Name: 최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 기본 인간 기관지 상피 세포에서 렌티바이러스를 이용한 고효율 형질도입 방법을. 분화 과정에서도 높은 도입 효율을 유지하며, 호흡기 연구에 필수적인 1차 세포 활용이 가능합니다.

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우리는 폐를 제공하기 위해 마이애미 대학의 생명 얼라이언스 장기 복구 기관 감사합니다. 우리는 또한 우리는 또한 가브리엘 Gaidosh 감사도 2b 및 3-D, C.에도 3a에 실험에 사용되는 mCherry 바이러스 박사 벤 Gerovac 리사 노박에 나타난 실험에 사용되는 DNA의 준비를 위해 박사 리사 Künzi 감사합니다 이미징 시설에서, 마이애미 대학 안과학 교실. 본 연구는 NIH의 CF 재단과 박사 마티아스 Salathe에 승무원 의학 연구소에서 보조금을 후원하고있다.

1. 1 단계 : HEK 293T의 문화 <ol><li> 고 글루코스 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 (HEK 매체로 칭함) HEK 세포 매체를 준비한다. </li><li> 코트 콜라겐 콜라겐 I. 믹스 30 μL I 증류수 2 ㎖에 한 10cm 조직 배양 접시. 접시에 믹스를 확산하고 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 품어. </li><li> 믹스를 제거하고 15 분 동안 층류 캐비닛의 접시를 건조하게 할 수 있습니다. </li><li> HEK 10 ㎖ 배지에서 1 × 106 세포의 밀도로 피복 된 접시 상에 플레이트 HEK 세포를 37 ℃에서 배양한다, 5 % CO 2. </li><li> HEK 세포 (2~3일 도금 후 그림 1a) 50-60% 합류 경우, 포화 상태의 2 비주얼 평가를 충분한되는 무대로 진행합니다. 어떤 정량화가 필요하지 않습니다. 참고 : HEK 세포 (위 참조) HEK 미디어에서 배양한다. 그들이 포화 상태에 도달 t헤이 분할 (예 : 1/5) 또는 나중에 사용하기 위해 아래로 고정 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 2 단계 : HEK 세포의 생산 및 렌티 (정맥 주사)의 농도 참고 : 프로토콜은 BSL-2 미국에서 + (강화 BSL-2) 조건에서 기관 및 정부 규제에 맞춰 실행해야합니다. <ol><li> 칼슘 침전 절차를 사용하여 형질 (리포 펙 타민과 다른 형질 에이전트는 칼슘 침전 절차와 효율적하지 않았다). 다음과 같은 절차가 변경 되더라도 상업 형질 전환 키트의 사용은, 재현성을 보장하는 것이 좋습니다. 실온에 모든 시약을 가져와. 이 날 0입니다. </li><li> HEK293 세포의 각 10cm 접시를 들어, 봉투 DNA pMD2 - VSVG의 4.5 μg의 7.5 μg의 DNA pMDLg / pRRE을 포장, 3.75 μg의 DNA pRSV 반전, 렌티 바이러스 발현 벡터의 10 μg의 DNA, 2 M 칼슘 용액 86 μl를 혼합 및 700 ㎕의 최종 부피로 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 멸균(후자의 두 솔루션은 상업 형질 전환 키트에 제공된다). </li><li> 현명한 드롭 (트랜 키트에 HBS) 배 HEPES 완충 식염수 700 ㎕를 (층류 캐비닛) 텍싱하면서 추가하고 30 분 (기다리는 동안 4 단계를 수행)을 실온에서 품어. </li><li> 초기 배양 시간 동안, 슬라이드에 믹스의 예금 5 μL. 천천히 위아래로 초점을 10 배 목표와 현미경으로 액체 방울을 확인합니다. 미세한 침전물은 인산 칼슘 침전 방법을 확인하는 표시한다 (도 1B). </li><li> 혼합하는 상하 HEK 세포 미디어와 피펫 10 ㎖를 첨가하여 30 분 후 침전를 중지합니다. </li><li> 단계 2.1-2.5에서 HEK 세포의 접시를 타고와 매체 (0 일)을 제거합니다. 접시의 가장자리를 따라 조심스럽게 천천히 단계 2.5에서 침전물 솔루션을 추가합니다. </li><li> 다음날 (1 일)에서 분리하고, 침전물을 함유하는 배지를 버리고 승 대체HEK 배지 10 ㎖ 번째. 현미경 미세 침전물 확인 : 그것은 세포 (도 1C 및 d) 사이의 빈 공간에 접시에 볼 수 있어야합니다. </li><li> 제 2 일에, 40 %의 폴리에틸렌 글리콜 3.8 ㎖ (PEG) 용액을 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 0.45 ㎛의 주사기 필터를 통해 주사기, 필터 매체를 수집한다. 합니다 (PEG가 형성 침전,하지만 더 이상 오일보다 용) 바이러스 컬렉션의 모든 때까지 완료 반전 5 배는 최소 24 시간 동안 4 ℃에서 혼합하지 않고 저장합니다. </li><li> 일 3 일 4 4. 단계를 반복 2.8 HEK 매체를 대체하지만 10 %의 표백제로 오염을 제거하고 요리를 폐기하지 않습니다. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 1,650 XG에 원심 분리기 모든 컬렉션 튜브 (함께 5 일에 일반적으로 모든 컬렉션) 바이러스 펠렛합니다. 제거하고 뜨는을 폐기하고, 수집 및 PEG 상등액의 나머지를 제거하기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 1,650 XG에 다시 스핀. </li><li> ResusPEND 암포 테리 신 B (8)가없는 기관지 상피 성장 배지 (BEGM) 200 ㎕를 각 튜브의 펠렛. 함께 수영장과 200 μL에서 나누어지는. -80 ° C에서 보관 바이러스. 에이즈-1 개그 (P24) 항원 ELISA 분석을 수행하기 위해 추가로 10 μl를 나누어지는. </li><li> 시판 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 P24 항원 분석을 수행한다. 분석은 pg / ml 인에서 바이러스 P24의 추정치를 제공합니다. </li></ol> 3. 3 단계 : 문화 차 HBE 세포 <ol><li> 10 ㎖ BEGM 매체에 플레이트 HBE 세포 I은 10cm 조직 배양 접시 코팅 콜라겐 1 × 106 세포의 밀도로 (100 μL 암포 테리 신 B와 통로 0 세포 수 진균의 오염을 제거하기 위해 사용되는 경우). 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. </li><li> 다음날, 배지를 제거하고 사일 총 (100 μL 통로 암포 테리 신 B와 0 세포)를 10 ㎖ BEGM 교체. 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 4 D 후,AYS는 매일 암포 테리 신 B를 변경 매체없이 만 BEGM를 사용합니다. </li><li> 세포가 80-90% 합류 (그림 2a; ~ 칠일 도금 후) 때, 전달 진행 (전달하기 전에 준비를 위해 3.5에주의). 또, 포화 상태의 시각적 평가는 충분하다. 어떤 정량화가 필요하지 않습니다. </li><li> 전달에 앞서, 외투 콜라겐 IV 용액 투과성지지 인서트는 멸균 증류수로 1/10 희석 하였다. 각 삽입에 200 μl를 추가하고 층류 캐비닛 건조 하룻밤을 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 4 단계 : HBE 세포의 형질 도입 <ol><li> 용지를 꺼내 인산염 완충 생리 식염수 (EDTA / PBS)에 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 0.1 % 트립신 3 ㎖를 추가하고 37 ° C에서 5 분 5 % CO 2를 품어. 모든 세포가 분리되어 있는지 확인하기 위해 현미경 (10X 목적)에서 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 추가로 5 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 모든 세포가 분리되는 경우 (3)을 추가대두 트립신 억제제 ㎖ (SBTI 1 ㎎ / ㎖)을 혼합하고 15 mL의 원심 분리 튜브에 이송. 실온에서 5 분 동안 460 XG에서 회전하여 세포 펠렛. </li><li> BEGM 3 ㎖에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거하고 계수를 진행합니다. </li><li> BEGM 400 μL (표 2 참조)에서 하나 12mm 투과성지지 인서트 당 2 × 105 세포의 비율로 재현 탁 HBE 세포 (이제 통로 1 P1). 형질한다 투과성지지 인서트의 양에 기초하여 이들 숫자를 추정. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 표면 </td><td> 표면적 </td><td> 세포 수 </td><td> 미디어 </td><td> 볼륨 (미디어) </td></tr><tr><td> 10cm 접시 </td><td> 52.7 cm (2) </td><td> 1 × 10 (6) </td><td> BEGM </td><td> 10 ml의 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> 12mm 필터 </td><td> 1.13 cm (2) </td><td> 2 × 10 5 </td><td> BEGM </td><td> 400 μL </td></tr><tr><td> 24mm 필터 </td><td> 4.52 cm (2) </td><td> 8 × 105 </td><td> BEGM </td><td> 800 μL </td></tr></tbody></table> 표 2 : 세포 수에 따라 미디어 외삽. <ol start="5"><li> (4)의 감염 (MOI) 계수의 다양성을 이용하여 세포 현탁액으로 바이러스가 적절한 볼륨. </li><li> 2 μg의 / ml의 최종 농도 hexadimethrine 브로마이드를 추가합니다. </li><li> 꼭대기 실에 투과 지원 인서트 당 믹스 (BEGM, HBE 세포, 바이러스 및 hexadimethrine 브로마이드) 400 μl를 분배하고, 기저 구획에 혼자 BEGM 1 ㎖를 추가합니다. 제어 및 테스트 퓨로 마이신 선택 (해당하는 경우)와 같은 바이러스없이 37 ° C, 5 % CO 2. 항상 판 HBE 세포에서 밤새 품어. </li><li> 다음 날, REM 수면에비켜 혀끝과 기저 미디어, PBS로 세척하고, 공기 - 액체 인터페이스 (ALI) 미디어 8 두 구획을 교체합니다. </li><li> 세포가 컨 플루 언트 될 때, (공기 - 액체 계면을 확립라고도 함) 꼭대기 유체를 제거한다. 그들은 완전한 성숙에 도달 할 때까지 바닥 구획 매일의 매체 (ALI)를 변경 계속; 보통 3 ~ 4 주 후. 주 : 렌티 바이러스 벡터는 퓨로 마이신과 같은 선별 유전자를 포함하는 경우, 세포를 선택 농도 곡선에있어서, 퓨로 마이신을 첨가하여 선택 될 수있다. HBE 세포, 1 μg의 / ml의 농도가 형질 도입 된 세포의 선택 일치 이상적인 것으로 결정되었다. 그러나,이 농도는 다른 세포 또는 조건과 다를 수 있습니다 곡선을 살해에 의해 결정되어야한다. 미디어가 선택 유전자의 전체 표현을 할 수 있도록 나중에 ALI 미디어 또는 (2-3 일)로 대체 한 후 퓨로 마이신의 추가는 이른로 하루를 시작하세요. 하나의 삽입 그 시간에 퓨로 마이신을 추가해야합니다같은 형질 도입되지 않았다. 세포가 완전히 분화까지 퓨로 마이신이 첨가 될 수있다. </li></ol>

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저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 100 % 전달 효율에 가까운 보장합니다. 그러나,이 목표를 달성하기 위해 중요한 과정에서 단계가있다. 예를 들어, 형질 전환 과정은 형질 믹스 석출물의 존재 (드롭) 또는 접시에 형질 도입 (도 1b 및 d) 다음날 좋은 형질 대한 중요한 양이다. 침전 또는 응집의 존재 유무는 형질 전환 시약 중 하나의 누락, pH가 문제 또는 불량 플라스미드 제조에 기인 할 수있다. 침전물이없는 경우, 아무도 그 다음날 볼 수 없습니다 가능성이 매우 높습니다. 또한, 형질 전환 및 수율을 방해은 HEK 세포가 분리 될 수 있습니다 너무 빨리 형질 혼합 또는 HEK 미디어를 추가. 좋은 수율의 또 다른 표시는 원심 분리 단계 이전에 6 일째에 있습니다 : 흰색 침전물 튜브의 하단에 표시해야한다. 거의와 나쁜 형질더 바이러스는이 백색 침전물을 생성하지 않습니다. 형질 도입 절차 동안, 탈 분화 높은 형질 도입 효율을 달성하기 위해 상태와 같은 줄기 세포에 ...

복제 결함, pseudotyped 렌티 바이러스의 개발 (LV)는 관내 1 유전자를 전달하기 위해 안전하고 효율적인 방법으로 연구자를 제공하고 있습니다. 그들의 장기 표현이 LV는 또한 생체 내에서 2,3- 치료제의 전달을 위해 사용될 수있다. LV의 생산은 여러 플라스미드 인간 배아 신장 (HEK) 세포의 공동 - 형질 필요 전이 벡터 포장 개그 / 폴, 포장의 회전을하고, 수 포성 구내염 바이러스 당 단백질 (VSV-G) 플라스미드 봉투. 레브 유전자하여 복제 가능 렌티 바이러스를 생산하는 재조합의 가능성을 감소시키는, 별도의 패키징 플라스미드 인코딩되기 때문에 제 3 세대 포장 시스템은 제 2 세대 시스템보다 안전한 것으로 간주된다. 2 세대 포장 시스템 다섯 배 더 높은 총 전달 유닛을 수득하지만, 원래의 바이러스 게놈의 분할 만드는3 세대 시스템은 최소한 3,4- 전달 레벨이 감소하고있다. 세포주를보다 쉽고 효율적으로 형질 도입 될 수 있지만 이러한 생체 더 대표는 5,6 어떤 조직이 있기 때문에, 연구자들은 일차 전지에 그들의 초점을 이동하고있다. 그러나, 일차 전지는 전달하는 내화물이다. 완전히 분화 ​​된기도 상피 세포의 형질 도입이보고되었지만, 전체 효율은 15 % 7을 초과하지 않았다. 높은 역가의 정맥 주사의 생산을 가능하게하는 프로토콜은 여기에 설명한다. 단계별 접근법은 기본 HBE 세포로 거의 100 % 형질 도입 효율을 달성하기 위해 설명된다. 구체적으로는, 프로토콜은 3 성공 쓸모 최적 배양 조건을 설명한다. 간단히, HEK의 293T 세포는 향상된 녹색 형광의 EF-1 프로모터 구동 식으로 렌티 바이러스 발현 벡터 pCDH를 사용하여 형질단백질 (eGFP는) mCherry 또는 적색 형광 단백질, 및 제 3 세대의 패키징 시스템. 미디어에 발표 정맥 주사 이후 24 시간 (72)에 수집된다. 바이러스 입자는 P24 항원의 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트를 사용하여 역가를 추정하기 전에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 바이러스의 농도를 더욱 간편한 방법에 집중된다. 4 (MOI) 인자 감염 다중도에서 (트립신 처리 후)에 부착하는 동안 계속해서, 미분화 차 HBE 셀 (hexadimethrine 브로마이드를 첨가하고, 16 시간 동안 배양하고, 증식 배지 (기관지 상피 성장 배지 또는 BEGM) (8)에 형질 도입되고 밤새). 세포는 분화 할 수있다. 바이러스 유전자는 (설명을 참조 적절한 프로모터를 사용하는) 장기간 발현되므로, 발현은 pseudostratified기도 상피 세포로의 분화에 걸쳐 유지된다 또는 분화 후 (유도 성 프로모터를 사용하여) 유도 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>HEK293T/17 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>12306C</td><td>, 10%DMEM에서 사용</td></tr><tr><td></td><td>, Thermo Scientific</td><td>11995-040</td><td></td></tr>, <tr><td>페니실린/스트렙토마이신(100x),</td> <td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td>, <td>1x</td></tr><tr><td>Collagen I</td>에서 <td>사용, BD Biosciences</td><td>354231</td><td>증류수에서 1:75 희석</td></tr><tr><td>Calphos</td><td>Clontech</td><td>631312</td><td>2 M 칼슘 용액, 2x HEPES 완충 용액(HBS) 및 멸균 H2O</td></tr><tr><td>폴리틸렌 글리콜 8000</td><td>VWR scientific</td><td>101108-210</td><td>40%</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A9528</td><td></td></tr> 재고를 포함하는 트랜스펙션 키트 1x <tr><td>트립신</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Transwell에서 사용 12mm</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C7521</td><td>증류수 1:10 희석</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>2mg/ml</td></tr><tr><td>Puromycin (10.000x)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A11138-03</td><td>1x</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 ELISA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Thermo에서 사용 Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro</td><td>System Biosciences</td><td>CD532A-2</td><td>렌티바이러스 발현 벡터</td></tr><tr><td>pMD2-VSVG</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>패키징 DNA</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td>패키징 DNA</td></tr><tr><td>pRSV-rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td>패키징 DNA</td></tr></tbody></table>

최적의 lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

호흡기 세포 분화 및 기능의 처리를 연구하는 유용한 모델을 공기 - 액체 계면 상태를 제공하여 기본 인간 기관지 상피 (HBE) 세포의 시험 관내 배양한다. 지난 몇 년 동안, 유전자 전달에 대한 렌티 바이러스 벡터의 사용은 일반적인 관행이되었다. 특정 비 HIV 의사 입력 렌티 완전히 분화 된기도 상피 세포의 형질 도입의보고가 있지만, 전체의 전달 효율이 일반적으로 15 % 미만이다. 여기에 제시된 프로토콜은 신뢰할 수 있고 효율적인 방법 렌티 바이러스를 제조하고,이 차 인간 기관지 상피 세포를 형질 도입하기를 제공한다. 세포가 부착하는 동안 4 감염 인자의 다양성과 함께, 미분화 기관지 상피 세포, 기관지 상피 성장 배지에서 형질을 사용하여 100 %에 가까운 효율을 제공한다. 이 프로토콜은, 단계적으로 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 및 제의 제조와 농도를 설명전자 전달 방법. 이는 일차 인간 기관지 상피 세포 transductions 고효율을 달성하기 위해 최적 배양 조건을 결정 실험을 설명한다.

도 1은도 1a. 형질 감염 과정 셀 솔루션을 평가하는 다른 주요 단계를 도시 전에 바이러스 생산을위한 형질 전환에 HEK293T 세포의 최적의 포화 상태를 나타낸다. 이는 세포가 접시에 걸쳐 균등하게 분배하는 것이 중요하다.도 1b는 명 시야 광학계 및 10X 대물 렌즈를 이용하여 형질 전환 혼합물의 드롭 침전물을 보여주고있다. 더 많은 침전물이 모래 입자가 아닌 덩어리처럼, 더 효율적인 형질이 될 것입니다. 이 그림에서, 침전물 비트 조대하다. 침전물 형질 감염 바이러스의 높은 역가를 생성할지 여부를 신뢰성 지표이다. 재료 중 하나가 누락되거나 품질이 좋지 않은 (예를 들어 벡터 DNA) 중 하나 인 경우, 응집은 불길한 기호 인 형성 할 것이다. 이 경우, 그 확인하고, 중단하고 절차를 다시 현명모든 성분이 혼합에...

일차 인간 기관지 상피 세포는 형질도입이 어렵습니다. 이 프로토콜은 렌티바이러스의 생산과 농도뿐만 아니라 가성층화된 상피로의 분화를 통해 이러한 세포에서 매우 효율적인 형질도입을 달성하는 데 필요한 최적의 배양 조건을 설명합니다.

최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

이 방법론의 전반적인 목표는 렌티바이러스를 사용하여 일차 인간 기관지 상피 세포의 고효율 형질전환을 달성하는 것입니다. 이 방법은 세포주 대신 일차 인간 기관지 상피 세포를 사용하고자 하는 연구자들에게 도움이 될 수 있으며, 형질전환이 어려운 다른 세포 유형에도 적용 가능할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 가층편평상피로 분화하는 과정 전반에 걸쳐 높은 형질전환 효율이 유지된다는 점입니다.본 프로토콜은 미국의 강화된 BSL-2 조건 하에 기관 및 정부 규정에 따라 수행되어야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Collagen I이 코팅된 디쉬에 HEK 배지를 준비한 후, 배지 10 milliliters를 사용하여 100만 개의 HEK 세포를 코팅된 디쉬에 분주합니다. 세포가 50~60% 정도로 합쳐질(confluent) 때까지 디쉬를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다.이 날을 0일 차로 간주합니다. 0일 차에 층류 작업대(laminar flow cabinet)에서 상용 트랜스펙션 키트를 사용하여 시약들을 상온으로 맞춥니다. HEK293 세포가 담긴 10 centimeter 디쉬 하나당 15 milliliter 원심분리 튜브에 다음 성분들을 혼합합니다: pMD2-VSVG envelope DNA 4.5 micrograms, pMDLg/pRRE packaging DNA 7.5 micrograms, pRSV-rev DNA 3.75 micrograms, 렌티바이러스 발현 벡터 10 micrograms 및 2 Molar 칼슘 용액 86 microliters.그 후 멸균수를 추가하여 최종 부피를 700 µL로 맞춥니다. 여전히 층류 작업대 내에서 보텍싱을 하며 2x Hepes Buffered Saline 700 µL를 한 방울씩 첨가하고, 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 초기 단계에 혼합액 5 µL를 작은 디쉬에 분주합니다.10x 대물렌즈를 장착한 현미경으로 초점을 천천히 위아래로 조절하며 액적을 확인합니다. 이때 미세한 침전물이 관찰되어야 하며, 이는 인산칼슘 침전 과정이 일어났음을 확인시켜 줍니다. 가장 중요한 단계는 침전물을 확인하는 것입니다.침전물이 없다면, 이는 플라스미드 준비 과정에 문제가 있었거나 플라스미드 또는 형질전환 시약의 계산 착오일 수 있습니다. 침전물이 없는 상태로 다음 단계를 진행하면 바이러스 조제량이 적거나 형질전환 효율이 낮아질 수 있습니다. 30분 후 HEK

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Lentivirus 제작

우리가 공기 - 액체 인터페이스에서 차별화된 성장을 포함한 인간 기관지기도 조직의 explants에서 기본 인간 기관지 상피 세포의 성장에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 이 방법은 인간의 폐 건강과 질병의기도 상피의 역할을 조사하는 주요 세포의 풍부한 소스를 제공합니다.

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

Lentiviruses는 유전자 기능을 탐험을위한 가치있는 연구 도구되지만, 연구진은 알려진 pantropic lentivirus 인코딩이나 의심 oncogenes의 생산을 방지하실 수 있습니다. 대안으로, 우리는 ecotropic 수용체 mSlc7a1을 표현하는 수정된 인간의 세포에 ecotropic lentivirus의 사용을 위해 안전한 프로토콜을 제시한다.

향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

배우세요 기본 인간 기관지 상피 세포에서 렌티바이러스를 이용한 고효율 형질도입 방법을. 분화 과정에서도 높은 도입 효율을 유지하며, 호흡기 연구에 필수적인 1차 세포 활용이 가능합니다.

최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포

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