Name: 골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 배우세요 레트로바이러스를 이용해 골수 전구 세포에 T 세포 수용체를 형질 도입하고, 약 7주 만에 T 세포 구획을 재구성하는 방법입니다. 이 기법은 면역학 연구에서 다양한 TCR의 생체 내 기능을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 MLB, BCM에서 당뇨병 연구 센터 (P30-DK079638)의 파일럿 / 타당성 프로그램, JDRF 1-FAC-2014-243-APF, ADA에 NIH (5K22A1119151-01 및 1R56DK104903-01)에서 보조금에 의해 지원되었다 1-15-JF-07, 면역학 MB에 친목, 그리고 로버트와 제니스 맥 네어 재단 AAI 채용.

윤리 정책 : 모든 노력이 조사와 꼬리 정맥 주사시 최소한으로 동물의 불편이나 스트레스를 유지한다. 마우스는 실험에서 세포의 공급원으로서 사용된다; 같은 어떠한 절차 나 조작은 안락사 따로 없습니다. 마우스는 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입에 의해 안락사됩니다. 이 절차는 미국 수의학 협회의 안락사에 대한 패널의 권고와 일치한다. 1. 레트로 바이러스가 구축 준비 <ol><li> 서브 클론 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬하는 MSCV 계 11 레트로 바이러스 벡터 (예 pMIAII 또는 pMIGII) (11)로하는 2A 링커에 의해 분리된다. 참고 : 2A 링커는 단일 오픈 리딩 프레임의 알파와 베타 TCR 체인의 화학 양론과 조화 된 표현이 가능합니다. 벡터는 사용하는 IRES 형광 단백질 카세트 (ametrine 또는 GFP)을 포함형질 도입 된 세포 및 형질 도입 효율을 추적. 자세한 프로토콜에 대한 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11) </li><li> 상업적으로 얻은 플라즈마 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 하나의 작업 농도 사용 - 2 μg의 μl를 -1. </li></ol> 레트로 바이러스 생산자 세포주의 2 세대 <ol><li> 레트로 바이러스 생산 세포주를 생성하기 위하여 두 단계의 과정을 이용한다. 참고 :. 자세한 프로토콜은, 홀스트 등 (11)을 참조하시기 바랍니다. <ol><li> 세 플라스미드 (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) 및이자 (11)의 벡터) 293T 세포의 과도 형질 전환에 의해 레트로 바이러스를 생성하고, GP + E86 ecotropic 레트로 바이러스 생산 세포주를 형질 도입 할 293T 세포에서 레트로 바이러스 상등액을. </li><li> FACS에 의해 형광 발현 GP + E86 프로듀서 세포의 상위 40 %를 분리하고 바이러스의 소스로 transdcuced-GP + E86 생산 세포를 전파. 참고 : 생성고역가의 생산자들은 골수 세포의 효율적인 형질 도입 중요하다. 완전한 프로토콜 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11) </li></ol></li></ol> 3. 레트로 바이러스 매개 줄기 세포 유전자 전송 (일 -5) <ol><li> 10 % (부피 / 권) FBS이 프로토콜의 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트 충분한 성장을 할 수 있도록 밖으로 해동하고 완전한 DMEM의 각 GP + E86 생산 세포주의 배양 0.5 -1.0 × 10 (6). 참고 : 해동 0.5 - 또한 GP + E86를 확장하기 위해 문화의 오일을 허용이 날 5에서 50 % 컨 플루 - 10cm의 플레이트의 각 GP + E86 생산 세포주의 1.0 × 10 6 30 수 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트에 생산​​ 세포주. <ol><li> 5 % 태아 송아지 혈청 및 마이코 플라스마 오염을 방지 할 시프로플록사신 (10 μg의 / ㎖)을 포함하는 전체 조직 배양 배지에서 배양 레트로 바이러스 생산 세포주. 참고 : generatin 때 시프로플록사신의 사용을 중지g 골수 전달의 바이러스 상층 액. 이 부정적인 골수 전달 효율에 영향 바와 같이, 생산자 세포주의 과다 성장을 피한다. </li></ol></li></ol> 5- 플루오로 우라실 (5-FU) (주 -3) 4.를 주입 기증자 마우스 <ol><li> 요구되는 5-FU의 양을 결정하기 위해 - (12 주 이전 5) 도너 마우스 무게. 낮은 골수 수율 나이 결과 오주 미만의 마우스를 사용. 단일 TCR의 발현을 보장하기 위해, 같은 SCID, RAG 또는 TCR 알파 골수 기증자로 결핍 마우스로 T 세포 결핍 마우스의 피로를 사용합니다. </li><li> 조직 배양 후드에서 작동하는 10 밀리그램 ml의 충분한 양 -1 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 전달하는 5-FU의 작업 용액을 만들기 위해 멸균 PBS로 5-FU 스톡을 희석. </li><li> 37 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여, 복강 공여자 마우스 당 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 주입. 참고 :받는 사람 당 사용 1 기증자 마우스 시작하고 조정셀 수율에 따라 기증자 마우스의 수. 골수 전구 세포의 농축 및 분리에 대한 5-FU 처리하는 다른 방법은 Viret 등의 알에 기재된 리니지 양성 세포의 네거티브 선택이다. </li></ol> 5. 골수 추출 절차 (일 0) <ol><li> 뼈 격리를 위해 해부 가위와 집게를 가져옵니다. 50 ML 원뿔 튜브에 뼈를 수집 미디어 (HBSS 5 % FCS (부피 /의 부피와 보충)) 준비합니다. 얼음에 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔을 유지합니다. CO에 의해 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입 쥐를 안락사. 더 반사가 감지되지 보장하기 위해 발을 꼬집어. </li><li> 수술 부위와 에탄올 또는 메탄올과 수술 도구를 소독. 먼저 절단 및 골반 거들에 따라 신중하게 대퇴골, 경골, 상완골, 골반 거들을 제거합니다. 다시 아래 경골의 대퇴골을 따라 잘라. 깨끗한 뼈를 얻기 위해 가위와 집게를 사용하여 모든 주변 조직을 제거합니다. 유지HBSS + 5 % (부피 / 부피의) FBS 수화 뼈. </li><li> 모두 각각의 뼈를 종료 잘라 확인하고, 관절에서 절단하여 뼈를 분리합니다. HBSS + 5 % (부피 / 부피)를 포함하는 10 ML의 주사기 FBS에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 압력을 적용하고 50 ML 원뿔에서 70 μm의 여과기 휴식을 통해 모든 골수를 세척합니다. </li><li> 주기적으로, 1 mL의 3 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 70 ㎛의 필터를 통해 골수를 누른다. HBSS + 5 % (부피 / 권) FBS와 스트레이너를 씻어. 이것은 뼈 조각 및 조직이 없도록 단일 세포 현탁액을 보장한다. 멸균 후드의 절차를 수행하여 무균 세포를 유지합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 골수 세포. </li></ol> 6. 골수 문화 (0 일) <ol><li> 캔트 또는 흡인 미디어 50 ML 원뿔 튜브 당 1 ml의 염화 암모늄을 기반으로 적혈구 용해 버퍼 (또는 RBC 용해 버퍼 상당)에 재현 탁 세포 펠렛. 룸에서 1 분 배양 후온도는 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) 10 ml의 FBS를 첨가하여 적혈구 용해 완충액을 해소. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 가만히 따르다 5 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS의 대기음 뜨는 및 재현 탁 골수. 노이 바 우어 계산 챔버와 세포를 계산합니다. 참고 : 일반 수율이 있어야합니다 약 5 - 마우스 당 × 10 6 셀 (10); 그러나, 수율은 쥐의 다른 변종에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> IL-3이 보충 된 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 30 mL를 150-mm 플레이트 당 4 × 107 세포의 밀도로 접시의 골수 세포 (20g 용액 1), IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF (50g ml의 1). 참고 : 갓 해동-분주 사이토 카인을 사용합니다. 2 주 이상 4 ° C에서 냉동 번 이상 해동 또는 보관 된 사이토 카인을 사용하지 마십시오. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 골수 (약 24 시간)을 인큐베이션. </li></ol><ol><li> 플레이트 18 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 권) FBS에서 150 mm 플레이트 당 3 × 10 6 레트로 바이러스 생산 세포. </li><li> 하룻밤 37 ° C에서 레트로 바이러스 생산 세포를 품어. (- 3 기증자 마우스 약 2) 15000000 골수 세포에 대해 하나의 150-mm 판을 기대하고 있습니다. </li></ol> 8. 레트로 바이러스 상층 액 (1 일) <ol><li> 다음날 (약 24 시간 이상), 10 ml의 주사기와 필터는 0.45를 이용하여 150 mm 플레이트에서 직접 레트로 바이러스 상등액을 그림으로써 (7 단계에서 설정) 생산자 판에서 레트로 바이러스 뜨는을 수확 -μm 주사기 필터. </li><li> 조심스럽게 신선한 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 18 ㎖로 제거 된 레트로 바이러스 뜨는을 교체합니다. </li><li> (g ml의 -1 20) IL-6 (50g ml의 1), MSCF (50g ml의 1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (폴리 브렌) (6을 IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액을 보충# 956; g ml의 1). 주 : Hexadimethrine 브로마이드 레트로 바이러스 형질 도입의 효율의 저하를 방지하기 위해 2 개월마다 신선한하여야한다. </li></ol> 9. 골수 수확 (1 일) <ol><li> 단계 8.3를 완료 한 후, 단계 6.4로부터의 골수 세포를 수확하고 멸균 된 50 ㎖의 튜브에 비 부착 세포를 포함하는 미디어 전송. </li><li> 10 ml의 PBS에 적극적으로 접시를 씻으 단계 9.1에서 50 ML 원뿔에서 수집합니다. 필요한 경우, 세척 공정을 반복한다. </li><li> 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포가 뜨는을 가만히 따르다, 작은 볼륨에 resuspend 세포 (1-3 ml)을 완료 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS, 그리고 계산합니다. 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드를 함유하는 레트로 바이러스 상층 액 1 ㎖ 당 1 × 106 세포로 재현 탁 0 일 골수 75 % 복구 - 50 예상된다. </li></ol> 10. 골수 형질 도입 (1 일) <ol><li> 레트로 바이러스 상등액 / 뼈 엄마 플레이트여섯 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 3 ㎖의 부피에서 rrow 혼합물. 단계 10.2에서 원심 분리 동안 가스 교환을 최소화하기 위해 플라스틱 포장의 판을 바꿈. </li><li> 60 분 37 ° C 1,000 XG에서 랩 여섯 웰 플레이트 스핀. </li><li> 스핀가 완료되면 플라스틱 포장을 제거하고 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> (11) 레트로 바이러스 뜨는 및 형질 도입 (2 일) <ol><li> 24 시간 후, 바이러스 생산 세포주에서 신선한 바이러스 상층 액을 수집합니다. 10 mL의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터를 사용하여 레트로 바이러스 상등액을 필터. IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액 (용액 20g-1), IL-6 (50g 용액 -1) 및 SCF 보충 (50g 용액 -1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (6g 용액 1). </li><li> 다음, 조심스럽게 피펫으로 제거하거나 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 흡인. 주 : 작업은 신중 보통 웰의 중앙에 집중되어 골수를 대기음 없다. 이와 달리, 제거 된 상등액을 어떤 손실 골수 세포를 회수하기 위해 스핀 다운된다. </li><li> 잘 골수 6 웰 플레이트의 각에 신선한 바이러스 상층 액을 포함하는 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드 3 ㎖를 추가합니다. 플라스틱 접시를 감싸, 60 분, 37 ° C를 1,000 XG에서 스핀 전달을 반복합니다. 접시를 풀다, 37 ° C, 5 % CO 2 밤새 (약 24 시간)에서 세포를 배양한다. </li></ol> 신선한 보충 DMEM의 12 추가 (3 일) <ol><li> 24 시간 후, 단계 11.2에서와 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 제거한다. (g ml의 -1 50) IL-3의 최종 농도로 보충 신선한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS와 (20g ml의 -1) 제거 된 미디어를 교체, IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF . </li><li> 골수를 품어또 다른 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시. </li></ol> 13. 수확 형질 골수 (4 일) <ol><li> 24 시간 후에, 6- 웰 플레이트에서 골수 세포를 수집한다. 모든 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS에 격렬 판을 씻는다. <ol><li> 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> PBS + 0.5 % (부피 / 부피)의 소량 (1 mL) 중 골수 열 - 불 활성화 FBS를 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> 각 골수 조건의 10 μL 샘플을 채취하고 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 1 가정 -받는 사람 당 2 기증자, 수율은받는 사람 마우스 당 최소 4 × 10 6 세포를 전송하기에 충분합니다. 마우스 당 300 μL - 200에 주입하는 PBS + 0.5 % (vol / vol) 열 활성화 된 FBS 충분한 양의 골수 재현 탁. <ol><li> 전달 효율을 갖는 적어도 2 × 106 세포를 주입25 %의 정맥 마우스 당 (8 X10 6 셀을 삽입 할 수 있습니다). 참고 : 우리는 일상적으로 골수 세포의 두 6 웰 플레이트에 5받는 사람 쥐를 주입. 수율이 실질적으로 낮은 경우 충분한 골수 수가 얻어 질 때까지 더 공여 마우스는 사용되어야한다. 최적의 재구성을 달성하기 위해, 적어도 5 × 5는 형질 도입 (양의 형광체)를 각 수신자에 주입한다. </li></ol></li><li> 마이크로 피펫으로, 각각의 골수 조건의 10 μl의 샘플을 채취하여 형광 마커 (그림 1A) (11)의 발현에 따라 유동 세포 계측법에 의해 전달 효율을 분석 할 수 있습니다. 주 : 일반적으로, 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 필요한 형질 도입 골수 세포의 수는 서브 - 치명적 조사하는 마우스 전달 효율에 따라 달라질 수 재구성. 트란 낮은sduction 효율이보다 골수 세포를 요구하고, 반대로 골수 전달 효율이 높아 세포의 낮은 숫자는 재구성에 필요한. 25 % 아래의 전달 효율이 최적이며, 부족 재구성과 생존의 원인이 될 수 있습니다. 최적 골수 회복 전달 효율을 확보하기 위해, 새로 제조 된 조직 배양 배지 및 사이토 카인을 사용한다. retrogenic 체계를 이용하여 새로운 TCR을 발현 할 때, 생체 내에서 그 TCR의 선택은 알려져 있지 않다. 개별 TCR의 친화도에 따라 흉선 및 말초 T 세포 발현 TCR 선택 17 달라진다. </li></ol> 14. 마우스 조사, 골수 주입 및 관리 <ol><li> 쥐에게 골수 주입 전날 (13 단계로 당일)을 조사. 다음 용량 사용 C57BL / 6 마우스 (및 기타 야생형 균주), 900 래드, Rag1을 - / - 마우스, 500 래드; SCID 마우스, 300 래드). <ol><li> 아목시실린에 배치받는 사람 마우스 (50 ㎎ / ㎏ / 일) 또는 조사 전에 다른 항생제 물 처리, 골수 주입 후 첫 2 주 동안 항생제를 계속. 주 : 최적의 조사량은 경험적으로 결정될 수있다. </li></ol></li><li> 주사를 들어, 바로 주입하기 전에, 다음, 주사 27 게이지에 바늘을 변경 공기 색전증을 방지하기 위해 모든 공기를 추방 무딘 바늘을 사용하여 1 ML의 주사기에 단계 13.1에서 세포를로드합니다. 가열 램프 아래에서 열 및 마우스 당 정맥 마우스 골수 0.2 ml를 주입. 참고 : 세포가 시간의 길이 또는 정착 할 셀의 주사기에 앉아 않도록하십시오. </li><li> 그들이 건강을 유지하도록 주간 생쥐를 모니터링합니다. </li><li> 오 후 - 육주, GFP + / ametrine + 및 TCR 공동 식 (그림 1B) (11)에 기초하여 재구성을 확인하기 위해 쥐를 피. </li></ol>

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<li>Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+models+to+study+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse models to study human diseases.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).</li>
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<li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜에서, 최적의 골수 건강, 전달 효율 및 재구성을 보장하기 위해 여러 세부 중요한 단계를 우리. 첫 번째 중요한 단계는 생성 및 GP + E86 바이러스 생산자 세포의 적절한 유지된다. 초기 통로 생산 세포주를 사용하여 80 % 컨 플루 이하 사용하기 전에에서 유지한다. 48 시간 - 신선한 GP + E86 바이러스 생산 세포를 만드는 경우, 293T 세포가 초기 통로 (24)에 대한 문화에서 성장되어 있는지 확인합니다. 형질 도입 단계에서 너무 많은 GP + E86 셀을 도금하는 바이러스 역가를 낮출 것이다. GP + E86 강력한 바이러스 생산자 보장하기 위해 홀스트 등. (11)에 기술 된 바와 같이 바이러스 역가를 결정합니다. 또한, 수확 된 골수에서 적혈구의 제거는 형질 도입 효율을 향상시킨다. 골수 전구 세포의 상태를 보장하는 프로토콜의 성공에 매우 중요하다. 이를 위해, 항상 신선한 미디어 (후 FCS로 보충 4 ° C에서 4 주 이하) 및 신선한 사이토 카인 (이하 사용...

인간 및 마우스의 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리는 1 × 108, 2 × 106 고유 TCR도 각각 1.2로 추정되었다. 이 넓은 다양성은 T 세포는자가 펩티드에서뿐만 아니라 항원 제시 세포 (APC를)의 주 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 제공 병원체 유래의 항원 에피토프의 광대 한 배열을 인식 할 수있다. 독특한 펩타이드 MHC 단지와 TCR도의 상호 작용의 미묘한 차이는 T 세포가 사멸, 아네 르기, 활성화, 분화, 사이토 카인 생산 세포 독성을 받아야할지 여부를 지시. 그러나, 큰 TCR 레퍼토리 특정 TCR 특정 항원에 응답하는 방법의 분석은 하나의 TCR 시스템의 사용을 필요로한다. 다양한 TCR 유전자 변형 마우스를 생체 내 모델 3-9 단일 TCR의 기능을 연구하기 위해 생성되었다. 그러나, 포함하는 형질 전환 마우스를 TCR 할주의 사항이있다선정 된 하나의 트랜스 제닉 마우스 생식선 DNA (10)에 임의의 형질 전환 유전자 삽입 소위 창시자 효과를 생성하는 시간의 길이. 따라서, 비교적 적은 TCR 형질 전환 마우스는 임의의 주어진 항원에 대해 생성 된 동일한 에피토프에 대한 고 및 저 TCR 친화력의 기능적 의미는 거의 언급하지 않는다. 화면 빠른 접근을위한 필요성을 해결 개별적으로 또는 조합하여 복수의 TCR도 공부 (레트로 바이러스 &#39;레트로&#39;형질 전환에서 &#39;제닉&#39;) retrogenic 마우스는 형질 전환 마우스 11-13 TCR의 대안으로 이용되어왔다. 여러 바이러스에서 발견 된 2A 펩타이드 합의 모티브 분열은 2A의 글리신과 2B의 프롤린 사이에 발생하는에서, 2A-ASP를-발 / 일드 - 공급 과잉-X-ASN-프로의 Gly-2B-프로 구성 시스 -acting 가수 분해 효소 활동에서 번역 10,14-16 동안 리보솜 건너 뛰기 결과. 은 C를 나타내는 상세한 다이어그램이러한 방식으로, 하나의 벡터 화학 양론 번역의 결과로 연결될 수 2 시스 트론 (TCR 알파와 TCR 베타) (12) -를 다양한 2A 펩티드 (F2A, E2A, T2A 및 P2A)의 leavage 참고 문헌 10를 참조하십시오. 이 방법을 활용하여, 우리는 표현하고 직접 생체 내에서 여러 항원 특정 TCR도 비교 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM, 고포도당 + 글루타민</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dulbecco의 4.5 g/L 포도당, L-글루타민 및 피루브산 나트륨을 함유한 독수리 매체의 변형</td></tr><tr><td>FBS</td><td>애틀랜타 생물학</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & #181; m 주사기 필터</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>멸균 dH2O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-플루오로우라실(5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 용액</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 조직 배양 접시</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Tisue 배양 처리된 6-well 평판</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &#181; m 나일론 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHC0063</tr><tr><td>마우스 줄기 세포 인자</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS 버퍼</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml 주사기</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD 정밀 글라이드 니들</td><td>BD</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>30 g x 1/2 BD 정밀 글라이드 바늘</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 t 세포 수용체 retrogenic 마우스를 생성하는

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T 세포 수용체(TCR) 신호전달은 흉선과 말초에서 각각 T 세포의 발달과 분화에 필수적입니다. 광범위한 TCR은 특정 항원 반응을 연구하는 것이 어렵다는 것을 증명합니다. 따라서, TCR 형질전환 마우스는 흉선에서의 양성 및 음성 선택뿐만 아니라 말초 T 세포 활성화, 증식 및 내성을 연구하기 위해 만들어졌습니다. 그러나 주어진 항원에 특이적으로 생성된 TCR 형질전환 마우스는 상대적으로 적습니다. 따라서 동일한 항원 펩타이드에 대한 다양한 친화성의 TCR을 포함하는 연구는 부족했습니다. 새로운 TCR 형질전환 라인의 개발에는 6개월 이상이 소요될 수 있습니다. 또한 특정 역교차는 6개월이 더 걸릴 수 있습니다. 여러 TCR의 더 빠른 생성 및 스크리닝을 가능하게 하기 위해 TCRα 및 TCRβ 사슬의 화학량론적 발현과 후향성 마우스의 생성을 통해 골수의 레트로바이러스 형질전환을 위한 프로토콜이 확립되었습니다. 각 retrogenic 마우스는 본질적으로 founder이므로 사실상 founder effect를 무효화하는 반면, TCR retrogenic을 생성하는 데 걸리는 시간은 6개월에서 약 6주로 단축됩니다. 여기에서는 특정 TCR을 사용하여 선택한 모든 배경에서 발현될 수 있는 TCR 형질전환 마우스에 대한 빠르고 유연한 대안을 제시합니다.

골수 대표 골수 전달도 (도 1a)에있어서 꼬리 정맥에서 정맥 내로 주입되기 전에 골수 전달 효율은 수확 된 골수의 약 10 μL 중 100 ㎕를 첨가하고, 프로토콜의 단계 133에서 판정한다 PBS 및 ametrine 발현을 분석 하였다. 일반적으로 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 6주 골수 주사 후, 마우스 골수 재구성 (도 1b)를 결정하기 위해 혈액을 채취한다. 약 말초 혈액의 25 μL은 적혈구가 용해 및 안티 TCRβ로 염색했다. 도 2b에 모든 TCR 양성 세포 concordantly ametrine 형광 단백질을 발현. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/5419...

우리는 단일 T 세포 수용체(TCR) 레트로바이러스 기반 생체 내 발현 시스템을 위한 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다. 레트로바이러스 벡터는 골수 전구 세포를 transduction하여 TCR 형질전환 마우스의 대안으로 in vivo에서 단일 TCR의 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

본 절차의 목적은 여러 T-세포 수용체의 생체 내 기능을 결정하기 위해 레트로제닉(retrogenic) 마우스를 생성하는 것입니다. 이는 2A 펩타이드 컨센서스 모티프로 연결된 T-세포 수용체의 알파 및 베타 체인을 인코딩하는 레트로바이러스 컨스트럭트를 사용하여 달성됩니다. 이 방법은 여러 항원에 특이적인 다수의 TCR을 스크리닝함으로써 그들의 생체 내 기능을 결정할 수 있어, 면역학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 실제로 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 레트로바이러스 컨스트럭트(construct)가 완성되면, 약 7주 후에 레트로제닉(retrogenic) 마우스의 T세포 구획이 재구성된다는 점입니다. 또한, 각 레트로제닉 마우스는 기본적으로 파운더(founder)이므로, 여러 마리의 마우스를 분석함으로써 파운더 효과를 제거할 수 있습니다. 이 절차의 해당 부분을 시연할 분은 Maria Bettini 박사입니다.멸균된 해부용 가위와 핀셋을 수술 구역에 배치하고, 50 milliliter 원심분리관에 담긴 해부 배지를 얼음 위에 올려 냉각시켜 골수 추출 준비를 합니다. 마우스를 안락사시키고 경추 탈구를 통해 사망을 확인한 후, 해부용 가위로 골반대를 위아래로 절개하여 제거합니다. 그런 다음 대퇴골에서 경골 방향으로 다시 절개하여 대퇴골, 경골 및 상완골을 조심스럽게 적출합니다.조직 배양 후드 내의 해부 배지 접시에 뼈를 옮긴 후, 가위와 핀셋을 사용하여 주변 조직을 모두 제거해 깨끗한 뼈를 얻습니다. 관절 부위를 절단하여 뼈를 분리하며, 각 뼈의 양 끝단을 모두 절단해야 합니다. 그런 다음 해부 배지가 담긴 10 milliliter 주사기에 연결된 25 gauge 바늘을 뼈에 삽입합니다.압력을 가하여 모든 골수를 50 milliliter 원추형 튜브에 거치된 70 micron 스트레이너로 여과합니다. 주기적으로 1 milliliter 시린지의 플런저를 사용하여 골수를 70 micron 필터로 밀어내고, 스트레이너를 배지로 헹굽니다. 골수 단일 세포 현탁액을 4 degrees celsius에서 300 times g로 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 배지를 따라내거나 흡입하여 제거하고 각 세포 펠렛을 1 mL의 염화암모늄 기반 적혈구 용해 버퍼에 재현탁합니다. 실온에서 1분 동안 배양합니다. 다음으로, 10 mL의 플레이팅 배지를 첨가하여 적혈구 용해 버퍼를 중화시킨 후 이전과 동일하게 원

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 - 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.

293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

우리는 체세포 핵 전송 (SCNT)를 통해 epigenetic 프로그래밍이 사전 정의된 T 세포 수용체 (TCR) specificities와 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용할 수 여기를 보여줍니다. 이러한 transnuclear 생쥐는 내생 모터의 제어하에 자신의 내생 로커스에서 해당 TCR을 표현.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

에서 유전자의 구조와 기능 분석의 효율적인...

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

인간화 마우스를 사용하여 종양 특정 T 세포의 생성 및 특성이 여기에 설명되어 있습니다. 인간 thymic 조직 및 유전자 변형 인간의 조혈 줄기 세포는 면역 저하 된 쥐에 이식되어 있습니다. 안티 종양 면역 반응의 생체 시험에서 허용하는 엔지니어링 인간의 면역 시스템의 reconstitution에이 발생합니다.

줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

많은 실험 시스템은 면역 반응의 T 세포의 발달 및 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하는 데에 이용되고있다. 여기 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전 적 접근 경로를 규정하는 식별 경제적 시간 효율적이고, 무엇보다도 매우 유익하다 설명한다.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

배우세요 레트로바이러스를 이용해 골수 전구 세포에 T 세포 수용체를 형질 도입하고, 약 7주 만에 T 세포 구획을 재구성하는 방법입니다. 이 기법은 면역학 연구에서 다양한 TCR의 생체 내 기능을 분석하는 데 활용됩니다.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

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