인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

이 절차의 전반적인 목표는 인간 태반 조직에서 유래한 중간엽 줄기 기질 세포를 분리하고 확장하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 마이크 도란입니다. 저는 호주 브리즈번에 있는 Queensland University of Technology의 Translational Research Institute에서 그룹 리더입니다.

안녕하세요, 제 이름은 레베카 펠레카노스(Rebecca Pelekanos)이고, 퀸즐랜드 대학교 임상연구센터(University of Queensland Center for Clinical Research)의 연구원입니다. 오늘은 MSC 분리 절차를 시연해 드리겠습니다. 태반은 일반적으로 출생 후 버려집니다.

조직의 무게가 5-700g이기 때문에 동종 중간엽 줄기 세포의 독창적으로 큰 공급원을 제공합니다. 일반적으로 태반 MSC 분리를 처음 접하는 사람들은 태반 해부학적 구조와 조직 처리 방법에 익숙하지 않고 최종 MSC 배양에 어떤 유형의 세포가 모체 또는 태아를 형성할지 잘 모르기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 연구자를 돕기 위해 이 비디오에서 이러한 중요한 세부 사항에 대해 논의합니다.

이 절차의 첫 번째 단계는 태반 해부학적 구조로 방향을 잡는 것입니다. 이 절차의 두 번째 단계는 가위를 사용하여 십이판, 융모막 융모 또는 융모판에서 조직 10g을 수동으로 해부하는 것입니다. 처음 두 단계는 여기에 다시 개략적으로 요약되어 있습니다.

3단계에서는 십이, 융모막 융모 또는 융모막 판 조직을 가위로 미세한 조각으로 더 다집니다. 4단계에서는 디스페이아제(dispase)와 콜라겐분해효소(collagenase)에서 1-2시간 동안 소화를 통해 세포를 작은 조직 조각에서 분리 I.In 5단계에서는 세포 여과기를 통해 세포를 세척하여 섬유 조직에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 세포를 수집하여 배양 배지에 재현탁하고 배양 플라스크에 넣습니다.

중간엽 기질 세포(MSC)는 플라스틱 부착 성향과 세포 배양 배지에서 생존 및 증식 능력에 따라 선택됩니다. 마지막으로, 결과 섹션에서는 향후 실험에 사용하기 위해 확장된 MSC를 특성화하고 저장할 수 있습니다. 태반은 임신 중 태아와 산모 사이에 영양분과 노폐물을 교환할 수 있는 임시 기관이다.

태반은 제왕절개와 아기의 안전한 출산 후에 무균으로 쉽게 채취할 수 있습니다. 태반은 주로 태아에서 유래한 혈관 구조와 막으로 구성되어 있습니다. 그러나 일부 모계 세포도 포함되어 있습니다.

태반은 모계, 자궁에서 유래한 탈피 세포와 태아에서 유래한 침입 영양막(trophoblast)에 의해 자궁에 연결되어 있습니다. 일반적으로 모체 조직과 태아 조직 사이의 정확한 계면을 눈으로 구별하는 것은 불가능합니다. 그러나 태반의 태아 쪽은 탯줄이 위치한 쪽으로 쉽게 식별됩니다.

아기가 태아를 낳을 때, 태반에는 얇은 조직층만이 연결되어 있다. 태반의 물리적 방향을 통해 오늘 우리가 수확 할 세 가지 조직을 찾을 수 있습니다. 첫 번째로 수확되는 조직은 모계 데시두아입니다.

녹색 마커는 태반이 자궁벽에서 벗겨진 후 표면에 남아 있는 탈피 조직을 가리킵니다. 태반 내부에서 채취되는 두 번째 조직은 태아 융모막입니다. 이것은 다이어그램에서 파란색 원으로 표시됩니다.

세 번째로 채취할 조직은 태아 융모판 판입니다. 이 조직은 다이어그램의 빨간색 마커로 식별됩니다. 자, 시작하겠습니다.

태반을 생물학적 안전 캐비닛에 넣습니다. 태아의 막을 열고 태반의 각 부분과 함께 방향을 잡는다. 탯줄 삽입이 있는 태아 쪽, 융모양수 laeve 또는 양수낭.

태반의 태아 표면은 융모막판에 명백히 큰 혈관을 가지고 있으며, 그 위에는 양막이 있으며, 이 혈관은 다시 기계적으로 쉽게 분리됩니다. 모계 쪽은 태아 쪽의 반대편에 있으며 명백한 자엽 또는 엽이 있습니다. 모계 표면이 위를 향하도록 합니다.

태반 또는 decidua의 모계 쪽에서 0.5cm 두께의 조각을 자릅니다. 해부하는 동안 조직 조각을 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)이 들어 있는 페트리 접시에 넣어 조직을 적시게 유지합니다. HBSS로 접시의 조직을 교반하여 혈액을 제거합니다.

50 밀리리터 튜브의 10 밀리리터 표시까지 튜브를 채울 수 있도록 충분한 조직을 이동시키며, 약 10 그램을 운반합니다. 절차가 끝날 때 더 많은 세포가 필요한 경우 이 단계에서 더 많은 조직을 분리할 수 있습니다. 태아 표면이 위를 향하도록 하십시오.

태반의 태아 표면에서 양막을 기계적으로 제거하고 융모판은 그대로 둡니다. 융모막판을 아래의 융모 조직에 약 1/2cm 깊이의 스트립으로 자릅니다. 그런 다음 융모판이 제거된 태반으로 약 1cm 깊이의 융모막 조직을 절개합니다.

조직을 HBSS에 넣고 이전에 했던 것처럼 약 10ml의 조직을 측정합니다. 최소한의 액체 이동으로 조직 조각을 10cm 페트리 접시에 옮기고 가위로 약 1입방 밀리리터의 미세한 조각으로 자릅니다. 다진 조직을 50mil 튜브로 다시 옮깁니다.

나머지 모든 조직 샘플에 대해 반복합니다. 갓 준비된 다이제스트 미디어를 조직과 최소 1:1 비율로 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다.

튜브의 조직을 진탕 인큐베이터에서 37도에서 1-2시간 동안 다이제스트 매체로 배양합니다. 조직 분해액이 흐린 모습으로 바뀌고 용액에서 흰색 혈관이 분명한 경우 HBSS 15ml를 첨가하여 소화 매체의 효소를 희석합니다. 원심분리기가 340g에 도달할 때까지만 샘플을 5초 동안 짧게 펄스 원심분리한 다음 멈춥니다.

이렇게 하면 큰 파편이 튜브 바닥에 모이게 됩니다. 시료를 생물 안전 작업대에 회수합니다. 셀 스트레이너를 새 50ml 튜브에 넣습니다.

단핵 세포를 포함하는 상등액을 여과기에 피펫팅하여 새 튜브에서 용리액을 포착합니다. 태반 조직 파편은 첫 번째 튜브에 남겨둡니다. 태반 파편에 HBSS 15ml를 첨가하고 더 많은 세포를 회수하기 위해 세게 흔든 다음 샘플을 펄스 원심분리합니다.

다시 한 번, 채취 튜브의 세포 여과기를 사용하여 상등액을 튜브에 피펫으로 넣습니다. 상층액을 세포 여과기에 붓는 것은 샘플의 일관성에 따라 더 적합할 수 있습니다. HBSS 5ml로 세포 여과기를 세척합니다.

태반 조직 파편이 들어 있는 튜브를 버립니다. 상층액 시료를 340g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 적혈구는 펠릿 바닥의 층으로 볼 수 있으며 MSC를 포함한 단핵 세포는 적혈구 상단의 더 가벼운 층입니다.

시료를 생물 안전 작업대에 회수합니다. 상층액을 조심스럽게 기울이고 버리십시오. 손가락으로 튜브를 여러 번 튕겨 세포 펠릿을 제거하고 세포 펠릿을 35ml의 MSC 배지에 재현탁합니다.

세포 현탁액을 조직 10mils당 T175 플라스크 1개로 옮기고 5%CO2가 함유된 37도 인큐베이터에서 배양합니다. 분리 후 48시간 후에 배양 배지를 교체하십시오. 합류할 때까지 일주일에 한 번 배양물을 공급하십시오.

문화권은 약 14일 정도 융합되어야 합니다. 마지막으로, 세포를 확장 및 동결 보존하고, MSC 특성을 분석하고, 실험에 사용합니다. 48시간의 배양 후 MSC는 조직 배양 플라스틱에 부착되지만 조혈 및 기타 세포 집단은 부착되지 않습니다.

이때, 배지는 35 밀리리터의 신선한 배양 배지로 대체된다. 배양 상등액의 모양은 태반 기증자에 따라 크게 다를 수 있습니다. 예제 1과 2는 이러한 변형을 보여 줍니다.

이 두 가지 분리는 동시에 수행되었지만 두 개의 다른 태반에서 수행되었습니다. 일단 세척되면 배양액에는 실시예 3과 같이 적혈구 및 조직 파편이 제거되며 후속 확장 결과는 일반적으로 일치합니다. 48시간 배지 교체 후 플라스크에는 몇 개의 세포만 부착됩니다.

분리 7일 후, 섬유아세포 MSC 콜로니가 보이지만, MSC가 아닌 세포도 둥글거나 느슨하게 부착된 세포로 존재합니다.분리 13일 후, 섬유아세포 MSC 콜로니가 커지며, MSC의 단층이 충분히 융합되어 배양 준비가 된 경우가 많습니다. 통과에서 이후로, MSC 단층은 합류 지점에서 특징적인 소용돌이와 같은 형태를 발달시킵니다.

태반 MSC는 유세포 분석을 통해 고전적인 MSC 마커 프로파일을 표시합니다. 이 세포는 CD73, CD105 및 CD90에 대해 양성이고 CD45, CD34 및 HLA-DR의 조혈 마커에 대해 음성입니다. 태반 MSC는 일반적으로 강력한 골형성 분화를 겪지만 지방형성 분화는 좋지 않습니다.

많은 간행물에서는 태아 융모막에서 분리된 세포가 배양 시 태아 MSC를 산출한다고 가정합니다. 그러나 이전에 보고한 바와 같이 이 프로토콜을 사용하여 태아 융모에서 파생된 모든 배양은 모계 MSC 배양에서 예상되는 것처럼 모계 MSC에 대해 빠르게 농축됩니다. 여기에 표시된 데이터는 데시잔류, 융모막 융모 및 융모판 조직에서 분리된 태반 MSC 배양의 태아 및 모체 세포 구성을 정량화합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 태반 조직에서 유래한 MSC를 분리하고 배양하는 방법에 대해 꽤 잘 알게 되었을 것입니다. 이러한 방법이 태반 유래 MSC를 사용할 수 있는 연구 및 임상 응용 분야에 유용하기를 바랍니다.