상업에서 로서도으로 Alkenones의 분리와 바이오 디젤 생산을위한 실험 프로토콜

이 실험 절차의 전반적인 목표는 상용 Isochyrsis 조류로부터 바이오디젤을 생산하는 동시에, 가치 있는 공동 생산물인 장쇄 알케논(long chain alkenones)을 함께 분리하는 것입니다. 이 방법은 재생 에너지 분야의 핵심적인 질문, 즉 조류 바이오 연료가 석유 기반 연료의 실행 가능한 대안이 될 수 있는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 사용하는 조류가 이미 산업적으로 배양되고 있어 여러 상업적 공급업체로부터 수 킬로그램 단위로 구매할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 특정 조류는 공동 생성물로 분리 가능한 장쇄 알케논(long chain alkenones)으로 알려진 독특한 지질군을 생합성합니다. 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 John Williams가 진행하겠습니다.

시판되는 습식 isochrysis 페이스트를 준비하려면, 1kg 포장지에 작은 구멍을 내어 약 300g을 150 x 75mm 결정 접시에 짭니다. 이 페이스트는 약 80%의 수분을 함유하고 있으며, 색상은 짙은 녹색 또는 거의 검은색에 가깝고 자극적인 냄새가 납니다. 페이스트를 공기 중에서 건조시켜 약 20mm 두께의 층을 만듭니다.

건조된 바이오매스를 질량을 미리 알고 있는 셀룰로오스 추출 딤블에 긁어 넣습니다. 그런 다음 isochrysis 바이오매스의 무게를 기록합니다. 약 50에서 60 g의 건조된 isochrysis를 속슬렛 추출 장치로 옮깁니다.

그런 다음, 소슬렛 플라스크에 400 milliliters의 hexanes를 채웁니다. 냉각수와 열원을 켜고 소슬렛 추출을 1~2일 동안 반복합니다. 용매의 색상이 진한 녹색에서 옅은 노란색으로 변하면 추출이 완료된 것입니다.

실온으로 식힌 후 회전 증발기를 사용하여 헥산을 제거합니다. 마지막으로 헥산 조류 오일의 무게를 측정합니다. 헥산 조류 오일이 담긴 플라스크에 메탄올과 디클로로메탄을 2:1 비율로 혼합한 용액을 10배 부피로 넣어 용해시키는 것으로 시작합니다.

다음으로 마그네틱 바를 넣고, 오일 부피의 2와 2/3배에 해당하는 물을 추가한 뒤, 오일 무게의 절반에 해당하는 질량의 수산화칼륨을 넣습니다. 이제 플라스크를 500 mm 길이의 환류 냉각기에 연결합니다. 흄 후드 내에서 혼합물을 교반하며 60 °C로 3시간 동안 가열합니다.

반응액을 냉각시킨 후, 회전 증발 농축기로 유기 용매를 제거합니다. 그런 다음, 남은 수성 혼합물을 1L 분별 깔때기에 붓고 동일한 부피의 hexanes를 첨가합니다. 모든 물질이 깔때기로 옮겨지도록 플라스크를 hexanes로 헹굽니다.

깔때기를 흔들어 층이 분리되도록 합니다. 다음으로, 아래쪽의 수성층을 플라스크에 붓고 위쪽의 유기층을 두 번째 플라스크에 따라냅니다. 두 층을 모두 보관하십시오.

유기층이 연한 황록색이 될 때까지 헥산 추출을 반복합니다. 그 다음 수집된 유기 추출물들을 합치고 회전 증발 농축기로 농축하여 중성 지질을 분리합니다. 이 지질들은 녹색 고체 형태로 나타나며 60에서 70 °C 사이의 녹는점을 가집니다.

다음으로, 6 M 염산을 사용하여 수성층의 pH를 2로 산성화합니다. 그런 다음, 이전과 동일하게 헥산과 분별 깔때기를 사용하여 산성화된 수성층에서 유리 지방산을 추출합니다. 마지막으로, 회전 증발기로 결합된 유기 추출물에서 헥산을 제거하여 정제된 유리 지방산을 얻습니다.

30 °C 직상에서 녹는 검은색에 가까운 진녹색의 오일리한 잔여물입니다. 6배 부피의 methanol chloroform을 사용하여 지방산을 용해시킨 후, 모든 지방산이 반응 플라스크로 옮겨지도록 헹구면서 용액을 교반 바가 들어 있는 두꺼운 벽의 고압 반응 플라스크에 붓습니다. 다음으로, 흄 후드 아래에서 농축 황산을 첨가합니다.

플라스크를 밀봉하고, 1시간 동안 교반하면서 혼합물을 90 °C로 가열합니다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 분별 깔때기에 붓고 2배 부피의 물을 첨가합니다. 이제 분별 깔때기를 흔들어 층이 분리되도록 한 다음, 아래층을 미리 무게를 잰 둥근 바닥 플라스크에 따라냅니다.

그 후, 회전 증발기로 용액을 농축하고 생성된 바이오 디젤의 질량을 기록합니다. 이제 가스 크로마토그래피를 사용하여 해당 물질을 분석할 수 있습니다. 중성 지질은 둥근 바닥 플라스크에서 긁어내어 무게를 잰 후, 정제를 위해 플라스크로 옮깁니다. 먼저 최소량의 디클로로메탄에 중성 지질을 녹이는 것부터 시작하십시오.

그 다음, 100 g의 실리카겔이 충진된 크로마토그래피 컬럼에 용액을 주입합니다. 이어서, 약 150 mL의 디클로로메탄을 사용하여 가벼운 압력으로 실리카겔을 통해 용액을 희석시킵니다. 용매를 채울 때 실리카겔 층이 흐트러지는 것을 방지하기 위해 컬럼 상단에 얇은 모래 층을 추가합니다.

250 milliliter 라운드 바텀 플라스크에 노란색 윈트를 수집합니다. 그런 다음 회전 증발기로 dichloromethane을 제거합니다. 결과물은 오렌지색 고체 형태여야 합니다.

끓는 헥산에서 고체 성분을 재결정화합니다. 먼저 100 milliliters를 넣은 다음, 용액이 균질해질 때까지 끓는 헥산을 계속 추가합니다. 이제 결정화를 촉진하기 위해 용액을 실온으로 천천히 냉각시키고, 여과 장치를 사용하여 결정화된 알케논(alkenones)을 수집합니다.

소량의 얼음처럼 차가운 hexanes를 사용하여 플라스크를 헹굽니다. 처리 전, isochrysis 페이스트를 먼저 건조시켜 해조류 냄새가 나는 검은색의 녹색 조각 형태 물질을 얻었습니다. 이와 대조적으로, 분말 형태의 isochrysis는 황갈색의 미세하게 분쇄된 건조 분말로, 추가 처리 없이 그대로 사용하였습니다.

헥산(hexanes)을 이용한 Soxhlet 추출 결과, 분말보다 페이스트에서 추출한 조류 오일의 수율이 상당히 더 높게 나타났습니다. 조류 오일 내의 아실글리세롤(Acylglycerols)은 수용성 카르복실레이트로 전환되었으며, 이를 통해 두 출발 물질 모두에서 중성 지질과 유리 지방산이 거의 정량적인 부피로 추출되었습니다. 하지만 생성물의 비율은 서로 달랐습니다.

에스테르화를 통해 지방산 메틸 에스테르가 생성되었습니다. 바이오 디젤로도 알려진 이 물질은 검은색에 가까운 진한 녹색의 오일리한 액체입니다. 수율은 90%를 초과하였습니다. 생성물은 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 탈색하였습니다.

정제된 바이오디젤 연료의 FAME 분석 결과, 두 가지 출발 물질에서 유사하지만 동일하지는 않은 프로파일이 나타났습니다. DCM을 사용하여 실리카로 용해된 중성 지질을 여과하면 적황색 고체가 얻어지며, 이를 헥산으로 재결정하여 분석적 순도의 알케논을 얻었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 시판되는 이소크리시스를 바이오디젤로 가공하고 부산물로 순수 알케논을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 추가 연구를 위해 상당량의 조류 바이오디젤과 알케논을 지속적으로 생성할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 예측이나 시뮬레이션에 의존하는 대신, 다양한 연료 테스트를 수행하는 데 필요한 충분한 양을 확보함으로써 조류 바이오디젤의 연료 특성을 비판적으로 검토할 수 있는 길이 열렸습니다. 강산 또는 강염기를 다루거나 밀폐된 용기 내에서 내용물을 가열하는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

이 단계들을 수행하는 동안 반드시 적절한 개인 보호 장구를 착용하고 흄 후드 내에서 작업하십시오.