T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

이 분석의 전반적인 목표는 전단 응력 조건에서 세포 접착에 대한 관심 처리의 효과를 결정하는 것입니다. 이 방법은 인테그린 활성화를 매개하는 요인과 같은 면역 세포 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 접착 분자 인테그린 쌍을 쉽게 복제할 수 있는 흐름 시스템에서 연구할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 LFA1 활성화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 인테그린 연구에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 기술 설정을 정확하게 실행해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. CHO-ICAM 세포를 수확하려면 실온에서 1분 동안 부드럽게 흔들어 0.5%트립신 EDTA로 배양물을 처리합니다.

세포가 분리되기 시작하면 4ml의 새로운 배지로 트립신을 중화하고 해리된 세포의 수를 계산합니다. 세포를 챔버당 농도의 0.75배, 10배로 희석하고 원심분리기에서 스핀다운합니다. 다음으로, 완전한 CHO-ICAM 배양 배지에서 플로우 챔버당 30마이크로리터에 펠릿을 재현탁하고 플로우 챔버의 저장소당 30마이크로리터의 세포 분취액을 천천히 시딩합니다.

세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 5% 이산화탄소로 5분 동안 가라앉힙니다. 그런 다음 200마이크로리터의 완전한 배양 배지를 각 챔버의 두 저장소에 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 보내 야간 배양을 합니다. T 세포를 수확한 후, 세포 현탁액을 챔버당 농도의 2배 10에서 6번째 세포로 계수하고 희석합니다.

그런 다음 세포를 원심 분리하고 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁시키고, 10에서 6번째 T 세포의 2배당 1%포도당을 보충합니다. 다음으로, 실온에서 8분 동안 빛으로부터 보호되는 CFSE를 1-1000 희석하여 T 세포에 라벨을 붙입니다. 배양이 끝나면 세포를 원심분리하고 챔버당 240마이크로리터의 무혈청 RPMI 배지에 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 셀을 각 챔버당 하나의 1.5ml 튜브로 분할하고 로드할 때까지 튜브를 섭씨 37도의 열 블록에 보관합니다. 이미징하기 전에 현미경 라이브 이미징 챔버를 섭씨 37도까지 가열하고 500ml 유리병에 물을 채웁니다. 뚜껑에 in과 out이라고 표시된 두 개의 구멍을 만들고 입력 구멍을 통해 주사기 연결 입력 호스를 실행하고 출력 구멍을 통해 입력 저장소 연결 호스를 실행합니다.

60ml 주사기를 사용하여 60ml의 물로 입력 호스를 세척한 다음 60ml의 무혈청 섭씨 37도 매체를 사용하여 시스템에서 공기를 제거합니다. 호스가 프라이밍되면 전체 입력 설정을 현미경의 라이브 이미징 챔버로 전송하여 시스템을 섭씨 37도로 유지합니다. 챔버에서 호스와 주사기를 실행하고 주사기를 주사기 펌프에 로드합니다.

다음으로, 250ml 병의 뚜껑에 구멍을 뚫어 배출 폐기물 용기 역할을 하고 구멍을 통해 출력 튜브를 병에 넣습니다. 그런 다음 출력 병 뚜껑을 느슨하게 고정하고 전체 출력 설정을 라이브 이미징 챔버에 넣습니다. 이제 플로우 챔버 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 20X 대물렌즈를 사용하여 CHO ICAM 단층의 초점면을 설정합니다.

그런 다음, 자극되지 않은 대조군부터 시작하여 첫 번째 챔버의 출력 저장소에서 3개의 70마이크로리터 부피를 버리고 3개의 70마이크로리터 부피의 CFCS 표지 T 세포를 입력 저장소에 추가합니다. T cell이 inlet에서 outlet으로 이동하는 동안 각 챔버에서 CFSE 양성 T cell의 5개의 무작위 필드를 이미지화하여 사전 플로우 셀 수를 얻습니다. 다음으로, 입력 호스와 출력 호스를 동시에 흐름 챔버 저장소에 연결하고, 기포가 유입되지 않도록 주의하고, CFSC 염색된 T 세포를 계속 시각화하면서 분당 0.3ml로 전단 응력 흐름을 시작합니다.

T 세포의 움직임이 관찰되는 즉시 5분 동안 타이머를 시작하고 5분 기간이 끝나면 흐름을 종료합니다. 그런 다음 각 챔버에서 CFSE 양성 세포의 5개 필드를 이미지화하고 필드를 무작위로 선택하여 포스트 플로우 셀 수를 얻습니다. PMA 자극의 경우, 방금 시연된 바와 같이 이미징을 위해 T 세포를 두 번째 플로우 챔버에 로드하기 직전에 PMA로 T 세포의 한 튜브를 자극하여 양성 대조군 역할을 합니다.

SDF-1 알파 자극의 경우, 먼저 세 번째 챔버의 출력 저장소에서 70마이크로리터 분취량 3개를 제거한 다음 70마이크로리터의 SDF-1 알파를 입력 저장소로 추가합니다. 5분 후, output reservoir에서 70 microlit aliquots 3개를 버리고, 방금 시연한 바와 같이 이미징을 위해 나머지 T cell tube를 추가합니다. 이러한 대표적인 이미지에서, 유사한 수의 T 세포가 서로 다른 자극 조건 하에서 흐름 전에 관찰됩니다.

5분간 지속적인 전단 응력 가해지면 PMA 및 SDF-1 알파 자극 조건에서 부착 T 세포의 수가 증가하는 반면, 자극되지 않은 T 세포는 일부 부착 상태가 유지됩니다. 실제로, 예를 들어, SDF-1 알파 T 세포 활성화는 자극되지 않은 대조 세포에 비해 T 세포 접착력을 거의 2배 증가시킵니다. 또한, SDF-1 알파의 유무 하에서 일차 인간 CD3 양성 T 세포의 접착 비율을 계산했을 때, SDF-1 알파 활성화 조건 하에서 T 세포의 50%가 전단 응력 하에서 부착하는 것에 비해 자극되지 않은 T 세포의 15%가 부착됩니다.

일단 마스터하면 이 기술은 한 번의 분석에서 6개의 실험 챔버로 합리적으로 확장할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 confluential ICAM mono layer에서만 작업해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이 절차에 따라 캡처된 이미지에 대해 세포 모양 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 전단 응력 조건에서 세포 접착력을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 비디오를 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 행운을 빕니다.