헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

이 절차의 전반적인 목표는 고분자 전해질 복합체 껍질을 제작하는 것입니다. 헤파린 결합 도메인으로 광범위한 성장 인자의 방출을 포획하고 조절할 수 있는 운반체. 이 방법은 효율적인 포획 및 전달 전용 성장 인자를 위해 정형외과 조직 공학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 유기물을 자주 사용할 필요가 없다는 것입니다. 성장 인자의 생물 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 방사선 조사되지 않은 알긴산 나트륨 200 밀리그램 또는 8 메가라드 조사 알긴산 나트륨 400 밀리그램을 이중 증류수 10 밀리리터에 용해시키십시오.

그리고 1시간 동안 흔듭니다. 알긴산 용액을 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 알기네이트 마이크로비드를 제조하기 전에 멸균 0.2미크론 주사기 필터로 알긴산 용액을 여과합니다.

정전기 BE 발생기와 주사기 펌프를 70% 에탄올로 소독하고 클래스 2 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 그런 다음 BE 발생기 내부에 자기 교반 막대가 있는 유리 대야를 놓습니다. BE 발전기의 암 전극을 대야 위로 9cm 높이로 설정합니다.

BE 발생기의 전극 케이블을 암 전극의 뉴로 나사 2개에 연결합니다. 그리고 80 밀리리터의 염화 스트론튬 용액을 대야에 붓습니다. 다음으로, 0.2 미크론 여과 된 알긴산 용액 5 밀리리터를 고무 튜브의 주사기에 넣습니다.

고무 튜브를 암 전극에 연결한 후 시간당 5밀리리터로 주사기 펌프를 켭니다. 2분 동안. 튜빙 내부의 공기를 배출하고 알긴산 용액을 노즐 끝으로 전달합니다.

그런 다음 주사기 펌프를 끕니다. 마이크로비드 생성을 시작하려면 인캡슐레이터를 5.8kV로 설정하십시오. 그 다음에는 시간당 5밀리리터의 알긴산 유속으로 주사기 펌프가 이어집니다.

처음 2분 동안 생성된 마이크로비즈는 크기와 모양이 불규칙해지는 경향이 있으므로 폐기하십시오. 0.2 몰 염화스트론튬 용액에서 후속 마이크로비드를 수집합니다. 주사기 펌프를 끈 다음 캡슐화기를 끕니다.

미리 계획된 양의 알긴산 용액을 펌핑한 후. 마이크로비드 제조의 후속 배치에 대해 이 작업을 반복합니다. 20ml의 0.2몰 염화스트론튬 용액에 마이크로비즈를 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관하여 교차 결합을 완료하고 겔을 안정화합니다.

플라스틱 피펫으로 0.5ml의 알긴산 마이크로비즈를 수집합니다. 그리고 유리 슬라이드에 올려 놓습니다. 광학 현미경으로 10배 배율로 마이크로비즈를 볼 수 있습니다.

현미경 CCD 카메라로 마이크로비즈의 이미지 10개를 촬영합니다. 500미크론 축척 막대가 있는 이미지를 TIFF 형식으로 2048 x 1536 해상도로 저장합니다. 이미지 J의 길이 도구를 사용하여 마이크로비즈의 크기를 측정합니다.

그리고 눈금 막대. 그런 다음 마이크로비드 길이를 픽셀에서 마이크로미터로 변환합니다. 선 도구를 클릭하고 알긴산 비드의 중간을 가로질러 선을 그립니다.

메뉴 모음에서 analyze(분석)를 클릭하고 measure(측정)를 선택합니다. 팝업 창이 나타납니다. 이 단계를 반복하여 이미지 내의 모든 알긴산 비드를 측정합니다.

이미지의 눈금 막대를 측정합니다. 100미크론 나일론 스트레이너를 사용하여 마이크로비즈를 수집합니다. 그리고 두 배 증류수를 가진 구슬을 세척하십시오.

주걱을 사용하여 0.1ml의 알긴산 용액으로 만든 모든 마이크로비드를 2mL 마이크로원심분리기 튜브에 옮기고 거즈로 덮어 건조를 방지합니다. 마지막으로, 액체 모드를 사용하여 또는 제조업체의 사양에 따라 자동 절단하여 마이크로비드를 멸균합니다. 비드가 건조되는 것을 방지하기 위해 챔버에 1.5리터의 증류수를 추가합니다.

BSL2 후드 내부에서 멸균 마이크로비드를 1밀리리터당 2밀리그램의 멸균된 프로타민 용액과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 프로타민으로 코팅된 마이크로비즈를 이중 증류수로 두 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 200배 G의 탁상형 원심분리기를 사용하여 스핀다운합니다.

원심분리 후 주사기를 사용하여 물을 흡입합니다. 프로타민으로 코팅된 마이크로비즈를 1밀리리터의 멸균된 0.5밀리그램/밀리리터 헤파린 용액으로 30분 동안 배양합니다. 이것은 헤파린 결합 성장 인자에 대한 열렬한 친화력을 가진 고분자 전해질 복합체 껍질을 생성합니다.

배양 후 주사기를 사용하여 헤프라인을 흡입합니다. 그리고 이중 증류수로 두 번 세척하여 고분자 전해질 복합체에서 결합되지 않은 헤파린을 씻어냅니다. 13.3 마이크로리터의 고분자 전해질 복합체 100 마이크로그램에 1밀리리터당 1.5 밀리그램의 뼈 형태 유전 단백질 2 또는 NELL 유사 분자 1 용액을 로드합니다.

고분자 전해질 복합체를 섭씨 4도에서 30RPM 이하로 10시간 동안 흔든 후 배양합니다. 다음으로, 마이크로비즈를 섭씨 37도의 PBS(phosphate buffered saline) 1밀리리터에 넣고 계속 흔들면서 담급니다. 상등액 1ml를 모으고 1일, 3일, 6일, 10일 및 14일 후에 PBS 1ml를 교체하십시오.

제조업체의 프로토콜에 따라 CBQCA 단백질 분석 방법을 사용하여 NEL(분자 1)과 같은 NELL(분자 1)의 흡수 및 방출 효율을 평가합니다. 또는 elisa를 수행합니다. 고분자 전해질 복합체에서 방출되는 분자 1과 같은 NELL의 생체 활성은 토끼 골수 줄기 세포에서 알칼리성 인산가수분해효소의 발현을 증가시키는 능력을 측정하여 평가됩니다.

24 웰 플레이트에 웰 당 20, 000 토끼 골수 줄기 세포를 파종합니다. 그리고 dulbecco의 변형 독수리 배지 1ml와 섭씨 37도 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청 1ml로 하루 동안 자랄 수 있도록 합니다. 24시간 후, 배지를 섭씨 37도에서 7일 동안 1ml의 골형성 배지로 교체하십시오.

그리고 5%CO2. 300마이크로그램의 고분자 전해질 복합체와 고분자 전해질 복합체 NELL(NELL)을 세포 배양 삽입물 내부에 배치하여 복합체를 세포와 분리시킵니다. 골형성 배지 변화 중에 고분자 전해질 복합 마이크로비드가 씻겨 나가는 것을 방지하기 위해 인서트를 24웰 플레이트에 놓습니다.

3일에 한 번씩 인서트 외부에 바늘을 놓아 골형성 배지 1ml를 흡인합니다. 그리고 1ml의 새로운 골형성 배지로 교체하십시오. 7일 및 14일 배양 후 알칼리성 인산가수분해효소 분석 키트로 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 측정합니다.

키트 제조업체의 프로토콜에 따라. 고분자 전해질 복합체를 생체 흡수성 의료 등급 폴리카프로락톤 인산삼칼슘 스캐폴드의 기공에 패키징합니다. BSL2 챔버 내부의 멸균된 주걱을 사용합니다.

고분자 전해질 복합체로 채워진 골격에 뼈 형태 유전 단백질 2 또는 NELL 유사 분자 1의 1.5 밀리그램 또는 밀리리터 용액을 추가합니다. 그리고 섭씨 4도에서 밤새 배양하십시오. 알긴산 마이크로비즈는 크기와 형태를 모니터링하기 위해 현미경으로 검사됩니다.

조사되지 않은 알긴산 마이크로비즈는 구형이고 조사된 마이크로비즈는 눈물방울 모양입니다. 크기 분포는 성장 인자 흡수의 중요한 요소입니다. 그리고 크기를 줄이면 표면 대 면적 비율이 증가합니다.

image J 소프트웨어로 알기네이트 마이크로비즈를 측정할 때 평균 100개의 마이크로비즈는 각 마이크로비드 일치의 크기 분포를 잘 추정할 수 있습니다. 성장 인자 흡수는 적절한 코팅 기술에 따라 달라지기 때문에 각 코팅의 층 두께는 컨포칼 마이크로소피에 의해 관찰됩니다. 여기에서는 프로타민, 헤파린, 분자 1과 같은 NELL, 뼈 형태 유전 단백질 2의 형광 유사체와 함께 배양된 알기네이트 마이크로비드의 컨포칼 레이저 스캐닝 마이크로솜피 이미지가 표시됩니다.

알칼리성 포스파타제 활성은 방출된 성장 인자의 생체 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 14일째에 분자 1과 같은 고분자 전해질 복합체 NELL로 배양한 후 알칼리성 인산가수분해효소 활성이 2.2배 증가하는 것이 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행하는 동안 알긴산 농도가 마이크로비드 안정성에 영향을 미친다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 방사선 조사된 알긴산의 경우 4방향 퍼센트가 필요했습니다. 방사선 조사되지 않은 상대의 경우 양방향 퍼센트가 필요했습니다.

이 절차에 따라 다층 코팅에 의한 성장 인자 부하를 더욱 증가시킬 수 있습니다. 이 기술을 통해 조직 공학 분야의 연구자들은 다른 질병 모델에서 성장 인자 전달을 탐구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 좁은 크기 분포로 고분자 전해질 복합체를 제작할 수 있습니다.