래의 난자 추출물 부피와 동일한 양의 배아 추출물을 첨가하고, 튜브를 가볍게 두드려 펠릿을 분쇄하고 핵을 재부유시킵니다.

실온에서 90분 동안 배양하며, 15~30분마다 튜브를 가볍게 두드려 혼합합니다. 배양이 끝나면 15% glycerol과 2.6% Paraformaldehyde가 포함된 ELB 500 microliters를 첨가하기 직전에 튜브를 두드려 핵을 재부유시킵니다. 즉시 튜브를 뒤집어 실온의 로테이터(rotator)에서 15분 동안 둡니다.

15 milliliter 라운드 바텀 유리 튜브에 라운드 바텀 플라스틱 인서트를 장착하여 스핀다운 튜브를 준비합니다. 핵 쿠션 버퍼 5 milliliters를 넣은 다음, 12 millimeter 원형 커버슬립을 튜브에 떨어뜨려 플라스틱 인서트 위에 평평하게 놓이도록 합니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 고정된 핵 용액을 핵 쿠션 위에 조심스럽게 층을 이루도록 쌓습니다.

스윙 버킷 로터를 사용하여 1,000 ×g, 16 °C에서 15분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 흡입기(aspirator)를 사용하여 모든 버퍼를 제거하고 플라스틱 삽입물을 튜브 상단에 고정합니다. 그런 다음, 미세 핀셋을 사용하여 커버슬립을 제거하되, 핵이 원심분리되어 부착된 커버슬립의 면을 주의 깊게 확인하십시오.

커버슬립을 상온에서 5분 동안 차가운 메탄올에 담가 고정합니다. 커버슬립의 핵이 위를 향하게 하여 큰 플라스틱 페트리 접시에 깐 플라스틱 파라핀 필름 시트 위로 옮깁니다. 그다음, 탈수를 방지하기 위해 접시 가장자리를 따라 젖은 일회용 와이프를 배치합니다.

500 µL의 PBS NP40를 사용하여 커버슬립 위의 핵을 5~10초 동안 재수화시킨 후 흡입하여 제거합니다. 그다음, 75 µL의 PBS 3%BSA를 커버슬립 위에 조심스럽게 층을 이루도록 얹고, 상온에서 1시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 블로킹합니다. 블로킹 버퍼를 제거하고 PBS 3%BSA에 희석한 1차 항체와 함께 인큐베이션합니다.

그 후 샘플을 PBS NP40로 다섯 번 빠르게 세척합니다. 2차 항체를 사용하여 이러한 배양 및 세척 단계를 반복합니다. PBS 3%BSA에 희석한 10 µg/mL의 Hoechst로 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그 다음 PBS NP40로 5회 세척하고 남은 버퍼를 모두 제거합니다. 마지막으로 5 µL의 항퇴색 마운팅 용액을 사용하여 커버슬립을 슬라이드 위에 마운트합니다. 투명 매니큐어로 커버슬립을 밀봉한 후 즉시 에피형광 현미경으로 이미징하거나, 나중에 이미징하기 위해 40 °C에서 보관합니다.

이 그림은 난자 추출물 핵의 조립 과정을 보여줍니다. 반응 시작 후 30-45분 뒤에 가늘고 S자 모양인 정자 핵이 슬러그 모양의 염색질 덩어리로 두꺼워지기 시작해야 합니다. 핵 조립이 일어나면 핵의 모양은 더 둥글게 변하며, 핵막이 확장되고 핵 단백질이 유입됨에 따라 핵의 부피가 증가해야 합니다.

여기서 보는 바와 같이, 배아 추출물의 소량을 Hoechst로 염색하여 압착했을 때 다수의 염색된 핵이 관찰되는데, 이는 추출물 조제가 성공적이었음을 나타냅니다. 원심분리를 통한 핵 제거 후, 이 패널에서 확인할 수 있듯이 첫 번째 압착 결과와 비교하여 추출물 내에 남은 핵이 매우 적어야 하며, 이를 통해 내생 핵이 후속 분석을 방해하지 않음을 보장할 수 있습니다. 만약 핵이 여전히 존재한다면, 2차 원심분리가 필요합니다.

본 핵 수축 분석법에서는 후기 배아 추출액에 재현탁된 난자 추출물 핵의 크기가 시간이 지남에 따라 성공적으로 작아집니다. 반면, 열 불활성화된 배아 추출액과 함께 배양된 핵은 수축되지 않습니다. 분석법 자체의 내재적 변동성을 해결하기 위해 실험을 여러 번 반복하는 것이 중요합니다.

숙달되면 전체 프로토콜은 이틀 만에 완료할 수 있으며, 핵 수축 분석 자체에는 약 4시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행하는 동안, 전 과정에 걸쳐 난자와 배아의 품질을 점검하는 것이 중요하며, 원심분리 후 세포질 추출물을 수집할 때 펠렛과 지질 층이 섞이지 않도록 매우 주의해야 합니다. 본 절차를 따라 얻은 결과는 반드시 검증되어야 합니다.

예를 들어, 배아 미세주입 또는 세포 배양 형질전환 등이 있습니다. 또한, 이 방법은 다른 세포소기관의 크기 조절을 탐구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 핵 세포 생물학 분야의 연구자들은 핵 크기의 조절 기전과 발달 및 암 발생 과정에서 핵 크기가 갖는 기능적 역할을 탐구할 수 있는 기반을 마련하게 되었습니다.

이 영상을 시청하고 나면 Xenopus 난자 추출물 핵을 조립 및 분리하고, Xenopus 배아와 배아 추출물을 생성하며, 핵 수축 분석을 수행하고 그 결과를 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.