Name: 마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 배우세요 마우스 골수 세포 배양에서 GM-CSF를 이용해 폐포와 같은 대식세포와 수지상 세포를 생성 및 식별하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구와 폐 질환 치료에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 연구 (CIHR) (교부금 MOP-119503)과 캐나다의 자연 과학 및 공학위원회 (NSERC)의 캐나다 연구소에 의해 투자되었다. NSERC도 YD하는 여름 studentships을 지원 AA YD는 4 년 교제 수상 브리티시 컬럼비아 대학 (UBC)에서 지원, AA는 대학원생의 석사 수상 (CGS-M)와 CIHR에 의해 지원됩니다. 우리는 그림 2의 이미지를 생성하는 데 사용되는 현미경으로 지원 캘빈 Roskelley 감사합니다. 우리는 또한 UBC 동물 및 유동 세포 계측법 시설의 지원을 인정합니다.

마우스는 브리티시 컬럼비아 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인 절차에 의한 윤리적 인 동물 연구를위한 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 따라 안락사시켰다. 1. 마우스 대퇴골과 경골에서 단일 세포 골수 서스펜션 취득 <ol><li> 생물 안전 캐비닛 (BSC) 70 % 에탄올로, 다음 청소 / 스프레이 B​​SC 표면을 캐비닛 공기를 제거하고 공기 흐름의 안정화를 허용하는 과정의 시작에 앞서 15 분에 전환합니다. 프로토콜의 전체에 대한 가능한 한 무균 모든 것을 유지. 비 멸균 상태에서 뼈를 절단하지 마십시오. </li><li> 70 % 에탄올에 몸을 담근에 의해 해부 도구를 준비, 5 % 소 태아 혈청 (HBSS-FCS), 멸균 페트리 접시 (100mm X 15mm), 1 행크의 균형 소금 솔루션 (해부 가위, 집게 2 쌍의 1 쌍) BSC에있는 ML의 주사기 26½ 게이지 바늘 원추형 수집 튜브 (15 ml를 50 ml)에 용해시키고, 종이 타월. </li><li> 사용하여 마우스를 안락사기관의 동물 연구 윤리위원회의 승인을 프로토콜. 상기 BSC로 가져와 하나 또는 두 종이 수건 위에 배치하고 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. </li><li> 뚜껑에 2 ml의 - BSC에에서 나누어지는,베이스에 HBSS-FCS 10 ml의 1을 멸균 페트리 접시에 무균를 엽니 다. </li><li> 이 위를 향하도록 뒷면과의 뱃속에 마우스를 놓고 비 지배적 인 손의 손가락으로 가슴 부분 주위의 피부를 들어 올립니다. 피부가 상승 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 위의 절개 대회의이 끝날 때까지 당겨 계속 위장 뒤쪽에서 마우스 주위의 피부를 떨어져 당겨 조심스럽게 잘라 양쪽 끝, 각각의 손으로 한쪽 끝을 잡아와. </li><li> 이 위를 향하도록 위장에 마우스를 플립, 그리고 한 손으로 아래로 다리쪽으로 피부의 아래쪽을 당겨 다리가 노출 될 때까지 피부를 뒤로 당겨 유지한다. </li><li> 마우스까지의 발을 잡고 발목 관절 위의 아킬레스 힘줄을 잘라근육 접속 인대 위 경골의 하단부에 발한다. 이 다리 뼈에서 발을 느슨하게. </li><li> 발에서 다리를 들고 있지만, 낮은 다리에서 허벅지 근육을 절단하는 대퇴골의 하단부에 모든 무릎 관절 주위에 가위로 근육과 인대를 잘라. 부드럽게 떨어져 비골과 대퇴 표면에서 느슨하게 근육을 당겨 집게를 사용합니다. 무거운 출혈을 방지하기 위해 대퇴 동맥을 절단하지 않도록주의하십시오. </li><li> 한 손으로는 발에 들고, 고관절에서 대퇴골의 상단에서 아래로 눌러 열린 가위, 다리를 회전하고 무료로 마지막 컷을 만들기 위해 가위를 사용하는 동안 고관절에서 대퇴골을 분리 부드럽게 당겨 몸에서 다리. </li><li> 이후이 시점에서, 전용 살균 집게로 조직을 개최합니다. 일단 다리에 잡고 다른 쪽 다리를 잡아 당깁니다. 참고 : 연결하는 인대 단계에서 절단으로이 많은 힘을 필요가 없습니다1.9. 또한, 단지 뼈가 융합 발목 위의 경골을 잘라. </li><li> 한 집게 세트와 서로 경골과 비골의 기단부와 대퇴골의 말단에 의해 다리를 잡고 조심스럽게 대퇴골과 슬개골에서 그들을 분리하는 무릎 관절의 반대 방향으로 경골과 비골을 구부. </li><li> 여전히 낮은 다리 뼈에 부착 남아있는 인대와 근육을 당겨 집게를 사용합니다. 이 골수 세포를위한 플러시 너무 작아 여기, 집게 결합 조직과 함께 제거 비골. 반전 페트리 접시 뚜껑에 청소 경골를 놓습니다. </li><li> 한 집게 세트와 서로 슬개골과 대퇴골의 하단을 잡고 제거를위한 공동의 반대 방향으로 슬개골과 주변 조직을 구부리십시오. 그리고 대퇴골에서 결합 조직을 나머지 닦아; 집게와 함께 그들을 떼어과 반전 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다. 슬개골을 폐기하십시오. </li><li> 1.7 반복- 다른 다리와 1.13이 필요합니다. 필요한 경우 교통 1 ml의 멸균 HBSS - FCS를 포함하는 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 뼈를 전송합니다. </li><li> 1, 반전 페트리 접시 뚜껑에 뼈를 배치 - HBSS-FCS 2 ㎖ 여전히 경골과 대퇴골에 연결된 모든 잔여 조직을 청소 집게를 사용하여 다음 HBSS- 10 ㎖를 포함하는 페트리 접시의 바닥에 뼈를 전송 FCS. 대안 적으로, 뼈를 세척하고 70 % 에탄올 불린 조직을 사용하여 부착 근육 조직을 제거한다. </li><li> 가위로 반으로 뼈의 각을 잘라. 뼈가 접시에 머물 수 있도록 절단하면서 부분적으로 멸균 뚜껑 페트리 접시를 보호. 대안으로, 다음 단계에서 세척 할 수 있도록 각각의 뼈의 단부를 잘라. </li><li> 1 ML의 주사기에에 26½ G 바늘을 부착하고, 페트리 접시에서 1 ml의 HBSS-FCS를 그립니다. 뼈 조각의 끝 부분에 바늘의 끝을 삽입하고 골수 세포 (뼈 안에 부드러운 빨간색 조직)를 세척하십시오. 머리에 바늘을 삽입뼈와 구단의 모든 적색 골수가 제거 될 때까지. 색 흰색으로 뼈를 관찰합니다. </li><li> 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 주사기를 통해 몇 번 골수의 눈에 보이는 덩어리를 전달합니다. </li><li> 플러시 뼈를 폐기하십시오. 잘 세포 현탁액을 혼합하고 포집 관에 전송하는 데 10 ml를 피펫을 사용합니다. 접시에 잔류 세포를 수집하는 HBSS-FCS의 5 ㎖로 한 번 페트리 접시를 씻어. 얼음에 세포를 놓습니다. 주 :이 저장되면 골수 세포 현탁액은 아직 실행 가능 - 39 ° C에서 3 시간. </li></ol> 골수 세포의 2. 도금 및 배양 (골수) <ol><li> 다음 시약 및 소모품을 준비합니다. <ol><li> 2 mM 트리스 pH를 7.2의 최종 용액에 0.84 %의 염화 암모늄함으로써 적혈구 (RBC) 용해 완충액을 준비하고, 0.2 마이크론 필터를 통해 여과하여 멸균. </li><li> 10 % FCS, 20 mM의 HEPES, 1X 비 필수 아미노산, 55 #를 추가하여 BMC 매체를 준비181; RPMI 배지 1640 M 2- 머 캅토 에탄올, 50 U / ㎖ 페니실린 및 스트렙토 마이신, 1 mM 피루브산 나트륨, 및 2 mM L- 글루타민. </li><li> 시중에서 판매하는 재조합 GM-CSF를 구하거나 GM-CSF 유전자 (20)로 형질 Ag8.653로 융합 시킴으로 수 수득 골수종 세포에서 뜨는을 포함하는 GM-CSF를 사용합니다. ELISA에 의해 상층 액에서 GM-CSF의 농도를 결정하고 BMC 미디어에 20 ng를 / ㎖의 등가를 추가합니다. </li></ol></li><li> 5 분 동안 314 XG에서 골수 세포를 스핀 다운. 펠렛을 적혈구에 의한 적색이다. BSC에에서, 흡입 진공 활용하여 펠렛을 푼 다음 RBC의 용해 버퍼 10 ㎖를 추가 부착 된 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 뜨는을 대기음. 소용돌이 세포를 재현 탁하고 실온에서 5 분간 RBC 용해 완충액에서 배양. </li><li> HBSS-FCS 후 5 분 동안 314 XG에서 세포를 회전하고 뜨는을 대기음의 10 ML을 추가합니다. 화이트 색상으로 세포 펠렛을 준수하십시오. BMC 미디어의 원하는 볼륨에서 세포를 재현 탁. </li><li> resu를 계산0.4 % 트리 판 블루와 죽은 세포를 염색 후 혈구를 사용하여 spended 세포. 참고 한 다리 (단일 경골 및 대퇴골)에서 골수를 사용하는 경우, BMC 배지 5 ㎖에 재현 탁 세포 현탁액 10 μL를 가지고 블루 0.4 % 트리 판 70 μL로 희석하여 잘 혼합하고 10 μl를 전송할 혈구 챔버 1/8 셀 희석. 사분면 내 생존 세포 수 : 네 사분면 카운트의 평균 희석 계수 × 104 = mL의 세포 수를 X. RBC 용해 후 4 × 10 7 세포 - 대퇴골과 한쪽 다리에서 경골은 일반적으로 약 2를 얻을 것입니다. </li><li> 배양이 끝날 때 실험을 위해 필요한 총 세포 수에 기초하여 하류 실험에 필요한 골수 배양 물 10 ㎖ 접시의 수를 추정한다. 주 : 각 접시는 2 × 10 6 골수 초기 시딩에서 세포와 수익률 5 필요 - 7 일에서 10 × 10 6 세포를. <ol><li> 알리5 분 동안 314 XG에서 스핀 다운 새 튜브에 도금을위한 셀의 총 개수를 quot 상등액을 흡인하고, BMC 배지에서 4 × 106 세포 / ㎖로 세포를 재현 탁. </li></ol></li><li> BMC 매체의 9.5 ml의 GM-CSF (재조합 또는 상층 액을 포함하는 GM-CSF)에서 200 NG를 포함하여 새로운 멸균 100mm X 15mm 페트리 접시를 준비합니다. 10ml에 2 × 105 세포 / ml의 최종 농도 페트리 접시의 중앙에 4 × 106 세포 / ㎖의 골수 세포 500 μl를 추가한다. 주 : 멸균 페트리 접시가 아닌 조직 배양 접시를 사용하는 것이 중요합니다. 세포를 추가 할 때 또한, 세포가 중앙에 집중 남아 보장하고 파종 후 미디어를 변경하는 동안 요리에 방해를 최소화 할 수 있습니다. 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 품어. 이것은 문화의 날 0입니다. </li><li> 3 일에, 세포의 각 접시에 GM-CSF의 200 NG를 포함하는 신선한 BMC 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 방해 O를 최소화하기 위해주의서스펜션에 집중 세포 F. 세포 배양의 총 부피는 이제 20 ㎖이다. </li><li> 100X 배율의 광학 현미경 하에서 세포를 관찰한다. 다수의 비 부착 세포 (원형)과 몇 부착 세포 (평면)를 관찰한다. 꽃의 서너 닮은 꽃잎 군에서 세포 증식을 나타내는 볼 수있다. </li><li> 하루 6 일 반 용지 변경을 수행합니다. 조심스럽게 5 분, 흡인에 대한 314 XG에 스핀 다운, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 미디어 10 ㎖를 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> GM-CSF, 부드럽게 선회 및 20 ㎖ 총 부피의 원래 세포 배양 접시에 20 ng를 추가 / ㎖을 함유하는 신선한 BMC 배지 10 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁. 현미경으로 세포를 관찰한다. 참고 : 7 일 문화는 70 %에 있거나 부착 평면 셀 라운드 비 부착 세포의 밀도 구름 포화 상태에 더해야한다. </li></ol> 3. 수집 및 유동 세포 계측법에 대한 BMDC와 BMDMs 준비 <ol> &lt;리&gt; 4 ° C에서 모든 버퍼를 유지합니다. </li><li> 셀, 50 ML 원뿔 포집 관에 배양 상등액의 제 1 이송 10ml를 수확하기 위해 하루 10으로 7 일에서 세포를 수확 후 약 30도에 의해 수직으로 접시를 기울이고 나머지 10 ml를 피펫 팅하여 요리를 씻어 요리의 상단에서 문화. 이 세척 5 회, 1/3 접시를 회전 할 때마다 반복합니다. </li><li> 동일 수집 튜브에 세포의 나머지 10 ml의 이동 플레이트 및 부착 세포를 버린다. 주 : 세척 비 부착 느슨하게 부착 세포를 제거합니다; 평탄 부착 세포의 세척에 저항. 일반적으로, 5 사이 - 10 × 10 (6) 비 부착 세포는 하루 7과 2에 하나의 플레이트에서 예상 -, 10 일에 5 × 10 6 셀 루츠 외 있지만. 하루에 10에서보고 된 10 × 10 6 세포를 부착 세포는 정상적으로 수행되지 않습니다. 그러나, 이들 세포는 필요하다면 비 - 부착 세포와 비교 될다음, 그들은 제거 될 수있다. 1X PBS, 비 부착 세포를 제거한 후 접시 pH 7.4의 0.7 mM의 EDTA 5 mL를 추가 분리 튜브에 부착 세포를 제거하고 수집하도록 상하로 5 분, 피펫, 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 5 분 314 XG에서 수집 된 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음. 4 ° C에서 5 ml의 멸균 BMC 매체에 재현 탁은, 소용돌이 부드럽게 혼합하고, 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 계산합니다. 참고 : 5 얻을 것입니다 각 접시 - 하루 7 문화 10 × 10 (6) 비 부착 세포를. 지금부터, 4 ° C에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 유세포 분석, 5 ㎖ 폴리스틸렌 둥근 바닥 튜브에 2 × 105 세포를 각각의 샘플에 대한 전달은 각 4 ° C (1X 인산 완충 식염수, 2 mM의 EDTA, 2 % 소 혈청 알부민)로 FACS 완충액 300 μL를 추가 견본. </li><li> 5 분 314 XG에서 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음. 상기 보이는 흰색, 불투명 한 펠렛을 관찰튜브의 바닥. </li><li> 표지 된 Ab의 Fc 수용체 100 ㎕에 재현 탁 된 세포 (골수종 세포주의 제조에서 사용 2.4G2 1/10 뜨는) Fc 수용체 결합을 차단하고 4 ℃에서 20 분 동안 배양. 그런 다음 5 분 동안 314 XG에서 세포를 스핀 다운, 각 샘플 부드럽게 소용돌이에 FACS 버퍼의 300 μl를 추가하고 뜨는을 대기음. </li><li> 0.2 ㎍ / ㎖의에서의 CD11c-PeCy7 100 ㎕에 재현 탁 세포, 0.25 ㎍ / ㎖의에서 GR1 - 퍼시픽 블루, 0.05 ㎍ / ㎖의에서 MHCII-APC 및 FL-HA는 약 / ㎖ 2 μg의는 대 식세포와 수지상 세포를 식별합니다. 주 : FL-HA는 형광 및 닭 빗 히알루 론산 나트륨을 사용하여 집으로 준비는 이전에 설명 21. </li><li> 세포 표면에 결합 할 수 있도록 39 ° C에서 20 분 동안 인큐베이션. 각 샘플에 FACS 버퍼의 300 μl를 추가, 부드럽게 소용돌이 후 4 ° C에서 5 분 동안 314 XG에 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음 참고 :. 바이오 경우형광 스트렙 타비 딘과 9 - tinylated 항체 3.8에 사용되는 3.8를 반복합니다. </li><li> 혼합 5 분 동안 314 XG에서 세포를 스핀 다운 FACS 버퍼의 또 다른 300 μl를 부드럽게 소용돌이와 세포를 씻으십시오. 뜨는을 대기음 0.1 포함 FACS 버퍼 200 μL의 세포를 재현 탁 - 생존 할 셀 라벨을 프로피 디움 아이오다 이드 또는 DAPI 1 ㎖ 당 0.2 μg의합니다. 셀은 유세포 분석 (22)에 대한 준비가되어 있습니다. 결과를 참조하고, 인구의 자세한 내용은 그림 3과 세포를 어떻게 게이트했다 : 주. </li></ol>

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저자는 재정적 이해 상충이 없습니다.

이 논문에서는 루츠 외. (6)로부터 구성되는 단일 마우스 골수 배양 물에서 GM-CSF 유도 된 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 이 문화의 미성숙 수지상 세포와 대 식세포을 구별 결합 MHCII 표현과 FL-HA 이전에 곤란 하였다 (그림 3C 참조). 이것은, 함께 Helft 등. (19)에 의해 다른 보고서로, 이전에는 수지상 것으로 생각되었다 GM-CSF 유도 BMDC 문화에서 이질성을 보여줍니다. Helft 등. (19)은 아직도 상당한 대식 세포 인구를 발견 BMDCs를 생성하는 매우 다른 배양 조건을 사용했다. GM-CSF에 의한 대 식세포는 폐포 대 식세포 유사 및 FLT3 리간드 보충 BMDC 문화는 고전과 형질 DC가 3,4를 생산하는 반면, GM-CSF 유도 수지상 세포는 염증 DC가 유사. 다른 DC와 대식 세포 인구는 ...

몇몇 시험 관내 배양 방법은 골수 유래 대 식세포 (BMDMs) 및 하나 이상의 성장 인자의 조합을 사용하여 골수 - 유래 수지상 세포 (BMDCs)를 생성하기 위해 설명되었다. BMDMs는 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 또는 GM-CSF, 2를 사용하여 골수 세포를 배양하여 생성 될 수있다. BMDCs를 들어, 골수 문화 FLT3 리간드의 추가 (B220 + 각각의 CD11c 높은 / MHCII 높이의 CD11c 보라)을 문화 3,4 9 일 후 비 부착 클래식 형질 수지상을 발생시킨다. 대조적으로, 비 - 부착 세포는 GM-CSF 단독 5,6- 함께 배양 7 내지 10 일 후에 생성, GM-CSF 및 IL-4 7 또는 GM-CSF 및 FLT3 리간드 8,9 BMDCs 더 자세히 염증성 수지상 닮은 생성 (중 CD11c 높은, MHCII 높은 CD11b를 +) 10. 이러한 시험 관내 배양 물 식세포를 생성하는데 사용되는 동안 또는각각의 문화는 순수한 인구를 초래하는 경우 DC가, 그것은 명확하지 않다. 예를 들면, GM-CSF에 부착 배양 세포가 동질 및 관찰 가변성 인 추정 식세포 5 수지상 6,11-13로 사용되는 것과 동일한 배양에서 비 부착 세포 인 것으로 설명되었지만 때문에 개발 14, 15의 다른 단계에. 또한, 연구는 생체 16,17 폐포 대 식세포 현상에 필수적인 성장 인자로 GM-CSF를 발견하고, 폐포 대 식세포 16,17,18 형상을 생성하는 시험 관내에서 사용될 수있다. 접착 이외에, GM-CSF 치료 골수 배양에서 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하기위한 절차는 GM-CSF 골수 배양 물 내에 존재하는 이질성 제안 매우 유사하다. 이것은 참으로이 논문은 BMDC 문화의 비 접착 부분에 BMDMs의 존재를보고 같은 경우 것으로 보인다. 한 논문에서, 그들은 identifiED 가장 밀접 폐포 대 식세포를 닮은 및 T 세포 (19)를 활성화하기 위해 환원 능력을 가진 유전자 발현 특성을 발현하는 CD11c +를,는 CD11b +, MHCII 미드, MerTK + 및 CD115 +와 같은 세포 집단. MHCII 및 FL-HA 사용되는 두 번째 종이는 폐포 대 식세포와 같은 인구를 식별하는 (중 CD11c +를, MHCII 중간 / 낮음, FL-HA 고) 미숙 구별했다 (중 CD11c +를, MHCII 중반, FL-HA 낮음) 성숙 DC가 (중 CD11c +를, MHCII 고), 모두 표현형 및 기능 18. 이 논문 모두는 대 식세포와 BMDC 문화에서 데이터를 해석 할 때주의해야 그 치료를 나타내는 DC 인구를 모두 포함, GM-CSF BMDC 문화가 이질적인 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 골수, GM-CSF에서 배양 골수 세포를 분리하고, 폐포 대 식세포 등을 식별하는 방법을 설명바인딩 및 MHCII 식 FL-HA를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 골수 문화의 미성숙과 성숙 수지상에서 인구. .이 절차는 루츠 등 (6)의 설정 순서에 기초하여, 5 생성 할 수있다 - 10 ㎖의 배양 7 일째에 10 × 106 비 - 부착 세포. 문화는 일에서 7 ~ 10에 사용할 수 하루 7이 성장하고 대량으로 체외 폐포와 같은 식세포를 분리하는 간단한 방법을 제공에서 대 식세포, 미성숙과 성숙 수지상뿐만 아니라 일부 전구 세포의 이종 인구를 산출한다.

<table><tbody><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD&nbsp;</td><td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>자동 도립 현미경&nbsp;</td><td>라이카&nbsp;</td><td>DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 1/2 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브&nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*Falcon 브랜드</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브 (1.5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>*다양한&nbsp;</td><td>*해부 가위, dumont 집게 및 표준 집게&nbsp;</td></tr><tr><td>혈구계&nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>멸균 100mm x 15mm 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Falcon 브랜드</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher 생물 시약</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산 칼륨 단일염기성</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>재조합 GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>수탉 빗 히알루론산 나트륨&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*플루오레세인 히알루로난</td></tr><tr><td>RPMI-1640을 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>피루브산 나트륨 없음, 글루타민 없음. 37&nbsp; &#176; C를 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔&nbsp;</td><td>5271-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>시그마</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>시그마</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>안티 FC 수용체(라벨이 지정되지 않음), 조직 배양 상등액</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 클론: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>클론: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>클론: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>클론: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinylated Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>염소 폴리클론 IgG</td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>시그마</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)</td><td>시그마</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 골수에서 생성 및 gm-csf의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

대 식세포와 수지상 세포 (DC가)는 병원균에 대한 방어에 중요한 역할을 담당 조직과 림프 기관에서 발견되는 선천성 면역 세포이다. 그러나 따라서, 시험 관내 모델이 개발되었으며, 자세하게 공부 충분한 수의 분리하기가 어렵다. 골수 유래 대 식세포 및 수상 세포의 체외 배양 면역 연구 노포 가치있는 방법이다. 여기서, 배양 및 사이토킨 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용하여 기본 마우스 골수 세포의 단일 배양액으로부터 수지상 세포 및 대식 세포를 모두 식별하기위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 제 루츠 동부 등에 의해 개발 된 기존의 방법에 기초한다. 골수 유래 수지상에 대한 1천9백99인치 문화는 이질적이며, MHCII 및 형광 표지 히알루 론산 (FL-HA)의 미성숙과 성숙 수지상 세포에서 대 식세포를 구분하는 데 사용됩니다. 이러한 GM-CSF는 유래 대 식세포 프로밀접하게 표현형과 기능 모두에서 폐포 대 식세포 유사 체외 파생 된 대 식세포의 편리한 소스를 제공해 줄.

이 방법의 주요 단계를 요약하는 흐름도가도 1에 도시되어있다. 배양 여러 번 골수 배양의 밀도 및 형태가도 2에 도시되어있다. 제 1 일에, 세포가 작은 저밀도이지만 날 (3)이다 거기에 더 많은 세포는 몇 가지 큰하고 몇 준수하기 시작했다. 6 일 일정한 부착 성 및 비 - 부착 부분 (도 2A)가 존재한다. 배양은 7 일부터 수확 될 수있는 - 일 10도 2b에 존재하는 CD11c + 세포를 높은 비율로 10 것은 수확 전 7 일째 배양뿐만 아니라 분리 된 점착성 및 비 점착성 세포 분획을 나타낸다. 자기편 부분은 비 접착 부분을 제거 빛 세척 후 남아있는 세포로 구성되어 있습니다. 비 - 부착 성 분획을 크게 확대 디지털 메신저에보다 명확하게 알 수있는 수지상 형태로 세포 충실도 2b의 세트에서...

과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 배양된 골수 세포는 대식세포와 수지상 세포(DC)를 포함하는 이종 배양을 생성합니다. 이 방법은 MHCII 및 히알루로난(HA) 결합을 사용하여 GM-CSF 배양의 DC와 대식세포를 구별하는 방법을 강조합니다. 이 문화권의 대식세포는 폐포 대식세포와 많은 유사점을 가지고 있습니다.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

이 절차의 전반적인 목적은 GM-CSF가 첨가된 인 비트로(in vitro) 마우스 골수 세포 배양에서 폐포 유사 대식세포(alveolar-like macrophages)를 생성하고 이를 수지상 세포(dendritic cells)와 구별하는 것입니다. 이 인 비트로 방법은 수지상 세포 또는 대식세포의 기능에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 충분한 수의 세포를 생성할 수 있으며, 수지상 세포와 폐포 유사 대식세포를 구별할 수 있다는 점입니다.이 기술은 폐 단백질증(pulmonary proteinosis) 치료에 응용될 수 있는데, 이는 해당 질병의 치료에 활용 가능한 폐포 유사 대식세포의 획득을 용이하게 하기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사용자는 세척된 뼈를 분리하고 골수를 세척하는 과정에 숙련될 때까지 연습이 필요합니다. 모든 기술이 서면 지침만으로 쉽게 이해되는 것은 아니므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 유용합니다.해부 시작 15분 전에 생물안전작업대(biological safety cabinet)를 켜서 내부 공기를 정화하고 기류를 안정시킨 후, 작업대 표면을 70% ethanol로 닦아냅니다. 작업대가 준비되면 마우스를 종이 타월 한두 장 위에 엎드린 자세로 놓은 다음, 동물에게 70% ethanol을 분무합니다. 그런 다음, 비우세손으로 흉부 주변의 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 절개합니다.절개 부위의 양 끝을 잡고, 두 끝이 위장 부위에서 만날 때까지 조심스럽게 당깁니다. 그런 다음 마우스를 배측으로 눕히고, 한 손으로 피부의 하단 절반을 다리가 노출될 때까지 아래로 당깁니다. 발을 잡고, 발목 관절 윗부분의 아킬레스건과 경골 하단에서 근육과 발을 연결하는 인대들을 절단하여 다리 뼈에서 발을 분리합니다.다리를 들어 올린 상태에서 대퇴골 하단의 무릎 관절 주변 근육과 인대를 제거하여 허벅지 근육을 하퇴부와 분리합니다. 포셉을 사용하여 느슨해진 근육을 비골 및 대퇴골 표면에서 조심스럽게 당겨 떼어냅니다. 그런 다음 고관절 부위에서 가위를 벌린 상태로 누르며 다리를 회전시키고, 대퇴골을 살며시 당겨 다리 뼈를 고관절에서 분리함과 동시에 몸체에서 다리를 절단하여 제거합니다.이제 멸균 포셉으로 고관절 쪽 다리를 잡고, 다른 포셉을 사용하여 발목 쪽에서 발을 제거합니다. 그런 다음 한쪽 포셉으로 대퇴골의 원위단을 잡고 다른 포셉으로 경골과 비골의 근위단을 잡은 후, 무릎 관절의 반대 방향으로 경골과 비골을 조심스럽게 구부려 하퇴부를 대퇴골 및 슬개골로부터 분리합니다. 포셉을 사용하여 하퇴골에서 남은 인대, 근육 및 비골을 제거하고, 세척된 경골을 1~2 mL의 HBSS/FCS가 담긴 뒤집힌 페트리 접시 뚜껑 위에 놓습니다.한 쌍의 포셉으로 대퇴골의 하단을 잡고 다른 포셉으로 슬개골을 잡은 뒤, 무릎과 주변 조직을 반대 방향으로 굽혀 관절을 제거합니다. 그런 다음 대퇴골에서 남아 있는 결합 조직을 제거하고 뼈를 뒤집어 놓은 페트리 접시 뚜껑 위에 놓습니다. 모든 뼈를 채취한 후, 포셉을 사용하여 뼈에 여전히 붙어 있는 잔여 조직을 깨끗이 제거하고 뼈를 페트리 접시 바닥에 담긴 10 milliliters의 HBSS/FCS에 침전시킵니다.멸균된 뚜껑으로 디쉬를 일부 가려 보호한 상태에서, 세척된 각 뼈를 가위로 절반으로 자릅니다. 그런 다음 26.5-gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여, 모든 적색 골수가 배출될 때까지 디쉬에 있는 1 mL의 HBSS/FCS를 각 뼈 조각의 끝부분으로 흘려보냅니다. 눈에 보이는 골수 덩어리는 주사기를 통해 여러 번 통과시켜 단일 세포 현탁액을 만들고, 10 mL 피펫으로 철저히 혼합합니다.세포를 수집 튜브로 옮기고, 잔류 세포를 모두 수집하기 위해 5 mL의 HBSS/FCS로 페트리 접시를 1회 헹굽니다. 그 후 세척액을 수집 튜브에 모으고 세포를 얼음 위에 둡니다. 골수 세포 배양을 준비하려면, 수집된 세포를 원심 분리하고 진공 흡입 장치가 연결된 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 상층액을 흡입하여 제거합니다.태핑을 통해 적혈구가 풍부한 펠릿을 풉니다. 그런 다음 10 milliliters의 RBC lysis buffer를 첨가하고 볼텍싱하여 세포를 재현탁합니다. 실온에서 5분간 배양한 후, 10 milliliters의 HBSS/FCS로 용해를 중단시키고 세포를 원심 분리하여 펠릿을 골수 세포 배지에 재현탁합니다.Trypan Blue 배제법으로 생존 세포 수를 측정하고, 필요한 세포를 골수 세포 배지가 담긴 새 튜브로 옮깁니다. 그다음 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 20 ng/mL의 GM-CSF가 포함된 골수 세포 배지를 사용하여 펠릿을 4,000,000 cells/mL 농도로 재현탁합니다. 이어서 배양당 하나의 멸균 박테리아 페트리 접시에 20 ng/mL의 GM-CSF가 첨가된 골수 세포 배지 9.5 mL를 넣고, 각 접시의 중앙에 세포 500 µL를 추가합니다.세포를 37°C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 3일째 되는 날, 세포에 가해지는 자극을 최소화하며 20 ng/mL의 GM-CSF가 보충된 신선한 골수 배지 10 mL를 각 배양액에 첨가합니다. 6일째 되는 날, 세포 배양 상층액 10 mL를 멸균된 50 mL 원심 분리관(conical tube)으로 조심스럽게 옮깁니다.세포를 원심 분리하고 20 ng/mL의 GM-CSF가 포함된 10 mL의 신선한 골수 세포 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 가볍게 볼텍싱하여 세포를 배양 접시에 다시 넣습니다. 1일 차에 골수 세포는 크기가 작고 수가 적지만, 3일 차가 되면 세포의 수와 크기가 증가하고 일부는 부착되기 시작합니다.6일째가 되면 세포 수가 증가하며, 부착 및 비부착 분획이 모두 관찰됩니다. 배양물은 7일에서 10일 사이에 수확할 수 있으며, 크기와 생존 세포를 기준으로 게이팅합니다. 10일째 배양물에서 CD11c 양성 세포의 비율이 더 높게 나타납니다. 7일째에 수집한 비부착 분획에는 수지상 돌기 형태를 가진 세포가 크게 농축되어 있습니다.7일차와 10일차에 수집된 CD11c-양성, GR1-음성 세포군은 MHCII 발현 및 FL-HA 결합 정도에 따라 대식세포, 미성숙 수지상세포, 성숙 수지상세포의 세 가지 주요 세포군으로 나눌 수 있습니다. 흥미롭게도, MerTK는 대식세포 마커로 간주되지만, 7일차와 10일차에 수집된 대식세포와 미성숙 수지상세포군 모두에서 강한 발현을 보였으며, 성숙 수지상세포에서는 낮은 수준의 발현이 관찰되었습니다.이 절차를 수행하는 동안, 골수 채취 및 세포 배양 전 과정에서 멸균 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 세포 집단을 개별적으로 조사하기 위해 세포 분리(sorting)를 수행하거나, 염증성 인자로 자극을 준 뒤 세포 내 염색 및 유세포 분석법을 통해 사이토카인 생성을 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 골수 세포를 분리하고 GM-CSF에서 배양하여 수지상 세포와 폐포 유사 대식세포를 모두 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

이 비디오는 성체 쥐의 골수에서 수지상 세포(T 세포를 활성화하는 핵심 항원 제시 세포)를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

골수 유래 수지상 세포 생성: 마우스 골수에서 수지상 세포를 생성하는 방법

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

배우세요 마우스 골수 세포 배양에서 GM-CSF를 이용해 폐포와 같은 대식세포와 수지상 세포를 생성 및 식별하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구와 폐 질환 치료에 활용됩니다.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

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