인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

이 절차의 전반적인 목표는 인간 태반 조직 유래 중간엽 줄기 기질 세포를 분리하고 확장하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 호주 브리즈번의 Translational Research Institute 내 Queensland University of Technology의 그룹 리더인 Mike Doran입니다.

안녕하세요, 저는 퀸즐랜드 대학교 임상 연구 센터의 연구원 레베카 펠레카노스(Rebecca Pelekanos)입니다. 오늘은 MSC 분리 절차를 시연하겠습니다. 태반은 보통 출산 후 폐기됩니다.

조직의 무게가 5~700g에 달하기 때문에, 이는 동종 중간엽 줄기세포의 독특하게 거대한 공급원이 됩니다. 일반적으로 태반 MSC 분리를 처음 접하는 연구자들은 태반의 해부학적 구조에 익숙하지 않고, 조직 처리 방법이 생소하며, 최종 MSC 배양물에 모체 세포와 태아 세포 중 어떤 유형의 세포가 분포하게 될지 잘 모르기 때문에 어려움을 겪습니다. 연구자들을 돕기 위해, 본 영상에서는 이러한 중요한 세부 사항들을 논의합니다.

이 절차의 첫 번째 단계는 태반의 해부학적 구조를 파악하는 것입니다. 두 번째 단계는 가위를 사용하여 탈락막, 융모막 융모 또는 융모판에서 10 g의 조직을 수동으로 절제하는 것입니다. 처음 두 단계가 여기에서 다시 도식적으로 요약되어 있습니다.

세 번째 단계에서는 가위로 탈락막, 융모막 융모 또는 융모판 조직을 더 잘게 다집니다. 네 번째 단계에서는 dispase와 collagenase I을 이용해 1~2시간 동안 소화시켜 작은 조직 조각으로부터 세포를 분리합니다. 다섯 번째 단계에서는 셀 스트레이너(cell strainer)로 세척하여 섬유 조직으로부터 세포를 분리합니다. 그 후 세포를 수집하여 배양 배지에 재현탁한 뒤 배양 플라스크에 넣습니다.

중간엽 기질 세포(MSCs)는 플라스틱 부착 성향과 세포 배양 배지에서의 생존 및 증식 능력을 기준으로 선택됩니다. 마지막으로 결과 섹션에서 확장된 MSC의 특성을 분석하고 향후 실험에 사용할 수 있도록 보관합니다. 태반은 임신 기간 동안 태아와 모체 사이의 영양분 및 노폐물 교환을 가능하게 하는 일시적인 기관입니다.

태반은 제왕절개술과 아기의 안전한 출산 후에 무균적으로 쉽게 수집할 수 있습니다. 태반은 주로 태아 유래의 혈관과 막으로 구성되어 있습니다. 하지만 일부 모체 세포도 포함하고 있습니다.

태반은 모체 유래의 자궁 탈락막 세포와 태아 유래의 침습적 영양막 세포 모두에 의해 자궁과 연결됩니다. 일반적으로 모체 조직과 태아 조직 사이의 정확한 경계면을 육안으로 구별하는 것은 불가능합니다. 하지만 태반의 태아측은 탯줄이 위치한 쪽으로 쉽게 식별할 수 있습니다.

태아가 분만되면 탈락막 조직의 얇은 층만이 태반에 연결되어 남게 됩니다. 태반의 물리적 방향을 통해 오늘 채취할 세 가지 조직의 위치를 파악할 수 있습니다. 첫 번째로 채취할 조직은 모체 탈락막입니다.

초록색 마커는 태반이 자궁벽에서 탈락한 후 표면에 남아 있는 탈락막 조직을 가리킵니다. 태반 내부에서 채취할 두 번째 조직은 태아 융모막 융모입니다. 이는 도식의 파란색 원으로 표시되어 있습니다.

세 번째로 채취할 조직은 태아 융모판입니다. 이 조직은 도식의 빨간색 표시로 확인할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다.

태반을 생물학적 안전 작업대(biological safety cabinet)에 놓습니다. 태아막을 펼치고 태반의 각 부위의 위치를 확인합니다. 제대가 삽입된 태아 측, 융모양막(chorioamniotic laeve) 또는 양막을 확인하십시오.

태반의 태아면은 융모판에 뚜렷하고 큰 혈관들이 있으며, 그 위를 양막이 덮고 있는데 이 양막 또한 기계적으로 쉽게 분리됩니다. 모체면은 태아면의 반대쪽이며, 뚜렷한 태반엽 또는 엽들이 관찰됩니다. 모체면이 위를 향하도록 하십시오.

태반의 모체측 또는 탈락막에서 0.5 cm 두께로 조각을 절단합니다. 해부 과정 동안 조직 조각이 마르지 않도록 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)이 담긴 페트리 접시에 넣으십시오. HBSS가 담긴 접시에서 조직을 흔들어 혈액을 일부 제거합니다.

50 mL 튜브의 10 mL 표시선까지 채울 수 있을 만큼의 조직(약 10 g)을 옮깁니다. 참고로, 실험 종료 시 더 많은 세포가 필요한 경우에는 이 단계에서 더 많은 조직을 분리할 수 있습니다. 이때 태아면이 위를 향하도록 하십시오.

태반의 태아면에서 양막을 기계적으로 제거하고, 융모판은 그대로 둡니다. 융모판을 아래쪽 융모 조직으로 약 0.5 cm 깊이까지 절개하여 조각으로 자릅니다. 그런 다음, 융모판이 제거된 부위로부터 태반 내부로 약 1 cm 깊이까지 융모 조직을 박리합니다.

조직을 HBSS에 넣고 이전과 동일하게 조직 약 10 milliliters를 측정합니다. 액체 전이를 최소화하여 조직 조각들을 10 centimeter 페트리 접시에 옮긴 후, 가위로 약 1 cubic milliliter 크기의 미세한 조각으로 다집니다. 다져진 조직을 다시 50 mil 튜브로 옮깁니다.

나머지 모든 조직 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 조직과 최소 1:1 비율로 갓 준비한 소화 배지를 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다.

조직을 소화 배지가 들어 있는 튜브에 넣고, 진탕 인큐베이터에서 37 °C로 1~2시간 동안 배양합니다. 조직 소화액이 탁하게 변하고 용액 내에 흰색 혈관이 뚜렷하게 보이면, HBSS 15 mL를 첨가하여 소화 배지 내의 효소를 희석합니다. 샘플을 340 g에서 5초 동안 짧게 펄스 원심분리한 후 정지시킵니다.

이렇게 하면 커다란 부스러기들이 튜브 바닥에 모이게 됩니다. 샘플을 생물안전작업대(BSC)로 옮기십시오. 새로운 50 milliliter 튜브에 셀 스트레이너를 넣으십시오.

단핵세포가 포함된 상층액을 스트레이너에 피펫팅하여 용출액을 새 튜브에 받습니다. 태반 조직 잔해는 첫 번째 튜브에 남겨둡니다. 태반 잔해에 HBSS 15 milliliters를 추가하고, 세게 흔들어 더 많은 세포를 회수한 후 샘플을 펄스 원심분리합니다.

다시 한번 상층액을 수집 튜브 내의 세포 스트레이너가 들어 있는 튜브로 피펫팅합니다. 샘플의 점도에 따라 상층액을 세포 스트레이너에 붓는 방식이 더 적합할 수 있습니다. 세포 스트레이너를 5 milliliters의 HBSS로 세척합니다.

태반 조직 잔해물이 포함된 튜브를 폐기합니다. 상층액 샘플을 340 g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 적혈구는 펠렛 바닥의 층으로 관찰되며, MSC를 포함한 단핵구는 적혈구 위의 더 밝은 층으로 나타납니다.

샘플을 생물안전작업대(biological safety cabinet)로 옮깁니다. 상층액을 조심스럽게 따라내어 폐기합니다. 손가락으로 튜브를 여러 번 튕겨 세포 펠렛(cell pellet)을 떼어낸 후, 35 milliliters의 MSC 배지로 세포 펠렛을 재부유시킵니다.

조직 10 mil당 T175 플라스크 1개에 세포 현탁액을 옮기고, 5% CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다. 분리 후 48시간 뒤에 배양액을 교체합니다. 세포가 confluence 상태가 될 때까지 일주일에 한 번씩 배양액을 공급합니다.

배양 세포는 약 14일경에 합류(confluent)되어야 합니다. 마지막으로, 세포를 확장 및 동결 보존하고, MSC 특성을 분석한 후 실험에 사용합니다. 48시간의 배양 후, MSC는 조직 배양 플라스틱에 부착되지만, 조혈 세포 및 기타 세포군은 부착되지 않습니다.

이 시점에서 배지를 35 milliliters의 신선한 배양 배지로 교체합니다. 배양 상등액의 외관은 태반 기증자에 따라 상당히 다를 수 있습니다. 예시 1과 2에서 이러한 차이를 확인할 수 있습니다.

이 두 가지 분리 과정은 동시에 수행되었으나, 서로 다른 두 개의 태반에서 진행되었습니다. 세 번째 예시에서 보는 바와 같이, 세척 후의 배양물에는 적혈구와 조직 파편이 없으며, 이후의 확장 결과는 일반적으로 일관되게 나타납니다. 48시간 후 배지를 교체하면 플라스크에 소수의 세포만 부착되어 있습니다.

분리 7일 후면 섬유아세포 모양의 MSC 콜로니가 관찰되지만, 둥글거나 느슨하게 부착된 형태의 비-MSC 세포들도 함께 존재합니다. 분리 13일 후에는 섬유아세포 모양의 MSC 콜로니가 커지며, 흔히 MSC 단일층이 충분히 합쳐져 계대 배양할 수 있는 상태가 됩니다. 계대 배양 이후부터는 MSC 단일층이 세포 밀도가 높아짐에 따라 특징적인 소용돌이 모양의 형태를 띱니다.

태반 유래 MSC는 유세포 분석을 통해 전형적인 MSC 마커 프로필을 나타냅니다. 이 세포들은 CD73, CD105, CD90에 대해 양성을 보이며, 조혈 마커인 CD45, CD34, HLA-DR에 대해서는 음성을 보입니다. 태반 유래 MSC는 일반적으로 강력한 골분화를 거치지만, 지방분화 능력은 낮습니다.

많은 문헌에서는 태아 융모막에서 분리한 세포를 배양하면 태아 MSC를 얻을 수 있다고 가정합니다. 하지만 본 연구진이 이전에 보고했듯이, 이 프로토콜을 사용하여 태아 융모막에서 유래시킨 모든 배양물은 모체 탈락막 MSC 배양물에서 기대되는 바와 같이 빠르게 모체 MSC 위주로 농축됩니다. 여기에 제시된 데이터는 탈락막, 융모막 융모 및 융모막판 조직에서 분리한 태반 MSC 배양물의 태아 및 모체 세포 구성 비율을 정량화한 것입니다.

이 영상을 시청하신 후, 태반 조직에서 유래한 MSC를 분리하고 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 이러한 방법들이 태반 유래 MSC를 활용하는 귀하의 연구 및 임상 응용 분야에 유용하게 쓰이기를 바랍니다.