T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

이 분석의 전반적인 목적은 전단 응력 조건에서 세포 접착에 특정 처리군이 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이 방법은 어떤 인자가 인테그린 활성화를 매개하는지와 같이 면역 세포 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 쉽게 재현 가능한 유동 시스템 내에서 단일 접착 분자인 인테그린 쌍을 연구할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 LFA1 활성화에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 인테그린 연구에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 기술적인 설정이 정밀하게 수행되어야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. CHO-ICAM 세포를 수확하려면, 배양액을 0.5% trypsin EDTA로 처리하고 실온에서 가볍게 흔들어주며 1분 동안 반응시킵니다.

세포가 떨어지기 시작하면 4 mL의 신선한 배지로 트립신을 중화하고, 해리된 세포 수를 측정합니다. 세포 농도를 챔버당 0.75 × 10⁵ cells가 되도록 희석한 후 원심분리기로 침전시킵니다. 그다지, complete CHO-ICAM 배양 배지를 사용하여 흐름 챔버당 30 µL의 부피로 펠렛을 재현탁하고, 흐름 챔버의 각 리저버에 세포 30 µL씩을 천천히 분주합니다.

세포를 5% 이산화탄소가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 5분 동안 안정시킵니다. 그런 다음 각 챔버의 두 리저버에 완전 배양액 200 µL를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다. T 세포를 수확한 후, 세포 현탁액의 수를 측정하여 챔버당 2 × 10⁶ cells 농도로 희석합니다.

그 후 세포를 원심 분리하고, $2 \times 10^6$개의 T 세포당 1% 포도당이 첨가된 PBS 1mL에 펠릿을 재부유합니다. 다음으로, 빛이 차단된 상온 조건에서 1:1000으로 희석한 CFSE로 T 세포를 8분 동안 염색합니다. 배양 시간이 끝나면 세포를 원심 분리하고, 챔버당 240$\mu$L의 무혈청 RPMI 배지에 펠릿을 재부유합니다.

그런 다음 각 챔버당 하나씩 1.5 milliliter 튜브에 세포를 나누어 담고, 로딩 전까지 37 degrees Celsius 히트 블록에 튜브를 보관하십시오. 이미징 전에 현미경 라이브 이미징 챔버를 37 degrees Celsius로 예열하고, 500 milliliter 유리병에 물을 채우십시오. 뚜껑에 in과 out으로 표시된 두 개의 구멍을 뚫고, 유입 호스와 연결된 시린지를 in 구멍으로 통과시키고, 유입 저장조 연결 호스를 out 구멍으로 통과시키십시오.

60 mL 주사기를 사용하여 입력 호스에 60 mL의 물을 흘려보낸 후, 이어서 60 mL의 37 °C 무혈청 배지를 흘려보내 시스템 내의 공기를 모두 제거합니다. 호스의 프라이밍이 완료되면, 시스템을 37 °C로 유지하기 위해 전체 입력 장치를 현미경의 라이브 이미징 챔버 내부로 옮깁니다. 호스와 주사기는 챔버 밖으로 빼내어 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다.

다음으로, 배출 폐기물 용기로 사용할 250 milliliter 병의 뚜껑에 구멍을 뚫고, 배출 튜브를 구멍을 통해 병 안으로 통과시킵니다. 그런 다음 배출 병의 뚜껑을 느슨하게 닫고 전체 배출 장치를 라이브 이미징 챔버 안에 배치합니다. 이제 플로우 챔버 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓고, 20X 대물렌즈를 사용하여 CHO ICAM 단층의 초점 평면을 설정합니다.

그 다음, 자극하지 않은 대조군부터 시작하여, 첫 번째 챔버의 출력 리저버에서 70 µL씩 세 번 배출하고, 입력 리저버에 CFCS로 표지된 T 세포를 70 µL씩 세 번 추가합니다. T 세포가 입구에서 출구로 이동하는 동안, 각 챔버에서 CFSE 양성 T 세포의 임의 영역 5곳을 촬영하여 유동 전 세포 수를 측정합니다. 이어서, 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하며 입력 및 출력 호스를 유동 챔버 리저버에 동시에 연결하고, CFSC 염색 T 세포를 계속 관찰하면서 0.3 mL/min의 속도로 전단 응력 유동을 시작합니다.

T 세포의 이동이 관찰되는 즉시 5분 동안 타이머를 시작하고, 5분이 경과하면 흐름을 중단하십시오. 그런 다음, 각 챔버에서 CFSE 양성 세포가 있는 영역 5곳을 무작위로 선택하여 촬영함으로써 흐름 후의 세포 수를 측정하십시오. PMA 자극의 경우, 앞서 시연한 것과 같이 T 세포를 두 번째 흐름 챔버에 로딩하여 이미징하기 직전에 T 세포 한 튜브를 PMA로 자극하여 양성 대조군으로 사용하십시오.

SDF-1 alpha 자극을 위해, 먼저 세 번째 챔버의 출력 리저버에서 배지를 70 µL씩 세 번 제거한 다음, 입력 리저버에 70 µL의 SDF-1 alpha를 추가합니다. 5분 후, 출력 리저버에서 70 µL씩 세 번 제거하고, 방금 시연한 것과 같이 이미징을 위한 나머지 T 세포 튜브를 추가합니다. 이 대표 이미지들에서는 서로 다른 자극 조건하에서 유동 전의 T 세포 수가 비슷하게 관찰됩니다.

5분 동안의 지속적인 전단 응력 가한 후, PMA 및 SDF-1 alpha 자극 조건에서 부착된 T 세포의 수가 증가하며, 자극되지 않은 T 세포는 소수만 부착된 상태로 남아 있습니다. 실제로 예를 들어, SDF-1 alpha T 세포 활성화는 자극되지 않은 대조군 세포와 비교했을 때 T 세포 부착을 거의 2배 증가시킵니다. 또한, SDF-1 alpha 존재 또는 부재 시 일차 인간 CD3 양성 T 세포의 부착 백분율을 계산하면, 전단 응력 하에서 자극되지 않은 T 세포는 15%가 부착되는 반면, SDF-1 alpha 활성화 조건에서는 T 세포의 50%가 부착됩니다.

이 기술을 숙달하면 한 번의 분석에서 최대 6개의 실험 챔버까지 무리 없이 확장하여 적용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 반드시 합쳐진(confluential) ICAM 단층만을 사용하여 작업해야 한다는 점에 유의하십시오. 본 절차 이후, 획득한 이미지에 대해 세포 모양 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여 추가적인 의문점들을 해결할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 전단 응력 조건에서 세포 접착을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 영상을 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.