사용하여 셀 - 무료 분석 Xenopus의의 laevis의 배아 핵 크기 규제의 메커니즘을 연구하기 위해 추출

세포 및 세포 내 스케일링의 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. Xenopus 배아 추출물의 사용은 세포 기관 크기 조절의 메커니즘을 밝히기 위해 점점 더 보편화되고 있습니다. 이 방법은 배아 추출물 준비와 핵 크기 조절 메커니즘을 확인할 수 있는 새로운 핵 스케일링 분석을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 Xenopus 난자 및 배아 추출물을 사용하여 큰 핵이 더 작게 수축하는 분석을 생성하는 것입니다. 이 방법은 핵 세포 생물학에 대한 주요 질문, 예를 들어 핵 크기를 조절하는 메커니즘은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 Xenopus cell-free 추출물의 조성 및 활성을 쉽게 조작하여 핵 크기에 대한 사실을 평가할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 Xenopus 난자 추출물, 탈감된 정자 및 조립된 핵을 준비한 후 유리, 재사용 가능한 페트리 접시 위에 개구리를 올려 갓 낳은 난자를 수집합니다. 배설물 근처의 허리에 부드러운 압력을 가하여 알을 낳는 것을 촉진합니다. 계란이 접시 가장자리를 따라 모일 수 있도록 접시를 약 45도로 받칩니다.

그런 다음 여분의 완충액을 제거하고 알을 간신히 덮을 수 있을 만큼 1/3 X MMR을 추가합니다. 단단히 끼워진 절굿공이를 사용하여 500마이크로리터의 고염 변형 바르트 식염수(MBS)로 1.5ml 튜브에 있는 고환의 1/4을 침식하고 균질화합니다. 그런 다음 침식된 고환을 난자에 넣고 실온에서 15분 동안 수정이 이루어지도록 합니다.

부화 후 알에 1/3 X MMR을 뿌립니다. 그런 다음 5분에서 10분 후에 짙은 색소의 동물 기둥이 수축하는지 확인하고 동물 기둥이 위를 향하도록 배아를 회전시켜 수정을 확인합니다. 구멍이 넓은 플라스틱 피펫을 사용하여 죽거나 용해되거나 수정되지 않은 절단되지 않은 난자는 이웃 배아에서 빠르게 사멸을 유도하므로 부지런히 제거합니다.

수정 후 1-2.5시간 후, 2-3%의 시스테인에 함유된 젤리 배아는 pH 7.9로 조정된 1/3 X MMR에 용해됩니다. 젤리 제거에 이르기까지, 배아는 상대적으로 많은 부피를 차지합니다. 각각 3-4분 동안 두 번의 버퍼 변경을 수행합니다.

그런 다음 시스테인의 흔적을 모두 제거하기 위해 1/3 X MMR을 6-10회 짧게 변경하여 배아를 철저히 씻습니다. 젤리를 제거한 후 배아는 단단히 포장되어 상대적으로 작은 부피를 차지합니다. 다음으로, 넓은 구멍의 유리 피펫을 사용하여 건강한 수정된 배아를 신선한 1/3 X MMR이 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.

그리고 실온에서 원하는 단계로 발달하도록 하십시오. 죽거나 용해된 배아는 1부 분열이 부족하거나 하얗고 부풀어 오른 모양으로 나타나는 대로 계속 제거합니다. 배아가 11.5 - 12단계에 도달하면, 0.5 밀리몰 시클로헥시미드가 보충된 새로운 1/3 X MMR로 옮기고 배아를 실온에서 1시간 동안 배아를 배양하여 후기 계기에 정지시킵니다.

넓은 구멍의 유리 또는 플라스틱 피펫을 사용하여 최소 15개의 계면 정지 배아를 마이크로 원심분리기 튜브로 이식합니다. 1밀리리터의 난자 용해 완충액(ELB) 1밀리리터에 1마이크로리터의 LPC 스톡을 배아에 추가합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 배아를 씻습니다.

그런 다음 배아가 튜브 바닥으로 떨어지도록 합니다. 버퍼를 제거하기 전에 세척을 두 번 더 반복하십시오. 액틴 중합을 억제하기 위해 500마이크로리터의 ELB, 0.5마이크로리터의 LPC 스톡, 5마이크로리터의 19.7밀리몰 시클로헥시미드, 5마이크로리터의 35.5밀리몰 시토칼라신 D에

탁상용 원심분리기에서 200배 G로 1분 동안 샘플을 원심분리한 다음 초과 버퍼를 제거하고 유봉을 사용하여 배아를 철저히 분쇄합니다. 분쇄된 샘플을 스윙 버킷 로터와 원심 분리기에 10, 000회 G, 10분 동안 섭씨 16도에서 놓습니다. 200마이크로리터 피펫 팁으로 위에서 지질층에 구멍을 뚫고 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 중간 세포질 호박색 층을 적절한 크기의 튜브로 제거합니다.

배아 추출물에 다음 시약을 보충하십시오. 그런 다음 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 그런 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 스쿼시를 준비하여 추출물의 내인성 배아 핵을 시각화한 후, 먼저 여기에 나열된 시약을 포함하는 동일한 부피의 ELB를 첨가하여 추출물에서 핵을 제거합니다.

튜브를 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 17, 000 번 G에서 16 °C에서 15 분 동안 스윙 버킷 로터에서 샘플을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상층액을 수집하여 상단에 지질이 남아 있지 않도록 주의하고 하단의 펠릿화된 핵을 방해받지 않도록 합니다.

대부분의 핵이 제거되었는지 확인하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스쿼시를 준비합니다. 그런 다음 신선한 추출물을 사용하거나 샘플을 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 1.5 밀리리터 튜브에 25-150 마이크로리터의 사전 조립된 핵을 1밀리리터의 ELB에 희석하여 난자 추출물에 조립된 핵을 분리합니다.

1600회 G와 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리기. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 버퍼를 제거합니다. 펠릿에 난자 추출물의 원래 부피와 동일한 부피의 배아 추출물을 추가하고 튜브를 부드럽게 두드려 펠릿을 분해하고 핵을 재현탁시킵니다.

실온에서 90분 동안 배양하고 15-30분마다 튜브를 가볍게 두드려 섞습니다. 배양 후, 15%글리세롤과 2.6%파라포름알데히드가 함유된 ELB 500마이크로리터를 추가하기 직전에 튜브를 두드려 핵을 재현탁합니다. 즉시 튜브를 뒤집고 튜브를 실온에서 15분 동안 회전기에 올려 놓습니다.

15밀리리터 둥근 바닥 유리 튜브에 둥근 바닥 플라스틱 인서트를 장착하여 스핀다운 튜브를 준비합니다. 5ml의 핵 쿠션 버퍼를 추가한 다음 12mm 원형 커버슬립을 튜브에 떨어뜨리고 플라스틱 인서트 위에 평평하게 놓이도록 합니다. 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 핵 쿠션 위에 고정된 핵 용액을 부드럽게 겹쳐 놓습니다.

15 분 동안 1, 000 시간 G 및 16 섭씨 온도에 진동하는 물통 회전자에 있는 그것을 원심분리기. 그런 다음 흡입기를 사용하여 모든 버퍼를 제거하고 플라스틱 인서트를 튜브 상단에 고정합니다. 그런 다음 한 쌍의 미세한 집게로 덮개 슬립을 제거하되 핵이 회전하는 덮개 슬립의 측면을 주의해서 기록하십시오.

호스트는 실온에서 5분 동안 차가운 메탄올에 커버슬립을 고정합니다. 커버 슬립을 핵 쪽이 위로 향하게 하여 큰 플라스틱 페트리 접시를 감싸는 플라스틱 파라핀 필름 시트로 옮깁니다. 그런 다음 탈수를 방지하기 위해 접시 측면을 따라 젖은 일회용 물티슈를 놓습니다.

500마이크로리터의 PBS NP40으로 커버슬립의 핵을 5-10초 동안 재수화하고 흡인합니다. 그런 다음 75마이크로리터의 PBS 3%BSA를 커버슬립에 조심스럽게 겹겹이 쌓고 실온에서 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 차단합니다. 차단 buffer를 제거하고 PBS 3%BSA에 희석된 1차 항체로 incubation합니다.

그런 다음 PBS NP40을 즉시 5번 교체하여 샘플을 세척합니다. 2차 항체로 이러한 배양 및 세척 단계를 반복합니다. PBS 3 % BSA에서 팽창 된 Hoechst의 밀리리터 당 10 마이크로 그램으로 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.

그런 다음 PBS NP40으로 5회 세척하고 여분의 버퍼를 모두 제거합니다. 마지막으로, 5마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체가 있는 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 밀봉하고 즉시 에피형광 현미경을 사용하여 이미지화하거나 나중에 이미징할 수 있도록 섭씨 40도에서 보관하십시오.

이 그림은 난자 추출물 핵의 조립을 보여줍니다. 반응 시작 후 30-45분이 지나면 얇은 S자 모양의 정자 핵이 두꺼워지기 시작하여 민달팽이 모양의 염색질 덩어리가 되어야 합니다. 핵 조립이 발생한 후에는 핵 모양이 더 둥글어져야 하며 핵 외피가 팽창하고 핵 단백질을 수입함에 따라 핵 부피가 증가해야 합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 배아 추출물의 작은 분취액의 Hoechst 염색된 스쿼시는 추출물의 제조가 성공적이었음을 나타내는 많은 염색된 핵을 보여줍니다. 원심분리에 의한 핵 제거 후, 첫 번째 스쿼시와 비교했을 때, 이 패널에서 밝혀진 바와 같이 추출물에 매우 적은 수의 핵이 남아 있어야 하며, 이는 내인성 핵이 다운스트림 분석을 방해하지 않도록 합니다. 핵이 여전히 존재하는 경우 두 번째 원심분리가 필요합니다.

이 핵 수축 분석법에서 말기 배아 추출물에 재현탁된 난자 추출물 핵은 시간이 지남에 따라 성공적으로 작아집니다. 그러나, 열 비활성화 배아 추출물로 배양된 핵은 그렇지 않다. 실험을 여러 번 반복하는 것은 분석의 고유한 가변성을 해결하는 데 중요합니다.

일단 마스터되면 전체 프로토콜을 이틀 만에 완료할 수 있으며 핵 수축 분석 자체는 약 4시간이 소요됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 난자와 배아의 품질을 전체적으로 확인하고 원심분리 후 세포질 추출물을 채취할 때 펠릿과 지질층을 피하도록 매우 주의하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 얻은 결과의 유효성을 검사해야 합니다.

예를 들어, 배아 미세주입 또는 세포 배양 형질주입이 있습니다. 또한 이 방법은 다른 소기관의 크기 조절을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 핵 세포 생물학 분야의 연구자들이 핵 크기의 조절 메커니즘과 개발 및 발암에서 핵 크기의 기능적 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 Xenopus 난자 추출물 핵을 조립 및 분리하고, Xenopus 배아 및 배아 추출물을 생성하고, 핵 수축 분석을 수행하고, 결과를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.