Name: 헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 배우세요 헤파린-프로타민 고분자 전해질 복합체를 이용한 골 형성 성장 인자의 효율적 포집 및 조절 방출 방법. 이 기술은 BMP-2 투여량을 20배 감소시켜 척추 유합 수술의 결과를 개선할 수 있습니다.

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이 연구는 National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 및 NMRC EDG/0022/2008의 지원을 받았습니다.

1. 알긴산 용액의 제조 <ol><li> 알긴산 나트륨 (비 조사) 또는 8 MRAD 400 ㎎을 200 ㎎을 용해 이중 증류수 10ml에 알긴산 나트륨을 조사 및 비 조사 알긴산 1 시간 및 조사 알긴산 15 분간 흔들어. 밤새 4 ° C에서 알긴산 용액을 저장합니다. 알지네이트 마이크로 비드 제조 전에 멸균 0.2 μm의 주사기 필터 알지네이트 용액 필터. </li></ol> 2. 알긴산 마이크로 비드 제작 <ol><li> 70 % 에탄올로 정전 비드 발생기와 주사기 펌프를 소독 및 클래스 II 생물 안전 캐비닛 (그림 1)에 배치합니다. </li><li> 비드 발생기 내부의 자기 교반 막대와 유리 분지를 놓습니다. </li><li> 9cm 분지 위의 구슬 발생기의 팔 전극을 설정합니다. </li><li> 아암 전극의 널링 나사 2 비드 발생기의 전극 케이블을 연결하고으로 SrCl 2 용액 80 mL를 부어분지. </li><li> 로드 주사기와 고무 튜브에 0.2 μm의 여과 알긴산 용액 5 ㎖. 아암 전극에 고무 튜브를 접속 한 후, 관 내부의 공기를 배출하고 상기 노즐의 선단에 알지네이트 용액을 제공하기 위해 2 분 동안 5 ㎖ / 시간 주사기 펌프 스위치. 주사기 펌프의 전원을 끄십시오. </li><li> 다음에, 캡슐에 전환 한 다음, 시린지 펌프는 마이크로 비드 생성을 개시. 5 ㎖ / 시간 알긴 유량과 캡슐화 5.8 kV로의 전압을 설정한다. 이러한 마이크로 비드 불규칙한 크기와 모양의 경향으로서, 제 이분 (또는 주사기 밖으로 펌핑 초기 0.5ml를 알지네이트 용액) 중에 생성 된 마이크로 비드를 버린다. </li><li> 0.2 M 염화 스트론튬 용액 후속 마이크로 비드를 모은다. 알긴산 용액의 사전 계획 볼륨을 펌핑 한 후 주사기 펌프 (순서대로)를 캡슐화를 모두 해제합니다. 마이크로 비드 제조의 후속 배치에 대해이 작업을 반복합니다. 완료시의 회전제 시린지 펌프 f를 상기 캡슐화 하였다. </li><li> 가교를 완료하고, 겔을 안정 밤새 4 ℃에서 0.2 M 염화 스트론튬 용액 20 ㎖에 마이크로 비드를 저장한다. </li></ol> 알긴산 마이크로 비드의 3. 크기 측정 <ol><li> 플라스틱 피펫 알긴산 마이크로 비드의 0.5 ml의 수집 및 유리 슬라이드에 놓습니다. 10 배 배율의 광학 현미경으로 마이크로 비드를 볼 수 있습니다. 현미경 CCD 카메라와 마이크로 비드의 열 이미지를 가져 가라. 해상도 2048 X 1536에서 TIFF 형식으로 스케일 바 (500 μm의)와 함께 이미지를 저장합니다. </li><li> ImageJ에의 길이 도구를 사용하여, 마이크로 비드 및 스케일 바 (도 2)의 크기를 측정한다. 마이크로 미터 픽셀에서 마이크로 비드 길이를 변환합니다. <ol><li> 선 도구를 클릭하고 알지네이트 비드의 중간을 가로 지르는 선을 그립니다. </li><li> &quot;측정&quot;을 메뉴 바의 &quot;분석&quot;을 선택 클릭합니다. 팝업 창이 나타납니다. </li><li&gt; 반복 이미지 내의 모든 알긴산 비드를 측정하는 3.2.1-3.2.2 단계를 반복합니다. 이미지의 눈금 막대를 측정한다. </li><li> 스케일 바 X 500 ㎛, 알긴산 비드 / 길이의 길이를 다음 식을 이용하여 실제 길이에 알긴산 비드의 직경 변환. 예를 들어, 1.420 (ImageJ에 의해 측정 직경) / 2.657 (ImageJ에 의해 측정 스케일 바의 길이) * 500 μm의 = 267 μm의. </li></ol></li><li> 마이크로 비즈의 각 배치의 대표 사이즈로 (평균 ± 표준 편차) 100 마이크로 비드의 평균 크기를 고려하십시오. </li></ol> 4. 살균 <ol><li> 100 ㎛의 나일론 여과기를 사용하여 마이크로 비드를 수집하고 증류수로 비드를 세척 하였다. </li><li> 주걱을 사용하여이 용액을 마이크로 원심 튜브에 0.1 ml의 알지네이트 용액에서 만든 모든 마이크로 비드를 전송하고 건조를 방지하기 위해 가제 커버. </li><li> 마지막으로, 액정 모드를 이용하여 고온 가압 멸균하여 마이크로 비드를 살균 (115 ℃, 15 분) 또는 m 따른anufacturer의 사양. 건조되는 비드를 방지하기 위해 챔버에 증류수 1.5 L를 추가한다. </li></ol> 5. 프로타민과 헤파린 코팅 <ol><li> BSL -2- 후드 내에서 2 밀리그램 / 실온에서 1 시간 동안 (0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 멸균) mL의 프로타민 용액 1 ㎖와 멸균 마이크로 비드를 배양한다. </li><li> 1 시간 (단계 5.1)에 대한 마이크로 비드를 배양 한 후, 마이크로 bicinchoninic 산 (microBCA) 시험 (6 절)에 대한 프로타민 용액 150 μl를 수집합니다. </li><li> 두 번 증류수로 두 번 프로타민 코팅 된 마이크로 비드를 씻으십시오. 실온에서 3 분 동안 200 XG에서 벤치 톱 원심 분리기를 사용하여 스핀 다운. 원심 분리 후, 주사기를 이용하여 물을 흡인. </li><li> 0.5 mg을 1 mL의 프로타민 코팅 된 마이크로 비드를 부화 / 고분자 전해질 복합체를 만들기 위해 30 분 (PEC)에 대해 (0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 멸균) ml의 헤파린 용액. </li><li> 프로타민 코팅 된 마이크로 비드 f를 배양 한 후30 분 (단계 5.4), 헤파린 함량 (7)를 결정하기 위해 헤파린 용액 400 μl를 수집합니다. </li><li> 배양 후, 두 번 증류수로 두 번 세척하여 펙스에서 언 바운드 헤파린을 씻어. </li></ol> 6. 프로타민 내용 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 microBCA 테스트를 수행합니다. 간단히, 96 웰 플레이트에 150 μL 프로타민 용액 (전 마이크로 비드와 배양 후 수집)를 추가합니다. 150 ㎕를 microBCA 작업 솔루션을 추가합니다. </li><li> 교정 표준으로서 알부민 용액 (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 및 200 μg의 / ㎖)를 사용한다. </li><li> 60 ° C에서 60 분 동안 인큐베이션 혼합물. 562 nm에서 분광 광도계로 흡광도를 측정한다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 각각의 미지 시료의 프로타민 농도를 결정하는 표준 곡선을 사용한다. </li><li> 에서 프로타민의 합계를 감산하여 마이크로 비드의 프로타민 내용을 결정(마이크로 비드와 인큐베이션 후) 도포 액에 잔존 프로타민의 양 발 (마이크로 비드와 인큐베이션 전) 코팅액. </li></ol> 7. 헤파린 내용 <ol><li> 블루 4 mg을 톨루이딘 0.01 N 염산 20 mg의 염화나트륨을 용해시켜 작업 용액 10 ㎖를 준비한다. </li><li> 30 초 동안 3 소용돌이 : 2의 비율로 작업 솔루션 (단계 5.5에서) 시료 400 μl를 추가합니다. </li><li> n- 헥산 (작업 시약 액에 해당하는 양)의 600 μl를 추가하고 톨루이딘 블루 헤파린 단지를 추출 혼합물을 소용돌이. </li><li> 대기음 상분리 후, 주사기에 의해 수 성상을 200 μL. </li><li> 631 nm에서 분광 광도계를 사용하여 수성 상에 포함되지 않은 추출 톨루이딘 블루의 양을 측정한다. </li><li> 0 ~ 20 μg의 / ㎖의 헤파린 표준 솔루션을 준비합니다. </li><li> μg의 / m에서 헤파린 농도 대 각 헤파린 표준의 631 nm의 판독 플롯엘. 각 샘플의 헤파린 농도를 결정하는 표준 곡선을 사용한다. </li></ol> 계층 별 계층 구조 8. 공 촛점 이미지 <ol><li> 프로타민, 헤파린과 넬-1 / BMP-2 형광 아날로그 CF-405 프로타민 (파란색), CF 594 헤파린 (적색) 제작 및 FITC는 넬-1 / FITC가 라벨에 따라 (녹색) BMP-2 + 헤파린 + 프로타민 제조업체의 라벨 기술 데이터 시트. </li><li> 코트 100 형광 아날로그의 300 μL와 μg의 마이크로 비드 (5.3-5.6에 설명 된대로 코팅 방법) CF-405 프로타민 (파란색) (2 ㎎ / ㎖, 1 시간 배양), CF 594 헤파린 (적색) (0.5 ㎎ / ㎖, 30 분)와 FITC 표지는 넬-1 / FITC 표지 (녹색), BMP-2 (1.5 ㎎ / ㎖, 밤새). 언 바운드 형광 프로타민, 헤파린과 넬-1 / BMP-2를 제거하기 위해 증류수로 두 번 마이크로 비드를 씻으십시오. </li><li> 10X 확대 한 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 층별 구조 (도 3)을 관찰한다. (7) </li></ol> 9. BMP-2넬-1 통풍 관 및 릴리스와 <ol><li> 로드 PEC 100 μg의에 BMP-2 또는 넬-1 용액 1.5 ㎎ / ㎖ 13.3 μL. 10 시간 동안 진탕 (30) 회전 수에서 4 ° C에서 PEC을 품어. </li><li> 일정한 진탕 (30 RPM)와 함께 37 ℃에서 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖의 마이크로 비드를 담근다. </li><li> 상청액 1 ㎖를 모아서 1, 3, 6, 10, 14 일 후에 1 ml의 PBS로 대체. </li><li> 흡수를 평가하고 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA 방법을 사용하여 BMP-2의 효율​​을 해제. 흡수를 평가하고 제조자의 프로토콜에 따라, 카복시 퀴놀린 -2- 카르 복스 알데히드 (CBQCA) 단백질의 분석 방법을 사용 넬-1의 효율을 해제. </li><li> 시간 (t)에서 누적 해제를 결정합니다 시간 시간 (t) + 이전 릴리즈에서 시간 (t) = 릴리스의 누적 릴리스 (t-1). </li><li> 시간에 대한 BMP-2와 넬-1의 누적 릴리스 플롯. </li></ol> 10. 체외 생물 작용 (Bioactivity)넬 - 1 참고 넬 -1- PEC 해제의 생체 활성은 토끼의 골수 줄기 세포 (rBMSC)의 알칼리성 포스파타제 (ALP)의 발현을 증가시키는 능력을 측정함으로써 평가 하였다. <ol><li> 종자 20,000 24- 웰 플레이트에 웰 당 rBMSCs하고 태아 소 혈청 (FBS) CO 2, 37 ℃에서 5 % 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) + 10 %로 1 ㎖로 하루 동안 증가 할 수있다. </li><li> 24 시간 후에는 10-8 몰 / L의 덱사메타손, 10 % FBS, 2 % 페니실린 스트렙토 마이신, 50 μg의 / ㎖ 아스코르브 산, 10 밀리몰 / L 베타 글리세로 보충 골아 세포 배지 (DMEM 1 ㎖와 함께 배지를 교체하고, ) 37 ° C에서 칠일, 5 % CO 2. </li><li> 세포 (이는 골 형성 매체 변화하는 동안 PEC 마이크로 비드의 유실을 방지)로부터 분리 펙스를 유지하기 위해 300 μg의 PEC-넬-1 세포 배양 삽입 내부와 PEC (단계 8.2에서) (TC 삽입)을 놓습니다. 장소 TC는 PL 아니라 (24)에 삽입14 일 동안 먹었다. </li><li> 일단 3 일, 흡인 1 TC 삽입 외부에 바늘을 삽입하여 골 형성 매체의 ml의 신선한 골 형성 배지 1 ㎖로 교체합니다. </li><li> 배양 7 일, 14 일 후, 상기 키트 제조자의 프로토콜에 따른 ALP 분석 키트 ALP 활성을 결정한다. <ol><li> 10 분 동안 4 ℃에서 0.1 % 트리톤-100을 함유하는 분석 완충액를 Lyse 셀. 셀 스크레이퍼를 사용하여 부착 된 세포를 긁어. 적어도 60 분 동안 교반하면서 4 ° C에서 세포 현탁액을 품어. </li><li> 10 분 동안 4 ° C에서 2,500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 노동당 분석을위한 뜨는을 수집합니다. </li><li> 200에서 96 웰 플레이트에 ml의 0 NG / 직렬로 희석 알칼리 포스 파타 아제 표준 용액 50 μl를 추가합니다. 알칼리성 포스파타제 표준의 최종 량은 웰 / 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 및 0 NG이다. </li><li> 희석와 b 단계 10.5.2에서 뜨는을 추가 (50 μL / 웰) 및 희석uffer. </li><li> 각 웰에 P는 -nitrophenyl 인산 (pNPP) 기질 용액 50 μl를 추가합니다. 부드럽게 30 초 동안 판을 흔들어 시약을 섞는다. 어둠 속에서 30 분 동안 혼합물을 품어. 플레이트 리더로 ​​405 nm에서 흡광도를 측정한다. </li><li> 검량선을 사용 ALP 활성을 계산한다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 microBCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 함량을 측정. 단백질 함량에 의해 ALP 활성을 나누어 ALP 활성을 정상화. </li></ol> 11. 세포 생존 <ol><li> 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) 24 시간 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT), 37 ° C에서 DMEM + 10 % FBS의 1 ml의 PEC-넬-1 200 mg의 부화 시험. </li><li> 종자 2,000 rBMSCs 잘 당과 96 웰 플레이트에서 (10 % FBS와 DMEM 100 ㎕에서) 37 ° C, 5 % CO 2에서 1 일 동안 배양한다. </li><li> PEC-넬-1 / PEC 추출물 100 ㎕와 DMEM + 10 % FBS를 교체하고 품어37 ° C에서 5 % CO 2. </li><li> 일일 또는 배양 3 일 후, 5 ㎎ / ㎖ MTT 용액 10 μl를 추가 또한 어둠 속에서 4 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. </li><li> 포르 마잔 결정을 용해 각 웰에 100 ㎕의 DMSO 솔루션을 추가합니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 결정한다. </li><li> 상대적인 성장 속도를 계산한다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" /></li></ol> 비계와 BMP-2 넬-1로드로 (12) 포장 <ol><li> BSL-2 챔버 내부의 멸균 주걱을 사용하여 트라이 인산 칼슘 (mPCL-TCP) 비계 - 생 흡수성 의료용 폴리 카프로 락톤의 기공에 펙스를 포장합니다. </li><li> PEC와 함께 제공된 mPCL-TCP 지지체에 1.5 밀리그램 / BMP-2, 넬-1 ml의 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C를 품어. </li></ol>

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우리는 관심의 충돌이 없습니다.

이 프로토콜은 층별 자기 조립을 통해 페치 제조 방법을 제공한다. 계층 별 구조는 층 프로타민, 헤파린, BMP-2와 넬-1과 초점 현미경 형광 유사체를 사용하여 가시화된다. 흡수 및 방출 시험은 PEC에 헤파린하는 골 형성 성장 인자 흡수 및 방출을 매개하는 것으로 나타났다. PEC 방법의 흡수 효율은 : 넬-1 : 86.7 ± 2.7 %, BMP-2 : 70.5 ± 3.1 %. PEC 캐리어 칼슘 아파타이트 입자 (40-80%) 11 순수한 표면 흡착 담체에 비해 넬-1 (20 %) 방출 더 변조를 갖는다. 방출 조절 외에, 헤파린은 원치 않는 독성과 관련된 문제를 피하기 12 그러한 프로타민과 같은 폴리 양이온의 과도한 양전하를 중화시킨다. MTT 분석하고하는, Alamar 블루 분석 (7)의 결정에 따라 펙스는 세포 독성의 징후가 표시되지 않습니다. ALP 분석은 PEC 캐리어가 bioact...

가관절 발생률은 퇴행성 척추 융합 및 개정 척추 수술 1에서 10 ~ 45 %로 높은 것으로보고되었다. 예컨대 BMP-2, 넬-1 및 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 등 골 형성 성장 인자가 새로이 골 형성을 촉진하기 위해 도입 된 척추 융합 등 재건 뼈 수술 중에 불유합의 속도를 감소시킨다. 이 중, BMP-2는 척추 융합 2 인기있는 선택입니다. 유도하고 새로운 뼈의 형성을 촉진 BMP-2의 효능이 잘 3 확립되었지만; 이러한 이소성 골 형성, 장액 및 혈종 형성, 염증 반응, radiculitis, 추체의 골 용해 및 역 행성 사정 등 임상 적으로 유의 한 합병증으로 인해 4,5 사용되는 생리적 양에 우려의 문제로 계속합니다. 따라서, BMP-2의 도즈를 낮추는 것은에서의 관련 전략을 유지부작용을 최소화하도록 유혹. 또한, 효율적인 캐리어 시스템은 BMP-2 현대 콜라겐 스폰지 캐리어 시스템에서 관찰되는 초기 파열 방출을 억제하여 더욱 강력한 사이토킨이 연장 된 및 국소 전달을 향상시키기 위해 필요하다. 양이온과 음이온 성 고분자 전해질을 교대의 층별 자기 조립은 지지체 매트릭스 또는 임플란트 재료 (6)의 표면에 고분자 전해질 복합체를 구축하는 동조 방법으로 사용될 수있다. 이러한 관점에서, (모든 생물학적 제제의 가장 높은 음의 전하 밀도를 갖는 알려진) 헤파린 열광적 정전 헤파린 결합 도메인을 통한 성장 인자의 다양한 바인딩 인식되었다. 실제로, 헤파린 반감기를 연장하고, 따라서 여러 가지 성장 인자의 생리 활성을 강화시키는 것으로 밝혀졌다. 이를 바탕으로, 우리 그룹 헤파린 계 고분자 전해질 복합체 (PEC)을 제조하는 데 계층 별 자기 조립 층 프로토콜을 채택<html> 하중 및 고정 7,8시 골 형성 성장 인자의 생리 활성을 유지합니다. 알지네이트 마이크로 비드 코어는 α-L-guluronate (G) 2가 양이온의 칼슘 또는 스트론튬 이온 알긴산 잔기를 가교 결합하여 제조 하였다. 알지네이트 코어는 생분해 성 지지체 매트릭스이고; 이는 이식 한 결과, 골 증식을위한 공간을 제공하는 융합 침대에서 재 흡수된다. 폴리 -L- 라이신 (PLL) 또는 프로타민 (이 경우, 알지네이트 마이크로 비드 담체 코어) 골격 매트릭스 및 음으로 하전 된 헤파린 모두 인터레이스 양이온 층으로서 사용된다; 음이온 성 헤파린 계층 기능은 안정화로드 성장 인자 국산화있다. 삼중 층 PEC는 돼지 모델 9 성장 인자 적재량을 증가시키는 것으로 나타났다. 최근 PEC 캐리어 성공적 쥐 10 척추 융합 8 돼지 모델에서 적어도 20 배 BMP-2의 유효 용량을 감소시키는 것으로 나타났다. ntent는 &quot;&gt; 여기서는 모델 골 형성 성장 인자로서 BMP-2를 이용하여 척추 융합 향상된 성장 인자 전달 및 다른 골 재건술 실용 제조 페치 방법을보고한다.

<table><tbody><tr><td>생명과학 아크로디스크 25&nbsp; mm 주사 필터 0.2&nbsp; &마이크로; m Supor 멤브레인</td><td>PALL&nbsp;</td><td>PN4612</td><td>멸균 프로타민, 헤파린 용액 초여과</td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Cell Star&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 Nuclon Delta Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>PEC-NELL-1</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>Precipitate CF-405 Labeled protamine</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen의 세포 독성 측정, Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>PEC-BMP-2</td></tr><tr><td>알칼리 인산가수분해효소 분석(ALP) 분석 키트</td>의 세포 독성 측정 <td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>FITC 라벨링에서 시약 중지</td></tr><tr><td>무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>형광 이소티오시아네이트 I</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드( DMSO)</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td>디졸브&nbsp; 포마잔&nbsp;</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>히라야마</td><td>HU-110</td> 스팀 베타-글리세로인산염으로 <td>알긴산 비즈를 살균</td></tr><tr><td></td><td>시그마 알드리치</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (뼈 이식 대형 II 키트)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA</td><td>7510800</td><td>골형성 성장 인자, 투석은 FITC 결합을 방해하는 안정제 구성 요소를 제거하는 데 필요합니다</td></tr>. <tr><td>Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>NELL-1 단백질</td></tr><tr><td>세포 여과기(100&nbsp; &마이크로; m)</td><td>BD Science</td><td>352360</td><td>ALP 분석용 PEC 보유</td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼 290&nbsp; mm 블레이드와이드 20&nbsp; mm</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>24웰 플레이트에서 세포</td></tr><tr><td>분리 CF 405S, Succinimidyl Ester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>프로타민 라벨링용 파란색 형광 염료</td></tr><tr><td>CF 594, Hydrazide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>헤파린 라벨링용 딥 레드 형광 염료</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마 알드리치</td><td>D4902</td><td>골형성 성장 매체</td></tr><tr><td>덱스트란 탈염 컬럼</td><td>피어스의 구성 요소 (Thermo Scientific)&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>기코&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Quantikine ELISA 키트</td><td>R& D 시스템</td><td>DBP200</td><td>BMP-2 릴리스</td></tr><tr><td>결정 태아 소 세럼 FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>플루오세인 이소티오시아나네이트, 이성질체 I</td><td>시그마 알드리치</td><td>F7250</td><td>그린 형광 염료 NELL-1 및 BMP-2 라벨링용</td></tr><tr><td>ThinCert 세포 배양 삽입물, 24 웰 플레이트용, 멸균</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662630</td><td>골형성 매체 교체 시 PEC 세척 방지</td></tr><tr><td>Havard Appartus 주사기 펌프(11 plus)</td><td>Havard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane(>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Heparin 결합 도메인과 osteogenic 성장 인자와</td></tr><tr><td>결합 염산(37%)</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>고부식성</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>바인더</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermoscientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>ALP 및 microBCA 분석용</td></tr><tr><td>Nisco 세포 캡슐화기</td><td>Nisco Engineering Inc</td><td>캡슐화 장치 VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP 비계(기공 크기는 1.3&nbsp; mm)</td><td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>in vivo 연구를 위한 PEC 홀드</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 10,000 unit/ml, 100&nbsp; ml</td><td>Hyclone 세포 배양</td><td>SV30010</td><td>항생제</td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x 용액, 초순수 등급</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>폴리케이션</td></tr><tr><td>프로타민 설페이트 염, 연어 Sigma</td><td>Aldrich</td><td>P4020</td><td>폴리케이션</td></tr><tr><td>셰이커</td><td>랩넷</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>뱀 가죽 투석 튜빙 3,500 MWCO 22&nbsp; mm x 35 피트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68035</td><td>투석으로 미반응 FITC 제거</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>US Biological</td><td>S4000</td><td>완충액</td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>완충액</td></tr><tr><td>염화스트론튬 헥사하이드레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>255521</td><td>알긴산용 크로스링기</td></tr><tr><td>주걱</td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>Terumo</td><td>140425R</td><td>주사기의 직경이 유속에 영향을 미침</td></tr><tr><td>75cm2세포 배양 플라스크 캔티드 넥</td><td>코닝</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>톨루이딘 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>52040</td><td>헤파린 분석</td></tr><tr><td>Trypsin 1x</td><td>Hyclone Cell Culture</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium alginate</td><td>Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)</td><td>Pronova UPMVG</td><td>마이크로비즈의 핵심 재료</td></tr></tbody></table>

헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

재건 뼈 수술하는 동안, 성장 인자의 생리적 금액은 경험적으로 성공적으로 뼈 융합을 촉진하는 발판에로드됩니다. 매우 유력한 생물학적 제제의 많은 양이 급격한 효소 분해의 결과로서 성장 인자 불안정성뿐만 아니라 임플란트 부위에서의 성장 인자의 충분한 양의 국산화 캐리어 효율성에 요구된다. 따라서, 이들 릴리스 예컨대 BMP-2 / 넬-1과 성장 인자의 안정성을 연장하고, 제어 전략은 실제로 효과적인 투여 량을 낮출 수 있으며, 따라서 장래의 골 재생 수술시에 더 큰 용량의 필요성을 감소시킨다. 차례로 이것은 부작용 성장 인자 비용을 감소시킬 것이다. 자기 조립 농도 (PEC)는 생체 내 안정성을 향상시킴으로써 헤파린 결합 더욱 강화할 성장 인자의 생리 활성을 통해 BMP-2 / 넬 -1- 전달 나은 제어를 제공하기 위해 제작되었다. 여기에서 우리는 대인 수수 에이즈 PEC 제조의 단순성을 설명재건 수술 중에 뼈의 성장 인자의 다양한 RY.

우리의 캐리어에서, 프로타민은 비슷한 화학적 특성을 가지고로 폴리 -L- 라이신의 대용으로 선정되었다 그것은 FDA는 헤파린의 해독제로 승인 된 것입니다. 광학 현미경 결과는 비 조사 마이크로 비드는 267 ± 14 ㎛의 직경을 갖는 구형 상인 것으로 나타났다. (0.35 mm의 노즐을, 5 ㎖ / hr의 5.8 kV의 유속). 조사 마이크로 비드의 대부분은 눈물 방울 형상이다. 조사 된 마이크로 비드의 원형 부에서 측정 된 직경 (4 ㎖ / hr의 6 kV의 유속 0.35 mm 노즐) 212 ± 30 ㎛의이었다. (그림 4). PEC 마이크로 비드의 공 촛점 이미지는 CF-405 라벨 프로타민 (파란색), CF594 표지 헤파린 (적색)과 FITC-BMP-2 / FITC-넬-1 (녹색)의 레이어로 레이어 코팅을 알 수있다. 결과...

헤파린과 프로타민으로 제조된 자체 조립 고분자 전해질 복합체(PEC)를 알긴산 비드에 증착하여 골생성 성장 인자의 방출을 가두고 조절했습니다. 이 전달 전략은 척추 융합 응용 분야에서 BMP-2 선량을 20배 줄일 수 있습니다. 이 문서에서는 PEC의 이점과 제조를 설명합니다.

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

이 절차의 전체적인 목표는 고분자 전해질 복합체 쉘을 제작하는 것입니다. 이는 헤파린 결합 도메인을 가진 광범위한 성장 인자들을 포집하고 방출을 조절할 수 있는 운반체입니다. 이 방법은 특정 성장 인자의 효율적인 포집 및 전달을 통해 정형외과 조직 공학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 제시할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 유기 용매를 자주 사용할 필요가 없다는 점입니다. 유기 용매는 성장 인자의 생물학적 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 비조사 나트륨 알지네이트 200 mg 또는 8 Mrad 조사 나트륨 알지네이트 400 mg을 2중 증류수 10 mL에 용해합니다.그리고 1시간 동안 흔들어 섞습니다. 알긴산 용액을 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 알긴산 마이크로비드 제작 전, 멸균된 0.2 µm 시린지 필터로 알긴산 용액을 여과합니다.정전기 BE 제너레이터와 시린지 펌프를 70% ethanol로 소독한 후 2등급 생물안전작업대(class two biological safety cabinet) 내에 배치합니다. 그런 다음 마그네틱 스터 바가 들어 있는 유리 용기를 BE 제너레이터 내부에 놓습니다. BE 제너레이터의 암 전극(arm electrode)을 용기 위 9 cm 높이로 설정합니다.BE 발생기의 전극 케이블을 암 전극의 두 번째 신경 나사에 연결합니다. 그리고 베이슨에 염화스트론튬 용액 80 milliliters를 붓습니다. 다음으로, 0.2 micron 필터링된 알지네이트 용액 5 milliliters를 고무 튜브 내의 시린지에 충전합니다.고무 튜브를 팔 전극에 연결한 후, 시린지 펌프를 5 mL/h의 속도로 2분 동안 작동시킵니다. 이는 튜브 내부의 공기를 배출하고 알지네이트 용액을 노즐 끝까지 전달하기 위함입니다.그런 다음, 시린지 펌프의 전원을 끕니다. 마이크로비드 생성을 시작하려면 캡슐화 장치를 5.8 kilovolts로 설정하십시오. 이어서 시린지 펌프를 사용하여 알지네이트 유량을 5 mL/h로 설정합니다.처음 2분 동안 생성된 마이크로비드는 크기와 모양이 불규칙한 경향이 있으므로 폐기하십시오. 이후 생성되는 마이크로비드는 0.2 molar 염화 스트론튬 용액에 수집하십시오. 시린지 펌프를 끈 다음 캡슐화 장치를 끄십시오.계획된 양의 알지네이트 용액을 펌핑한 후, 후속 마이크로비드 제작 배치에 대해 이 과정을 반복하십시오. 가교 결합을 완료하고 겔을 안정화하기 위해

polyelectrolyte-complex-for-heparin-binding-domain-osteogenic-growth

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

다음 섹션에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 우리는 특히 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로서 세포 및 단백질 캡슐의 이중 목적 multilayered 알지네이트요 microspheres를 만들기위한 기술을 설명합니다.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

우리는 표면에 BMP-2를 효율적으로 고정화를 달성하기위한 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 유리 아민 잔기를 통해 BMP-2 공유 결합을 달성하기 위해 자기 조립 단분자막의 형성에 기초한다. 이 방법은 세포막에서 신호를 연구 할 수있는 유용한 도구입니다.

공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합

이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다.  단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

엔지니어링된 마이크로 채널이 있는 뼈대와 같은 템플릿을 만드는 단계별 일반 프로세스가 제공됩니다. 템플릿의 높은 흡수 및 유지 능력은 마이크로 채널을 통한 모세관 작용으로 입증됩니다.

마이크로 채널로 독특한 모세관 액션 뼈 같은 템플릿 대형 나폴레옹 결함의 복원에 대한 세포의 모집을 향상시킬 수 있습니다

조직 공학을 위한 스캐폴드는 세포 틈새의 복잡한 생화학적, 생물물리학적 미시환경을 다시 요약해야 합니다. 여기에서는 계면 고분자 전해질 복합체 섬유를 플랫폼으로 사용하여 지속적인 생화학적 방출을 가진 복합 다중 구성 요소 고분자 골격을 만드는 방법을 보여줍니다.

생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판

이 비디오는 FACS 분리를 위해 밀도 구배로 흉선 상피 세포(TECH)를 강화하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한 EAK16-II/EAKIIH6 펩타이드를 사용하여 TEC 응집체 형성을 촉진하는 것을 보여줍니다. EAK16-II/EAKIIH6 하이드로겔의 미세환경은 TEC의 생존과 기능을 유지하는 데 필요한 3D 구성을 제공합니다.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

생체 재료 뼈 Morphogenetic 단백질 2 (BMP2) 실수로 비-연합 뼈 골절을 치유 하 새로운 치료 전략으로 사용 되었습니다. 요인의 통제 자료에서 발생 하는 부작용을 극복 하기 위해 제안 하는 사이트를 새로운 전략-직접 따라서 향상 된 osteogenic 기능으로 자료를 만드는 요소를 고정.

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

골수 혈관 틈새의 시험관 내 모델은 중간엽 및 내피 세포를 프리캐스트 3D PEG 하이드로겔에 파종하여 설정됩니다. 틈새의 내피 네트워크, ECM 성분 및 ALP 활성은 사용된 성장 인자에 따라 다릅니다. 이 플랫폼은 진행된 암 모델에 사용할 수 있습니다.

이미징 마이크로플레이트에서 프리캐스트 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 하이드로겔을 사용하여 혈관화된 골수 틈새의 간단한 설정

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

이 프로토콜은 산소 전달을 위해 설계된 계층적으로 다공성인 UiO-66 나노입자의 합성, 헤모글로빈 캡슐화, 표면 PEG질화를 상세히 설명합니다. 이 절차는 결함 공학과 변형 촉진 바이코치옹 커지먼트를 결합하여 생의학 응용에 적합한 투과율이 높고 생리학적으로 안정적인 운반체를 생성합니다.

산소 전달 응용을 위한 계층적 다공성 UiO-66 나노입자에서의 합성, 헤모글로빈 캡슐화 및 이교수 PEGylation

배우세요 헤파린-프로타민 고분자 전해질 복합체를 이용한 골 형성 성장 인자의 효율적 포집 및 조절 방출 방법. 이 기술은 BMP-2 투여량을 20배 감소시켜 척추 유합 수술의 결과를 개선할 수 있습니다.

헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

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