비골 신경 손상 방법 : 신뢰할 수있는 분석은 확인하고 테스트 즉, 수리 신경 근육 학 접합 요인

이 말초 신경 손상 방법의 전반적인 목표는 생쥐의 재생 신경근 접합부를 안정적으로 검사하는 것입니다. 이 방법은 재생되는 신경근 접합부와 관련된 분자, 세포 및 기능적 변화를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 절차의 주요 장점은 근육 접합부 재생의 속도를 근육 변화가없는 상태에서 실험 그룹 간에 안정적으로 비교할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 의대생인 William Dalkin입니다. 시술을 시작하기 전에 80% 에탄올을 사용하여 수술 부위, 보드 및 기구를 청소한 다음 포비돈 요오드로 소독합니다. 다음으로, 수술 보드에 마우스를 놓고 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다.

구속구 내의 팔다리를 해부학적으로 자연스러운 위치에서 대상 뒷다리와 정렬하고 무릎 관절을 내부 또는 외부 회전 없이 약간 확장하십시오. 그런 다음 동물을 외과용 현미경으로 옮기고 뼈가 있는 무릎 관절과 경골 전방근과 비복근 사이의 융기가 대물렌즈를 통해 보일 때까지 보드를 조정합니다. 메스와 집게를 사용하여 총비골 신경의 기저 과정에 수직으로 피부를 약 3cm 절개합니다.

대퇴이두근과 광활근외측근을 노출시키는 표재성 근막을 통해 절개를 계속한 다음 연결된 깊은 근막을 통해 1-2cm 절개를 하여 근육을 분리합니다. 다음으로, 기계적 견인기를 사용하여 대퇴 이두근을 꼬리 쪽으로 후퇴시켜 공통 비골 신경을 드러냅니다. 비복근(gastrocnemius muscle)의 외측 머리에 있는 힘줄과 교차하는 부분이 발견될 때까지 신경을 근방으로 추적합니다.

그런 다음 가는 집게를 사용하여 비복근 힘줄의 측면 경계와 평행하게 끝을 정렬하는 신경을 잡고 5초 동안 꾸준하고 집중적인 압력을 가하여 공통 비골 신경을 분쇄합니다. 겸자를 섬유에 수직으로 잡고 집게 끝 바로 뒤의 부분으로 조직을 잡고 힘줄 경계를 따라 신경을 깨끗하고 선형으로 으깨기 위해 단단하지만 부드러운 압력을 가합니다. 수술용 현미경을 통해 신경을 육안으로 검사하여 조직이 완전히 부서졌는지 확인합니다.

신경은 부상 부위에서 반투명하게 보입니다. 말초 축삭돌기에서 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하면 형광이 손상 부위에서 사라집니다. 신경이 충분히 손상되었다면 견인기를 제거하고 근육을 해부학적 위치로 재정렬합니다.

그런 다음 6-0 실크 봉합사를 사용하여 1-3개의 간단한 단속 봉합사로 절개 부위를 봉합하고 완전히 회복될 때까지 모니터링이 가능한 깨끗한 케이지의 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 미세한 겸자를 사용하여 5초 동안 신경을 압박하면 부상 부위에서 YFP가 사라집니다. 상피신경(epineurium)은 연속적으로 유지되어 축삭돌기를 원래 목표로 정확하게 재생하기 위한 통로 역할을 합니다.

생후 70일 된 암컷 마우스의 경우, 신경 손상은 분쇄 후 4일이 지나면 뉴런 소마에서 원위부에 있는 모든 축삭 분절의 퇴화를 일으키기에 충분합니다. 크러시 후 7일이 지나면 신경 말단이 비워진 시냅스 후 부위를 활발하게 다시 차지합니다. 12일째에는 신경 말단이 시냅스 전 부위로 계속 분화되고 신경근 접합부가 완전히 재생성됩니다.

같은 기간 동안 비신경을 투여한 쥐 사이에서는 변동성이 거의 없으며, 이는 비골 신경 분쇄가 같은 연령과 성별의 동물 간의 근육 재생을 비교하기 위한 분석법으로 사용될 수 있음을 보여줍니다. 예상대로, 알파 운동 축삭돌기(alpha motor axons)는 근육 섬유를 재생성하면서 많은 변화가 일어납니다. 축삭 성장 원뿔은 시냅스 후 부위와 접촉하면서 확장되고 분기되어 시냅스 후 부위의 특정 영역에서 성장하며 시냅스 후 부위와 축삭 말단의 거의 완전한 병치에서 절정에 이릅니다.

정량적 PCR에 의해 입증된 바와 같이, 신경근 접합부 관련 유전자는 탈신경 후 증가하고 신경근 접합부가 재생성됨에 따라 감소합니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시간을 들여 모든 구조를 시각화하고 완전한 분쇄가 이루어졌는지 다시 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 QPCR과 같은 다른 방법을 수행하여 어떤 유전자가 상향 또는 하향 조절되는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 쥐의 시냅스 재생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스의 신경근 접합부 재형성 속도를 조사하기 위해 비골 신경 분쇄를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.