마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

이 절차의 전반적인 목적은 GM-CSF가 첨가된 인 비트로(in vitro) 마우스 골수 세포 배양에서 폐포 유사 대식세포(alveolar-like macrophages)를 생성하고 이를 수지상 세포(dendritic cells)와 구별하는 것입니다. 이 인 비트로 방법은 수지상 세포 또는 대식세포의 기능에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 충분한 수의 세포를 생성할 수 있으며, 수지상 세포와 폐포 유사 대식세포를 구별할 수 있다는 점입니다.

이 기술은 폐 단백질증(pulmonary proteinosis) 치료에 응용될 수 있는데, 이는 해당 질병의 치료에 활용 가능한 폐포 유사 대식세포의 획득을 용이하게 하기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사용자는 세척된 뼈를 분리하고 골수를 세척하는 과정에 숙련될 때까지 연습이 필요합니다. 모든 기술이 서면 지침만으로 쉽게 이해되는 것은 아니므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 유용합니다.

해부 시작 15분 전에 생물안전작업대(biological safety cabinet)를 켜서 내부 공기를 정화하고 기류를 안정시킨 후, 작업대 표면을 70% ethanol로 닦아냅니다. 작업대가 준비되면 마우스를 종이 타월 한두 장 위에 엎드린 자세로 놓은 다음, 동물에게 70% ethanol을 분무합니다. 그런 다음, 비우세손으로 흉부 주변의 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 절개합니다.

절개 부위의 양 끝을 잡고, 두 끝이 위장 부위에서 만날 때까지 조심스럽게 당깁니다. 그런 다음 마우스를 배측으로 눕히고, 한 손으로 피부의 하단 절반을 다리가 노출될 때까지 아래로 당깁니다. 발을 잡고, 발목 관절 윗부분의 아킬레스건과 경골 하단에서 근육과 발을 연결하는 인대들을 절단하여 다리 뼈에서 발을 분리합니다.

다리를 들어 올린 상태에서 대퇴골 하단의 무릎 관절 주변 근육과 인대를 제거하여 허벅지 근육을 하퇴부와 분리합니다. 포셉을 사용하여 느슨해진 근육을 비골 및 대퇴골 표면에서 조심스럽게 당겨 떼어냅니다. 그런 다음 고관절 부위에서 가위를 벌린 상태로 누르며 다리를 회전시키고, 대퇴골을 살며시 당겨 다리 뼈를 고관절에서 분리함과 동시에 몸체에서 다리를 절단하여 제거합니다.

이제 멸균 포셉으로 고관절 쪽 다리를 잡고, 다른 포셉을 사용하여 발목 쪽에서 발을 제거합니다. 그런 다음 한쪽 포셉으로 대퇴골의 원위단을 잡고 다른 포셉으로 경골과 비골의 근위단을 잡은 후, 무릎 관절의 반대 방향으로 경골과 비골을 조심스럽게 구부려 하퇴부를 대퇴골 및 슬개골로부터 분리합니다. 포셉을 사용하여 하퇴골에서 남은 인대, 근육 및 비골을 제거하고, 세척된 경골을 1~2 mL의 HBSS/FCS가 담긴 뒤집힌 페트리 접시 뚜껑 위에 놓습니다.

한 쌍의 포셉으로 대퇴골의 하단을 잡고 다른 포셉으로 슬개골을 잡은 뒤, 무릎과 주변 조직을 반대 방향으로 굽혀 관절을 제거합니다. 그런 다음 대퇴골에서 남아 있는 결합 조직을 제거하고 뼈를 뒤집어 놓은 페트리 접시 뚜껑 위에 놓습니다. 모든 뼈를 채취한 후, 포셉을 사용하여 뼈에 여전히 붙어 있는 잔여 조직을 깨끗이 제거하고 뼈를 페트리 접시 바닥에 담긴 10 milliliters의 HBSS/FCS에 침전시킵니다.

멸균된 뚜껑으로 디쉬를 일부 가려 보호한 상태에서, 세척된 각 뼈를 가위로 절반으로 자릅니다. 그런 다음 26.5-gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여, 모든 적색 골수가 배출될 때까지 디쉬에 있는 1 mL의 HBSS/FCS를 각 뼈 조각의 끝부분으로 흘려보냅니다. 눈에 보이는 골수 덩어리는 주사기를 통해 여러 번 통과시켜 단일 세포 현탁액을 만들고, 10 mL 피펫으로 철저히 혼합합니다.

세포를 수집 튜브로 옮기고, 잔류 세포를 모두 수집하기 위해 5 mL의 HBSS/FCS로 페트리 접시를 1회 헹굽니다. 그 후 세척액을 수집 튜브에 모으고 세포를 얼음 위에 둡니다. 골수 세포 배양을 준비하려면, 수집된 세포를 원심 분리하고 진공 흡입 장치가 연결된 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 상층액을 흡입하여 제거합니다.

태핑을 통해 적혈구가 풍부한 펠릿을 풉니다. 그런 다음 10 milliliters의 RBC lysis buffer를 첨가하고 볼텍싱하여 세포를 재현탁합니다. 실온에서 5분간 배양한 후, 10 milliliters의 HBSS/FCS로 용해를 중단시키고 세포를 원심 분리하여 펠릿을 골수 세포 배지에 재현탁합니다.

Trypan Blue 배제법으로 생존 세포 수를 측정하고, 필요한 세포를 골수 세포 배지가 담긴 새 튜브로 옮깁니다. 그다음 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 20 ng/mL의 GM-CSF가 포함된 골수 세포 배지를 사용하여 펠릿을 4,000,000 cells/mL 농도로 재현탁합니다. 이어서 배양당 하나의 멸균 박테리아 페트리 접시에 20 ng/mL의 GM-CSF가 첨가된 골수 세포 배지 9.5 mL를 넣고, 각 접시의 중앙에 세포 500 µL를 추가합니다.

세포를 37°C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 3일째 되는 날, 세포에 가해지는 자극을 최소화하며 20 ng/mL의 GM-CSF가 보충된 신선한 골수 배지 10 mL를 각 배양액에 첨가합니다. 6일째 되는 날, 세포 배양 상층액 10 mL를 멸균된 50 mL 원심 분리관(conical tube)으로 조심스럽게 옮깁니다.

세포를 원심 분리하고 20 ng/mL의 GM-CSF가 포함된 10 mL의 신선한 골수 세포 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 가볍게 볼텍싱하여 세포를 배양 접시에 다시 넣습니다. 1일 차에 골수 세포는 크기가 작고 수가 적지만, 3일 차가 되면 세포의 수와 크기가 증가하고 일부는 부착되기 시작합니다.

6일째가 되면 세포 수가 증가하며, 부착 및 비부착 분획이 모두 관찰됩니다. 배양물은 7일에서 10일 사이에 수확할 수 있으며, 크기와 생존 세포를 기준으로 게이팅합니다. 10일째 배양물에서 CD11c 양성 세포의 비율이 더 높게 나타납니다. 7일째에 수집한 비부착 분획에는 수지상 돌기 형태를 가진 세포가 크게 농축되어 있습니다.

7일차와 10일차에 수집된 CD11c-양성, GR1-음성 세포군은 MHCII 발현 및 FL-HA 결합 정도에 따라 대식세포, 미성숙 수지상세포, 성숙 수지상세포의 세 가지 주요 세포군으로 나눌 수 있습니다. 흥미롭게도, MerTK는 대식세포 마커로 간주되지만, 7일차와 10일차에 수집된 대식세포와 미성숙 수지상세포군 모두에서 강한 발현을 보였으며, 성숙 수지상세포에서는 낮은 수준의 발현이 관찰되었습니다.

이 절차를 수행하는 동안, 골수 채취 및 세포 배양 전 과정에서 멸균 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 세포 집단을 개별적으로 조사하기 위해 세포 분리(sorting)를 수행하거나, 염증성 인자로 자극을 준 뒤 세포 내 염색 및 유세포 분석법을 통해 사이토카인 생성을 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 골수 세포를 분리하고 GM-CSF에서 배양하여 수지상 세포와 폐포 유사 대식세포를 모두 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.