Name: 비골 신경 손상 방법 : 신뢰할 수있는 분석은 확인하고 테스트 즉, 수리 신경 근육 학 접합 요인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 학습하세요 쥐의 비골 신경 손상 방법을 통해 신경근육 접합부 재생을 신뢰성 있게 평가하는 기술입니다. 이 방법은 근육 재신경화율을 실험군 간에 일관되게 비교할 수 있게 합니다.

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저자는 실험에 대한 지적 의견과 원고에 대한 의견에 대해 Valdez 연구소 구성원에게 감사드립니다.

모든 실험은 버지니아 공대 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 NIH 가이드 라인과 동물 프로토콜 하에서 수행 하였다. 수술 1. 준비 동물 <ol><li> 멸균 된 1 ml의 인슐린 주사기 케타민 (90 ㎎ / ㎏) 및 서혜부 피하 주사를 통해 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 생쥐를 마취. 캐리어 솔루션은 0.9 % 식염수, 17.4 ㎎ / ㎖ 케타민, 2.6 ㎎ / ㎖ 자일 라진의 혼합물을 포함한다. 을 적용하려면 약물 치료를 기다리는 동안 케이지 다시 동물을 놓습니다. 주 : 로딩 용량이 절차 동안 충분한 마취를 제공하지 않는 경우, 부하 용량의 추가 25 %가 주입 될 수있다. </li><li> 모니터 동물은 정상 호흡 요금과 각성 수준의 적절한 우울증를 확인하기 위해 주사를 게시 할 수 있습니다. 충분히 마취 할 때 어떤 반응을 유도하지해야 뒷발 핀치와 각성 수준을 확인합니다. 참고 :이 일반적으로 3-5 소요25g 30에 평균 젊은 성인 마우스 분. 동물은 여전히​​ 10 분 포스트 분사 후 응답하는 경우, 마취 로딩 도즈의 추가 25 %가 주입 될 수있다. </li><li> 건조 함을 방지하기 위해 동물의 눈에 바셀린 가벼운 미네랄 오일 안과 연고를 적용합니다. 깨끗하고 평평한 표면에 케이지와 장소에서 동물을 제거합니다. 사지의 좌우 측면을 노출, 전기 헤어 트리머를 사용하여 골반에 발에서 원하는 뒷다리를 면도. </li><li> 1 분 동안 면도 사이트에 화학 머리 제거를 적용합니다. 수동으로 실험실 와이프를 사용하여 머리를 제거합니다. 실험실 청소 면도 한 영역은 에탄올에 배어 와이프. </li></ol> 2. 수술 <ol><li> 오토 클레이브 또는 다른 적절한 방법을 통해 수술 도구를 소독. 80 % 에탄올 / H 2 0과 수술 부위 및 수술 보드를 청소합니다. proviodine으로 수술 부위를 소독. 수술 보드에 마우스를 놓고 사지 구속과 맞 춥니 다. 유지무릎 관절을 가진 해부학 적 자연 위치에서 대상 뒷다리가 약간 내부 또는 외부 회전없이 확장. </li><li> 수술 현미경으로 동물과 보드를 놓습니다. 표면 랜드 마크, 특히 뼈 무릎 관절과 전 경골근과 비복근 근육 사이의 능선의 촉진을 통해 적절한 절개 사이트에 동양. </li><li> 그립의 일반 집게를 사용하는 동안 메스 또는 스프링 가위를 사용하여 피부를 통해 약 3cm의 절개를합니다. 일반적인 비골 신경의 기본 과정에 수직 절개를합니다. </li><li> , 피상적 인 밴드를 통해 절개를 계속 이두근 대퇴골을 노출하고 광근의 근육을 lateralis. 연결 깊은 근막을 통해 절단하여 이러한 근육을 분리합니다. 1-2 센티미터 컷은 충분합니다. </li><li> 이두근을 철회하는 것은 꼬리 쪽 공통 비골 신경을 드러내는, 기계 견인기를 사용하여 근육 대퇴. </li><li> 그 간까지 근위 신경을 추적비복근 근육의 측면 머리의 건과 절 발견된다. 참고 : 노출 후퇴 피부와 근육의 추가 조작이 필요할 수 있습니다. 이 교차로는 신경 손상에 대한 안정 랜드 마크로서 사용된다. </li><li> 비복근 건의 측면 테두리에 병렬 방식으로 팁을 정렬, 미세 집게로 신경을 잡고. 5 초 동안 꾸준히, 열심히 압력을 적용하여 일반적인 비골 신경 크러시. </li><li> 수술 범위를 통해 육안 검사로 신경의 전체 호감을 확증. 그것은 부상의 사이트에서 반투명 나타납니다. 주변 축삭의 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하는 경우, 형광 부상의 사이트에서 사라집니다. </li><li> 견인기를 제거하고 자신의 해부학 적 위치에 근육을 재편성. 6-0 실크 봉합사와 절개 사이트를 닫습니다. 1-3 간단한 중단 봉합 충분하다. 깨끗한 케이지에 가열 패드에 마우스를 회복 놓습니다. </li><li> 2 시간 포스트 오페라에 대한 모든 동물을 모니터링기 호흡과 마취에 대한 부작용에 ​​대해 확인합니다. 즉시 수술에서 회복 다음 피하 사타구니 주사를 통해 프레 노르 핀 0.05-0.10 ㎎ / ㎏의 초기 용량을 관리 할 수​​ 있습니다. 3 추가 투여 48 시간 동안 매 12 시간을 제공합니다. 전체 복구 후, 동물 보호 시설에 마우스를 반환합니다. </li></ol> 3. 분리 및 염색 신근의 심지 Longus (EDL) 근육 <ol><li> 이소 플루 란을 이용하여 동물을 희생. 흡수 labwipes로 포장 50 ML 튜브에 0.5 ml의에게 액체 이소 플루 란을 분배. 밀폐 2,500cm 3 실에서 동물과 캡핑 튜브를 놓습니다. 노출의 적어도 4 분이면 충분하다. 양측 눈꺼풀, 발가락 핀치, 꼬리 - 핀치 반사 손실에 대한 테스트는 각각의 동물 관류를 진행하기 전에 의식이 있는지 확인합니다. </li><li> 첫째로 transcardially 10 ㎖의 0.1M PBS 16 동물들을 관류하고 0.1M PBS (PH 7.4)의 4 % 파라 포름 알데히드의 25 ㎖. 헤파린 (30 대 / 20g 동물 체중) / ㎖) 10 단위 관류 결과를 향상 작은 모세관 침대에서 혈액 응고를 방지하기 위해 (PBS를 첨가 할 수있다. </li><li> 복부의 둘레 주위의 피부를 통해 횡 방향으로 절단 가위를 사용하여 뒷다리를 덮고있는 피부를 제거합니다. 뒷다리 사지와 발 집게를 사용하여 과거의 피부를 벗겨. </li><li> 잡고 집게로 박리에 의해 뒷다리의 표면 근막을 제거합니다. 주변 축삭에 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하는 경우, 50 ㎖ 튜브에 4 % PFA에서 하룻밤 전체 쥐를 후 수정. PBS로 3 회 씻어. 주 : 고정 마우스는 4 ℃에서 PBS에 저장 될 수있다. 그렇지 않은 경우,이 단계를 건너 뛰고 후 고정 동물없이 3.6 단계로 진행합니다. </li><li> 가능한 한 그대로 근위 및 원위 힘줄을 유지해야되고, 마우스 뒷다리에서 EDL 근육 (18)을 해부하다. </li><li> 적어도 1 시간 동안 (1X PBS, 0.5 % 트리톤 X-100, 3 % BSA, 5 % 염소 혈청을 함유) 완충액 블로킹 EDL 근육 인큐베이션. </li><li및 synaptotagmin-2 (1 : 250) 3 일간 버퍼를 차단에 희석 항체 :&gt; 신경 미세 섬유 (1,000 일)를 포함 튜브 모터 축삭과 신경 터미널, 장소 근육을 시각화합니다. 근육을 1X PBS로 3 회 10 분마다 씻으십시오. 주 : 주변 축삭의 형광 단백질 (XFP)를 발현하는 마우스를 사용하는 경우이 단계를 건너 뜁니다. </li><li> 전체 NMJ의 신경 분포에 대한 양성 대조군으로 EDL 손상되지 않은 반대측을 얼룩. 음성 대조군 4 일 후 부상의 NMJ 완전히 denervated있는 시점에서 얻어진 EDL뿐만 아니라, 단지 차 항체로 염색 EDL을 포함해야한다. </li><li> 1 일 신경 미세 섬유 및 synaptotagmin-2를 검출하기 위해 적절한 찬란 태그 이차 항체와 근육을 품어. 근육을 1X PBS로 3 회 10 분마다 씻으십시오. 주의 :이 단계는 단계 3.10와 함께 수행 될 수있다. 주변 축삭의 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하는 경우이 단계를 건너 뜁니다. </li><li> postsy을 시각화하는 방법NMJ의 naptic 지역은 5 μg의 / ㎖ 이상 2 시간 동안 버퍼를 차단에 희석 알렉사 - 555 복합 알파 - bungarotoxin와 근육을 품어. 근육을 1X PBS로 3 회 10 분마다 씻으십시오. </li><li> 양으로 대전 된 유리 슬라이드에 전체 근육을 마운트하려면, 슬라이드에 매체를 장착 기반 글리세린 몇 방울을 추가하고 coverslip에와 커버 슬라이드에 직접 근육을 놓습니다. 근육을 평평하게 슬라이드에 대해 커버 슬립을 누릅니다. 슬라이드 및 coverslip에 사용하는 실험실 와이프의 경계에서 설치 미디어를 만끽 해보세요. 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 가장자리를 밀봉 매니큐어를 적용합니다. </li></ol> 4. 영상 및 데이터 분석 <ol><li> NMJs 화상 488, 555 및 633 nm의 광을 여기하고 20X 및 40X 목적으로 방출 된 광을 포착 갖춘 공 ​​초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 EDL 근육의 구조를 분석한다. </li><li> 전체 NMJs 시각화 광 초의 최대 강도 투사 이미지를 만들TIONS는 떨어져 NMJ의 가장 높은 보이는 지역 가장 낮은에서 연장 1 μm의 2 간격. 시중에서 판매하는 이미징 소프트웨어를 사용하여 최대 강도 예측을 만듭니다. </li><li> 1) 완전히 denervated = 시냅스 사이트가 축삭과 AChRs 사이의 축삭과 접촉, 5 % 미만의 colocalization을 완전히없는 상태입니다으로 reinnervation의 속도를 확인하려면 NMJs을 분류합니다. 2) 부분적으로 신경 지배는 = 축삭은 부분적으로 축삭과 AChRs 사이의 postsynapse, 5~95%의 colocalization을 중첩. 3) 전체 신경 분포 = 사전 및 사후 시냅스 사이의 거의 완벽한 동격, 축삭과 AChRs 사이의보다 큰 95 % colocalization을. 결상면에 수직으로 놓여 또는 완전히 이미지에 가시화되지 NMJs를 제외합니다. 주 : 모든 실험에서, 적어도 3 동물 및 동물 당 50 NMJs을 조사 하였다. 결과는 0.05 미만의 P 값을 갖는 학생 t-test를 이용하여 의미있는 것으로 간주 하였다. </li><li> 연산자를 눈 멀게하려면 별도의 개인이 수행 할 수 있습니다수술 및 이미지 분석. 치료 그룹의 지식없이, 분석기는 NMJ 점수와 목적이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 무작위로 이미지 및 소스 동물 모르게 분석을 위해 조작자에게 제공 될 수있다. </li></ol> 5. 정량적 PCR <ol><li> 이소 플루 란과 자궁 경부 전위를 사용하여 동물을 희생. 피부와 3.3 단계를 따라 다리 근육을 덮고 표면 근막을 제거합니다. 전 경골근과 3.4 단계에있어서, EDL 근육을 해부하다. </li><li> 플래시는 액체 질소에 비해 1.5 ML 튜브의 전체 경골근과 EDL 근육을 동결. 부분적으로 액체 질소에 잠긴 미리 냉장 박격포에 튜브와 장소에서 조직을 제거합니다. 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 갈아 냉동 근육. </li><li> 시판 RNA 추출 시약에 냉동 근육 분말을 용해시키고, 시판의 키트를 제조자의 난에있어서와 RNA 추출 및 게놈 DNA의 제거를 수행nstructions. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 시판중인 역전사 효소 믹스 역전사를 수행한다. </li><li> qPCR에 적절한 하우스 키핑 유전자를 이용하여 시판되는 키트를 사용하여 수행 (물질의 표를 참조). (재료의 표 참조) PCR을 수행하기 위해 시중에서 판매하는 정량적 PCR 열 순환기를 사용합니다. </li><li> 58 ° C로 설정 소둔 온도. Taq 중합 효소 / SYBR 녹색 믹스 제조업체의 사양에 추가로 자전거 매개 변수를 조정합니다. 프라이머 특이성에 대한 테스트 및 이량 체 형성을 프라이머 95 ° C에 65 ° C에서 0.5 ° C 증가 증가로 구성된 열 자전거 타는 프로그램에서 최종 용융 곡선 단계를 포함합니다. </li><li> 제어 유전자로서 18S RNA를 사용 ΔΔCT 방법 21 - 2 의한 상대적인 mRNA의 발현 수준을 결정한다. </li></ol>

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이 논문에서 제시하는 방법은 신경근 접합부 (NMJ)을 수리에 관여하는 메커니즘을 식별하는 고유 한 기회를 제공합니다. 이 무릎 근처 비복근 건 통과하여이 방법은 공통 비골 신경 분쇄 포함한다. 우리는 집게와 신경 압축의 5 초 후, 완전한 변성 부상 후 사일에 의해 주목을 보여준다. 젊은 성인 쥐에서 알파 - 모터 축삭은 십이일에 의해 손상되지 않은 쥐와는 구별 시냅스 사이트의 개혁에서 남중, 이후 부상 칠일에 신근 심지 longus 근육 (EDL)의 이전 시냅스 사이트를 reinnervate 시작합니다. 또, 선택 NMJ 관련 분자 수준 밀접 NMJ의 신경 분포 상태와 상관 관계가 있음을 보여준다. 중요한 것은, 이들 세포 및 분자의 변화를 식별 할 기회를 제공 TES 동일한 성별, 나이 (도 5A-B)의 동물 사이의 높은 재현성NMJ를 복구하는 역할을 t 요인. 그것이 주위의 근육과 혈관에 작은 손상을 초래 단지 작은 절개를 필요 비복근 건 통과하여 수술 절차의 관점에서, 공통 비골 신경 가...

젊은 성인과 건강한 동물에서 신경근 접합부(NMJ)는 α운동 축삭돌기의 신경 말단인 시냅스(presynapse)와 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChRs)가 선택적으로 응집하는 방외 근육 섬유의 특수 영역인 시냅스(postsynapse) 사이의 매우 안정적인 연결입니다1. 시냅스 전후 장치의 거의 완벽한 배치는 적절한 신경 전달, α운동 뉴런과 근육 섬유의 생존 및 운동 기능에 필요합니다. 불행히도 NMJ의 기능은 노화, 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 같은 질병, 자가면역 질환, 근육 및 말초 신경 손상에 의해 악영향을 받습니다2-5. 이러한 모욕은 종종 시냅스전 신경 말단의 퇴화를 초래하여 근육을 탈신경화시키고 운동 능력을 크게 변화시킵니다. 이러한 이유로 NMJ를 유지하고 복구하는 기능을 하는 분자를 식별하는 것이 최우선 과제가 되었습니다. 말초 신경은 표적을 재생하고 재신경 분포시키기 때문에 말초 신경 손상 모델은 NMJ 재생과 관련된 분자 변화를 식별하는 데 사용되었습니다. 
말초 신경 손상 모델은 종종 특정 신경 가지를 완전히 절단하거나 분쇄하는 것을 포함합니다6. 절단 후에는 내뇨관을 재형성하여 축삭 재생과 표적 세포 및 조직의 재신경 분포를 지연시켜야 합니다. 이러한 유형의 부상의 심각성은 또한 축삭돌기가 원래 경로에서 벗어나 원래 목표에 도달하지 못하는 결과를 초래합니다. 이것은 엔도네뇨리움이 인접하게 유지되는 분쇄를 통해 손상된 신경과 대조적이며, 재생 축삭돌기의 효율적이고 적절한 재성장을 위한 경로를 제공합니다. 또한 축삭돌기가 원래의 근육 섬유 파트너를 찾아 재신경 분포시킬 수 있습니다. 손상 모델에 관계없이, 축삭돌기가 표적을 재생하고 재신경질화하기 위해 발생해야 하는 많은 세포 및 분자 변화가 있습니다. 부상 후, 표적에 근접한 신경 분절은 Wallerian Degeneration7이라는 과정을 통해 분해되고 제거됩니다. 이 과정에는 슈반세포를 재생인자를 분비하고, 수초를 제거하고, 대식세포를 손상 부위로 모집하는 비수초화 세포로 재프로그래밍하고 탈분화하는 것이 포함됩니다8. 대식세포는 차례로 수초와 축삭 파편의 제거를 완료하며, 그렇지 않으면 재생 축삭9의 성장을 방해할 수 있습니다. 동시에 운동 뉴런과 감각 뉴런은 절단된 축삭돌기의 재생을 촉진하는 데 필요한 메커니즘을 활성화합니다. 재생하는 축삭돌기가 표적에 도달하면, 성장원뿔에서 정보를 적절하게 전달(운동 축삭돌기의 경우) 또는 수신(감각 축삭돌기의 경우)할 수 있는 신경 말단으로 변형되어야 한다10. 이와 관련하여, 알파 운동 축삭돌기는 성장 원뿔에서 절정에 이르는 일련의 잘 조직된 변화를 겪으며, 이는 표적 근섬유11의 시냅스 후 부위와 거의 완벽하게 반대되는 완전한 기능을 하는 시냅스 전 신경 말단으로 분화됩니다. 
좌골 신경, 경골 신경 및 부속 신경은 축삭 및 NMJ 재생12-14를 연구하기 위한 주요 선택이었습니다. 그러나 이러한 모델을 사용하여 동물 간 및 다른 조건에서 NMJ 재생과 관련된 세포 및 분자 변화를 조사할 때 여러 가지 단점이 있습니다. 첫째, 좌골 신경은 뒷다리 근육의 대부분을 공급하며, 부상은 움직임과 감각을 크게 제한합니다. 따라서 이 방법을 사용하여 운동만 또는 다른 요인과 함께 운동의 영향을 연구하는 것은 불가능합니다. 또한 좌골 신경은 다소 두꺼운 구조이므로 모든 축삭을 완전히 손상시키기 위해 많은 양의 압축력이 필요합니다. 이것은 차례로 더 깊은 곳에 있는 축삭의 내뇨관을 그대로 유지하면서 더 얕은 축삭돌기의 완전한 절단을 초래할 수 있으며, 이러한 축삭돌기 사이의 재생 속도와 충실도에 상당한 변동성을 도입할 수 있습니다. 이 신경의 완전한 절개는 많은 축삭돌기가 동일한 근육 섬유와 다시 연결되지 않는다는 점을 감안할 때 훨씬 덜 바람직합니다. 문제를 복잡하게 만드는 것은, 좌골 신경은 말단 신경 가지의 수와 기원 부위 모두에서 고유한 해부학적 다양성을 가지고 있다는 것입니다. 따라서 같은 부위에 병변을 일으키는 것은 매우 어렵습니다. 경골 신경은 더 작고 부서지기 쉬운 부상이지만, 이 신경 분지의 병변 부위 역할을 할 수 있는 쉽게 구할 수 있는 랜드마크도 없습니다. 
흉쇄유돌근에 공급하는 부속 신경 분지(뇌신경 XI의 일부)도 NMJ15의 재생을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 신경은 흉쇄유돌근의 NMJ가 다른 근육의 NMJ에 비해 살아있는 동물에서 더 쉽게 이미지화될 수 있기 때문에 특히 매력적입니다. 그러나 좌골 신경과 경골 신경과 유사하게, 같은 위치에서 이 신경을 손상시키는 데 사용할 수 있는 특정 랜드마크가 없기 때문에 실험 코호트의 개별 동물 간에 NMJ의 재생을 비교하기 위한 모델로 제한됩니다. 일관되지 않은 병변 부위는 NMJ 재신경 분포 속도에 변동성을 초래합니다. 이러한 단점으로 인해 여기에 제시된 절차는 다른 말초 신경 분지의 손상을 활용하여 재생 NMJ를 검사합니다. 
총비골신경이라고도 불리는 총비골신경은 동물들 사이에서, 그리고 다른 치료법에 걸쳐 NMJ의 재생을 검사할 수 있는 신뢰할 수 있는 신경으로 만드는 많은 특징들을 가지고 있습니다. 총비골 신경은 무릎에 있는 비복근의 외측 머리의 힘줄을 가로지르기 때문에 예측 가능한 해부학적 과정을 가지고 있으며, 이 교차점은 병변에 대한 안정적인 랜드마크 역할을 합니다. 신경은 관심 근육 근처에 있지만 해부학적으로 분리된 작고 최소 침습적 절개를 통해 접근합니다. 여기에 제시된 연구 결과는 재생 운동 축삭돌기가 70일 된 젊은 성인 암컷 마우스의 비골 신경을 분쇄한 후 8일 후에 신전 디지토럼 롱구스(EDL) 근육의 NMJ를 재형성하기 시작한다는 것을 보여줍니다. 중요한 것은 재신경 분포의 패턴과 속도가 같은 연령과 성별의 동물 사이에서 일관적이므로 NMJ를 유지하고 복구하는 데 필요한 세포 및 분자 변화에 대한 이해를 크게 촉진할 수 있는 신뢰할 수 있는 부상 모델을 제공한다는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>케타민</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.&nbsp;</td><td>003437&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>&nbsp; 주팜</td><td>1Z-73000-150910&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim-wipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-64800</td><td></td></tr><tr><td>80% EtOH/H20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 프로비오딘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1ml 인슐린 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Vannas</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 15 메스</td><td>Braintree Scientific</td><td>SSS 15</td><td></td></tr><tr><td>#5 펜치</td><td>Dumont</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>6-0 실크 봉합사 역절단 바늘</td><td>&nbsp; 봉합사 익스프레스</td><td>752B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>설치류 가열 패드</td><td>Braintree Scientific</td><td>AP-R-18.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 공액 알파-BTX</td><td>분자 프로브</td><td>B35451</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 스테레오 줌 현미경</td><td>올림푸스</td><td>562037192</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 700 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가변 흐름 연동 관류 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-3</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad iScript RT Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725200</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 연고</td><td>Puralube</td><td>1621</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin-2 항체</td>-<td>온라인</td><td>ABIN401605</td> 신경 필라멘트 항체-온라인 ABIN2475842 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비골 신경 손상 방법 : 신뢰할 수있는 분석은 확인하고 테스트 즉, 수리 신경 근육 학 접합 요인

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

신경 근육 접합부 (NMJ)은 노화, 상해 및 질병으로 인한 해로운 구조적 및 기능적 변화를 겪는다. 따라서, 유지 보수 NMJs 관련된 세포 및 분자 변화를 이해하는 것이 필수적이다. 이를 위해, 우리는 신뢰성 있고 일관 생쥐 NMJs 재생 조사하는 방법을 개발 하였다. 이 무릎 근처 비복근 근육 힘줄의 측방 헤드를 통과 신경 손상이 방법은 공통 비골 신경 분쇄 포함한다. 칠십일 세 여자 마우스를 사용하여, 우리는 모터 축삭 7 일 후 호감 내에서 이전 시냅스 목표를 reinnervate하기 시작 것을 보여줍니다. 그들은 완전히 십이일에 의해 이전 시냅스 영역을 다시 선점. 이 부상 방법의 신뢰성을 확인하기 위해, 우리는 개별 칠십일 세 여성 쥐 사이 reinnervation 속도를 비교했다. 우리는 reinnervated 시냅스 사이트의 수는 7, 9에서 마우스와 유사한 것을 발견하고, 십이일 후 호감. 있는지 확인하려면이 상처 분석법 또한 근육 분자량 변화를 비교하기 위해 사용될 수 있고, 우리는 근육의 니코틴 성 수용체 (감마 ACHR) 및 근육 특정 키나아제 (MUSK)의 감마 서브 유닛의 수준을 조사 하였다. 감마 - ACHR 서브 유닛과 사향이 높은 다음 탈 신경을 상향 조절하고 NMJs의 reinnervation 다음 정상 수준으로 돌아되어 있습니다. 우리는이 유전자와 근육의 신경 분포 상태에 대한 성적 수준 사이의 밀접한 관계를 발견했다. 우리는이 방법은 NMJ 및 기타 시냅스 수리에 관련된 세포 및 분자 변화에 대한 우리의 이해를 가속화 할 것이라고 믿는다.

일반적인 비골 신경은 또한, 공통 비골 신경이라고는 다리 (그림 1A)의 전방 측면에 비골의 머리 주위 스윙 오금 포사 위의 좌골 신경에서 발생한다. 피상적 깊은 비골 신경으로 분기 함께 발과 발가락의 dorsiflexors을 공급 (전방 경골근, 신근 심지 longus 및 브레비스 및 신근 halluces longus 근육), 그리고 다리의 everters (peroneus 근육)이 그것. 신경이 또한 발과 다리의 하단의 좌우 측면의 배부에 돌출 감각 섬유를 운반한다. 이는 운동 및 감각 축삭 구성된 비교적 얇은 구조이다. 이 신경 분기 예측 해부학 과정을 따른다. 그것은 비복근 근육 (도 1 및도 2)의 횡 방향 헤드의 건을 통해 실행되는 무릎 횡 신경 주로 표면이다. 일위치를 쉽게 피부 근막 (도 1a)의 손상을 제한 작은 절개로 도달 할 수있...

우리는 쥐의 근육 재신경 분포와 신경근 접합부의 재생을 신뢰성 있게 검사하기 위해 신경 손상 방법을 개발했습니다. 이 기술은 간단하고 재현성이 높은 수술을 통해 총비골 신경을 손상시키는 것입니다. 그런 다음 신근 digitorum longus muscle을 전체적으로 장착하여 평가한 근육 재신경화.

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

이 말초 신경 손상 방법의 전반적인 목표는 생쥐의 재생되는 신경근 접합부를 안정적으로 조사하는 것입니다. 이 방법은 재생되는 신경근 접합부와 관련된 분자적, 세포적 및 기능적 변화를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이 절차의 주요 장점은 근원성 변화가 거의 없는 상태에서 실험군 간의 신경근 접합부 재생 속도를 안정적으로 비교할 수 있다는 점입니다.시연은 제 실험실의 의대생인 William Dalkin이 진행하겠습니다. 절차를 시작하기 전, 80% ethanol을 사용하여 수술 부위, 보드 및 기구를 세척한 후, Povidone-iodine으로 소독하십시오. 그다음, 마우스를 수술 보드 위에 놓고 발가락 꼬집기(toe pinch)에 반응이 없는지 확인하십시오.구속 장치 내의 사지를 해부학적으로 자연스러운 위치에 맞추어 목표 후지로 정렬하고, 내회전이나 외회전 없이 무릎 관절을 약간 신전시킵니다. 그런 다음, 동물을 수술 현미경 아래로 옮기고 대물렌즈를 통해 골성 무릎 관절과 전경골근과 비복근 사이의 능선이 보일 때까지 보드를 조정합니다. 메스와 핀셋을 사용하여 총비골신경의 하부 주행 방향에 수직이 되도록 피부를 약 3cm 절개합니다.표층 근막을 따라 절개를 계속하여 대퇴이두근과 외측광근을 노출시킨 후, 근육들을 분리하기 위해 연결된 심층 근막을 1~2cm 정도 절개합니다. 다음으로, 기계적 견인기를 사용하여 대퇴이두근을 미측으로 견인하여 총비골신경을 노출시킵니다. 신경을 근위부로 따라가며 비복근 외측두의 힘줄과 교차하는 지점을 찾습니다.그다음, 미세 핀셋을 사용하여 핀셋 끝을 비복근 건의 외측 경계와 평행하게 맞춘 뒤 신경을 잡고, 5초 동안 일정하고 집중적인 압력을 가하여 총비골신경을 압착합니다. 핀셋을 신경 섬유와 수직이 되게 유지한 상태에서 핀셋 끝 바로 뒤쪽 영역의 조직을 잡고, 단단하지만 부드럽게 압력을 가하여 건의 경계를 따라 신경이 깨끗하고 선형으로 압착되도록 합니다. 수술 현미경을 통해 신경을 시각적으로 검사하여 조직이 완전히 압착되었는지 확인합니다.손상 부위의 신경은 반투명하게 보일 것입니다. 말초 축삭에서 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하는 경우, 손상 부위에서 형광이 사라집니다. 신경이 충분히 손상되었다면, 리트랙터를 제거하고 근육을 원래의 해부학적 위치로 재정렬하십시오.그다음, 6-0 실크 봉합사를 사용하여 절개 부위를 1~3회의 단순 단속 봉합으로 폐쇄하고, 생쥐를 깨끗한 케이지 내

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 보고서에서는 마우스 좌골 신경을 파멸시키는 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽게 사용할 수 hemostatic 집게를 사용하여 쉽고 reproducibly 전체 좌골 신경 호감을 생산하고 있습니다. 또한 좌골 신경 호감 후 신경 재생의 분석에 적합한 근육 전체가 마운트를 준비하는 방법을 설명합니다.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

이 동영상은 기능적 신경근 접합부를 평가하는 방법을 보여줍니다. 근육 조직과 운동 뉴런을 포함하는 생물반응기와 형광 현미경을 사용하여 뉴런의 빛에 민감한 채널을 자극하여 전기 신호를 생성하여 근섬유 수축을 일으킵니다.

동시 광 자극 및 비디오 녹화를 통한 기능적 신경근 접합부 평가

출처: Dalkin, W., et al. 비골 신경 손상 방법: 신경근 접합부를 복구하는 요인을 식별하고 테스트하기 위한 신뢰할 수 있는 분석법입니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 신경근 접합부(NMJ) 재생을 연구하기 위해 마우스에서 비골 신경 손상을 유도하는 수술 절차를 보여줍니다. 이 절차에는 비골 신경을 노출시키고, 통제된 압력을 가하여 손상을 유도하고, 축삭 재생을 지원하기 위해 신경외막이 손상되지 않도록 하는 것이 포함됩니다. 시간이 지남에 따라 대식세포는 축삭 파편을 제거하여 신경 복구와 NMJ의 재건을 촉진합니다.

신경근 접합부 재생을 연구하기 위해 마우스에서 비골 신경 손상 유도

신경근 접합부(NMJ)는 때때로 시냅스 실패로 이어질 수 있는 다양한 조건에서 변경됩니다. 이 보고서는 이러한 구조적 변화를 정량화하기 위한 형광 현미경 기반 방법을 설명합니다.

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.

신경 근육 학 교차로 기능을 측정

Axonal 흥분 기법 이상 및 퇴행 성 돌이킬 수 없는 이벤트를 앞 생물 변화를 검사 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 이 원고는 마 취 쥐의 척 골 신경에 이러한 기술의 사용을 보여줍니다.

Vivo에서 Axonal 흥분 테스트 쥐 척 골 신경의 electrophysiological 측정

제시된 것은 쥐에서 상이한 유형의 중간 신경(MN) 병변 및 수리를 생성하는 프로토콜이다. 추가적으로, 프로토콜은 몇몇 비침범성 행동 시험 및 생리적인 측정을 사용하여 신경의 기능적 회복을 평가하는 방법을 보여줍니다.

쥐에서 중간 신경 재생을 평가하는 기능적 및 생리적 방법

자동 걸음걸이 분석은 말초 신경 손상 및 척수 타박상 손상의 설치류 모델에서 기능적 회복을 평가하는 실행 가능한 도구입니다. 다양한 실험 모델에서 운동 기능을 평가하기 위해 단 하나의 설정만 필요하지만, 동물의 세심한 하드 및 소프트 웨어 조정 및 훈련이 매우 중요합니다.

주변 신경 또는 척수 타박상 부상으로 설치류의 기능적 회복을 평가하기 위한 자동 걸음걸이 분석

모터 회복의 평가는 실험적인 말초 신경 연구에서 벤치마크 결과 측정으로 남아 있습니다. 쥐의 티볼리스 전방 근육의 동면 파탄력 측정은 경련성 신경 결함의 재구성 후 기능적 결과를 평가하는 귀중한 도구입니다. 방법과 뉘앙스는이 문서에 자세히 설명되어 있습니다.

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신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

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