Name: 인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 배우세요 인간 태반 조직에서 중간 엽 줄기/기질 세포를 분리하고 확장하는 방법을. 수동 절제와 효소 소화를 통해 MSC를 분리하고 배양하여 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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RP는 국립 보건 의료 연구위원회 (NHMRC) 박사후 연수 원정대에 의해 지원되었다. VS는 대학 퀸즐랜드 국제 대학원 학생의 장학금으로 지원되었다. MRD는 NHMRC 및 내부 휠 호주에 의해 지원되었다. 우리는 환자의 동의 및 샘플 컬렉션 지원에 대한 임상 간호 직원을 감사드립니다. 우리는 산부인과에서 통찰력 토론, 태아 - 태반 개발 및 태반 해부학에 대한 교수 Nickolas 피스크 교수 케리 앳킨슨 박사 로한 Lourie 감사합니다.

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태반은 태아 또는 모체 MSC 22을 분리 할 수있는 것을 말하고, 물리적으로 대형 기관이다. 여기서, 우리는 구체적으로 탈락 (임산부), 융모막 융모 (태아)와 융모 판 (태아) 조직 (2.2-2.4 단계) 해부하는 방법에 대한 태반 해부학과 명령의 자세한 개요를 제공했다. 다음으로, 우리는 이들 세 조직 (2.5-2.6 단계) 각각으로부터 MSC 분리 가능 강력한 프로토콜을 설명했다. 태반 MSC 확장은 효율적이고 배양 골수 - 유래 MSC 배양 (도 3 및도 4)과 유사한 나타난다. 지방 세포 분화는 일반적으로 (그림 5C) 5 비효율적 동안 골 형성 분화는 (그림 5B) 신뢰할 수있다. 분야에 많은 신규 이민자는 태아의 융모막 융모 또는 융모 판 조직에서 파생 된 문화가 태아 MSC에 대한 풍부한 될 것으로 추정됩니다. 그러나, 우리의 손에 철탈 세포 농축는 일시적인 경우 등 DMEM-LG + 표준 MSC 확장 FBS 배지 5를 이용 10 %. 여기에서 우리는 남자 아기에서 파생 된 태반 조직을 사용하는 대표적인 결과를 제공합니다. 모체 세포 XX 염색체를 갖는 것으로 식별하는 동안 수형 아기의 태반 조직을 사용하여 태아 세포는 용이하게 특정 가능 XY 염색체를 갖는 것으로한다.도 6은 대표적인 배양 XY 물고기 결과를 나타낸다. 태아 MSC (XY)이 태아 융모 또는 융모 판 조직 유래 초기 배양에서 (최대 80 %) 농축되어 있지만,이 같은 문화 신속 처음 두 통로 위에 (~ 100 %) 모체 그래피 (XX) MSC 뽑힌되고 . 표준 매체에서, DMEM-LG + 10 % FBS, 태아 조직 문화의 태아 유래 세포를 outcompete 오염 몇 산모의 유래 MSC로 구성. 이 프로토콜에 설명 된 중요한 단계는 태반 해부학 어디 태아에서 감사입니다산모 조직을 가장 효과적으로 수확 할 수있다. 대표적인 결과 섹션에 설명 된대로, 태아 조직의 박리는 태아 유래 MSC에 대한 과도 농축을 가능하게 않습니다. 확장 배지 제형 개선은 특정 외인성 성장 인자 배지 보충으로 태아 유래 MSC 인구의 선택적 확장을 허용하고, (우리 그룹은 이러한 매체 제형을 개발하고있다) 태아보다는 모체 세포 충실 셀 제품을 제조한다. 태아 MSC가 큰 혈관 및 등가 모체 MSC 인구 (37)보다 면역 억제 특성을 갖는 것으로 추정 된대로 태아 MSC 집단의 제조는 다수의 장점을 가질 수있다. 상술 분리 각 프로토콜에서는 조직의 약 10g을 사용 하였다. 전체 태반은 일반적으로 500~750g이며, 이전의 연구에서 우리는 증명이 자동화 된 조직 다이제스트 및 셀 확장 생물 반응기 시저를 통해이 가능해야 esses 번의 태반 4에서 7,000 세포 임상 용량을 제조한다. 이 숫자에 관계없이 (태아 나 산모) MSC 기원 태반 유래 동종 MSC 치료에 MSC,이 방법의 중요성의 잠재적 인 적합성을 강조 표시합니다. 치료 적 관점에서, 사용자가 휴대 제품 신뢰성이 셀 제품을 제조 할 수있는 능력의 완전한 이해하는 것이 가장 중요하다. 우리는 우리의 비디오, 태반 해부학을 이해 태반에서 MSC를 분리, 그들의 문화의 가능성이 태아 나 모체 세포 조성물을 예상하는 연구자 도움이되기를 바랍니다.

중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)는 세포 기반 치료 (1)에서의 사용을위한 유망한 후보로 부상하고있다. 대부분의 응용 프로그램은 MSC 매개 조직 복구 또는 면역 조절 (2)을 대상으로 나타납니다. 이러한 응용 프로그램의 많은에서는 동종 MSC는자가 MSC 3만큼 효과적 일 수있다. 동종 MSC의 사용은 많은 환자를 치료하기위한 단일 소스 조직 (4)로부터 복수의 셀 용량의 대규모 제조와 호환되는 경제적 인 이점을 갖는다. 역사적으로, 전임상 및 임상 연구는 골수 (4)로부터 MSC가 유래 이용했다. 골수는 일반적으로 자원 봉사 기증자의 장골에서 수집됩니다. 이 과정은 침습적이고, 골 (~ 20 ㎖)의 단지 소량의 단일 구멍을 통해 수집된다. MSC의 임상 적으로 의미있는 숫자를 생성하는 체외 확장에 광범위한 필요합니다. 세포 효능 통로 수 감소 <sup&gt; (3), 임상 적 효능에 필요한 세포의 이론적 개수가 더 많은 세포 집단이 팽창 증가 역설 작성. 골수 흡인과는 대조적으로, 용어의 태반은 기증자에 대한 위험없이 제왕 절개 수술시 무균 수확 할 수있는 물리적으로 큰 시작 조직 (일반적으로 5백~7백50g 4)이다. 태반 유래의 MSC는 골수 - 유래 MSC 우수한 장기간 증식 5 및 면역 조절 용량 (6)을 갖는다. 이전의 연구는 단일 용어 태반 최대 7000 임상 용량 (4)의 제조를 위해 충분한 MSC를 함유하는 것으로 보였다. 이러한 특성은 동종 MSC의 제조를위한 이상적인 소스 태반 조직을 만든다. 태반은, 이론적으로 고립 될 수 있습니다 태아 나 산모의 기원의 것을 말하고, 모두 태아와 산모의 조직 (7)로 구성된 기관, 따라서 MSC이다. 다음 참조 드를 제공개발 및 병리에 꼬리 정보뿐만 아니라, 인간 태반 부속기 8,9 현미경 및 육안 검사. 태반은 적절한 융모막의 frondosum (판) (8)에 의해 덮여 융모막 융모를 구성하는, 주로 태아의 혈관과 분비 및 trophoblasts라고지지 세포로 구성되어 있습니다. 지형 태반 융모는 영양, 호르몬 및 태아와 어머니 사이의 가스 교환을 가능하게 자궁 나선형 동맥에서 전달 된 산모의 혈액에서 목욕을하고 있습니다. 태반은 산모의 탈락 기질 세포와 태아 extravillious trophoblasts를 통해 자궁 내막에 고정되어이 세포 외 기질 (8)에 산재되어있다. 융모는 탯줄 (8)을 형성하는 태아의 융모 판에 수렴. 태반 - 유래 줄기 세포에 대한 최초의 국제 워크샵의 결과 (2008)을 분리 및 characterizatio 표준화 필요성의 하락했다인간의 장기 태반 (10)에서 세포의 N. 때문에 태반의 해부학의, 다른 조직의 절개는 MSC의 분리 및 예상 배양 결과는 필드 이민자를위한 압도 할 수있다. 이 프로토콜에서, MSC 분리 및 확장 뒤에 태반 융모 조직의 수확은 철저하게 자세히 설명되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 체외 분화 MSC 특성화 일상 5,11-13 간주하고, 따라서 간략 여기에 자세히 설명되어 있습니다. 최근의 체계적 문헌 고찰 (14)에서 강조 바와 같이, MSC는 태반의 융모막 융모는 일반적으로 태아로 가정에서 얻을. 하지만, 연구의 18 %를 수득 한 MSC의 출처를 조사하고, 그 중, 연구의 절반 태아 MSC 나머지 절반은 모체 또는 혼합 MSC 집단보고를보고 하였다. 본 명세서에 설명 된 세 가지 조직 각 구성 요소 (융모, 융모 접시 탈락 basalis)는 완있다주로 태아 막 / 융모 및 전달 태반에 부착 된 상태를 유지 자궁 모체 유래 세포의 소량의 osed. 우리는 데이터를 모체 MSC 싶은 경우는 우리가 이전 5,11보고 한 바와 같이, 태반의 모체 측보다는 태반 태아 측으로부터 MSC 분리,보다 적절한 출발 물질임을 증명 제공한다. 이 프로토콜은 또한 세포 배양에 태아 나 산모의 기여를 검증하는 XY 생선의 사용을 설명합니다. 이 제조 업체에서 표준 프로토콜 인 반면,이 분석은 종종 무시하고 그 중요성 14을 과소 평가한다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>긴 이름: Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>긴 이름: Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>trypsin-substitute</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>긴 이름: TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>긴 이름: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-Low Glucose</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>긴 이름: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-High Glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>PBS (Mg+Ca+ free)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>긴 이름: Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 마그네슘 및 칼슘 무료</td></tr><tr><td>항-항-</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>긴 이름: 항생제-항진균 용액 x100</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 분말 또는 4% 용액</td><td>any&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 I</td><td>인비트로젠</td><td>17100-017&nbsp;</td><td>2,500U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml in&nbsp; 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp;</td><td>물 (20,000 U/ml)에 있는 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Disposables:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심 분리기 관</td><td>Falcon 또는 모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr>의 <tr><td>페트리 접시, 멸균 plactic (직경 25cm 및 10cm)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너(100 &mu; m)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 및 75 cm < > 2 (T175 및 T75) 조직 배양 플라스크</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml 멸균 혈청 피펫</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Material</td> <td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td>코멘트 </td></tr><tr><td>장비:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 원심분리기&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 조직 배양 인큐베이터 37 &DEG; C, 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물학적 안전 캐비닛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 멸균 가위와 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜브 랙&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-boy 또는 이에 상응하는</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson 유형 피펫 및 멸균 팁 1,000 &micro; l, 200 &마이크로; l, 20 &마이크로;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흔들리거나 흔드는 인큐베이터(37 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>개인 보호 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세척 용액 (혈액에 적합)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>폐기물 용기, MSC 특성화를위한 조직 / 혈액</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< 강> 시약< / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< 강> 항체 (클론 ID) < / 강></td><td>제조사</td><td>카탈로그 번호 </td><td>Isotype</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>마우스 IgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>마우스 IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>마우스 IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>마우스 IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>마우스 IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>마우스 IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>마우스 IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>마우스 IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>마우스 IgG1</td></tr><tr><td>Isotype 컨트롤 (클론 ID)</td><td>Manufacturer</td><td>카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td> 마우스 IgG1 Isotype (IS5-21F5)Miltenyi Biotec 130-092-212 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG1 아이소타입 (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>MACS 버퍼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Oostogenic differentation</td><td>Manufacturer</td><td>카탈로그 No.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>긴 이름: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-High Glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>긴 이름: Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>Anti- anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>긴 이름: 항생제-항진균 용액 x100</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerol Phophate</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산 2-인산</td><td>시그마</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>알리자린 레드 S</td><td>시그마</td><td>A5533-25G</td><td>칼슘 매트릭스 염색</td></tr><tr><td>용Adipogenic differentation</td><td>Manufacturer</td><td>Catalogue No.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>긴 이름: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-High Glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>긴 이름: Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>Anti- anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>긴 이름: 항생제-항진균 용액 x100</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methyl xanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O 용액</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td> 세포의 태아 또는 모계 기원을 결정하기 위한 <td>지질 액포 염색</td></tr><tr><td>XY FISH 키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY chomosome FISH 키트</td><td>Vysis(Abbott 분자)</td><td>07J20-050</td><td>긴 이름 : CEP X SpectrumOrange / Y SpectrumGreen 직접 표지 형광 DNA 프로브 키트</td></tr></tbody></table>

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

중간엽 줄기세포/기질세포(MSC)는 세포 기반 치료에 사용할 수 있는 유망한 후보입니다. 대부분의 경우, 치료 반응은 세포 용량에 의존하는 것으로 보입니다. 인간에서 사용하는 태반(placenta)은 MSC가 풍부하며 일반적으로 출생 후 버려지는 신체적으로 큰 조직입니다. 태반은 동종 MSC의 다중 세포 용량의 대규모 제조에 이상적인 출발 물질입니다. 태반은 태아 또는 모계 조직을 분리할 수 있는 태아 기관입니다. 이 기사에서는 태반의 해부학적 구조와 decidua(모체), 융모막(태아) 및 융모판(태아) 조직을 분리하는 절차에 대해 설명합니다. 그런 다음 이 프로토콜은 절개된 각 조직 영역에서 MSC를 분리하는 방법을 설명하고 각 조직 유형에서 파생된 확장된 MSC의 대표적인 분석을 제공합니다. 이러한 방법은 전임상 MSC 분리를 위한 것이지만 인간 치료용 태반 MSC의 임상 제조에도 적용되었습니다.

태반 MSC 분리 절차는 MSC가 고립되었던 태반 해부학의 세 가지 영역이 다음은 산모의 탈락뿐만 아니라 융모 판과 융모막 융모의 대부분 태아 조직입니다 그림 2에 강조 표시됩니다 그림 1에 요약되어있다. 많은 교과서, 기사 및 온라인 리소스 세부 개발 및 다양한 태반 조직의 기능적 역할은 (참조 8 참조). 48 시간 분리 및 조직 파편의 제거 후 배양 형태. 적혈구 및 대부분의 다른 세포 파편이 첨부되지 않습니다 동안 문화의 48 시간 후, 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착 된 것입니다. 이때, 배지는 신선한 배지 35 ㎖로 교체되어야한다. 이 배지 교환하기에 앞서 때문에 정확한 관찰을하기 어렵다시각적 평가를 방해 할 적혈구 많은 수의. 배양 상등액의 모양은 태반 기증자 사이에 실질적으로 다를 수 있습니다. 본 변형 예 1 및 2 (도 3a)에 시각적으로 볼 수있다. 매우 다르게 나타나 두 MSC 아이솔레이션은 두 가지 태반에서 동시에 수행 하였다. 그러나, 한번 세정 모두 배양 (세정 실시 예 3,도 3a 참조)와 유사한 나타났다. 현미경 하에서 48 시간 배지 교환 후, 몇 셀 플라스크 (도 3b)에 연결되며, 상기 세포를 더욱 광범위하게 전개 엽 줄기 세포에서 유의 한 차이가 나타날 것이다. 일부 파편과 적혈구 부동 또는 부착 덩어리로 볼 수 이러한는 중간 엽 줄기 세포의 성장을 방해하지 않습니다. 플라스크의 바닥에 부착 된 긴 섬유 아세포 세포가 MSC, 조혈 세포를 포함한 혼​​합 될 가능성융모 또는 내피 세포. 또, 비 MSC 세포는 이들 세포는 일반적으로 MSC 배양 조건에서보다 1-2 통로 살아남 같이, MSC 배양을 손상하지 않는다. 배양 초기 모양의 일부 변동에도 불구하고, 후속 팽창 결과는 일반적으로 일치한다. 시간이 지남에 MSC 문화의 형태. 비 MSC 세포는 원형으로 볼 수있다 또는 느슨하게 연결된 세포 (그림 4A)가. 첨부 된 세포가 원래 형성 &quot;식민지 장치라고 있었는지되지만이 대표적인 예에서, 분리 다음 칠일은 작은 섬유 모세포 MSC 식민지는 볼 수 있었다 나중에 -fibroblast &quot;(CFU-F) (17)와 MSC (18)라고합니다. 열세 일 격리 다음, 섬유 모세포 MSC 식민지가 큰 (그림 4B)이었다. 일반적으로, 단일 층이 시점에서 80-90% 합류되며 세포 파샤되어야<html> 검정 고시. 통로 (2) 이후부터, 태반 MSC 단일 층이 합류 (그림 4C)의 특성 소용돌이 모양의 형태를 개발합니다. 세포를 낮은 밀도로 계대 않는 한, CFU-F 형성은 더 이상 관찰되지 않을 것이다. 낮은 밀도에서, 태반 유래 MSC는 성인 골수 유래 MSC 1보다 작은, 사각형 모양을 가지고있다. 태반 유래 MSC와 골수 유래 MSC 유사한 증식 속도를 나타내는 반면, 태반 - 유래 세포는 급속 노화 5 이하 쉽다. 체외에서 태반 MSC의 특성. 각 확장 세포 집단은 (1) 플라스틱 접착 (2) 중간 엽 표면 마커의 존재 및 조혈 표면 마커의 부재 및 중배엽를 받아야하기 (3)의 용량을 포함하여 표준 MSC 기준 (16)에 부합하도록있어서해야 분화. &quot;fo를 : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; 태반 중간 엽 줄기 세포는 플라스틱 접착 있습니다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 중간 엽 줄기 세포의 배양은 접착 수지이며 섬유 아세포와 같은 형태를 가지고; 이 세포가 MSC (16)를 정의하는 첫 번째 기준을 충족하는지 확인합니다. 태반 MSC 디스플레이 중간 엽 표면 마커. 두 번째 정의 MSC 특성 간엽 표면 마커의 존재 및 조혈 표면 마커 (16)의 부재이다. 결정적은 MSC를 식별 할 수있는 단일 마커가 없기 때문에, 마커의 패널은 일반적 아니라 조혈 간엽있는 셀을 식별하기 위해 유세포 분석과 관련하여 이용된다. 여기에 제공된 대표 데이터 세트에서 (그림 5A), 우리는 중간 엽 마커 CD73, CD105, CD90, CD146, 및 CD44, 조혈 마커 CD45 및 CD34 및 HLA-DR, 아 등의 세포 발현을 평가내피 마커 CD31와 같은 리터. 이 태반 MSC 특성화 과정에 사용되는 항체의 모든 재료 / 장비의 표에 나열되어 있습니다. (가) 여기에 19 설명 분석 방법으로, 지침을 제조 따라 염색을 실시 하였다. 5,20 예상대로 세포, 중간 엽 마커 CD73, CD105, CD44, 및 세포 표면 마커 CD45, CD34, HLA-DR 및 CD31 양성 부정적이었다. 약 37 %와 우리의 대표 데이터 세트에서 세포의 57 %는 각각 CD90와 CD146 (21)에 대한 긍정적이었다. CD90 및 CD146 모두 일반적으로 MSC (21)는 마커 이용된다. MSC 세포 표면 마커 정보는 MSC 조직 소스, 중간 조성물 또는 통로 번호 (22)에 따라 다를 수있다. 경험 다년간에서는 1-2 P하기 비 중간 엽 세포, 태반 - 유래 MSC 장기 오염이 관찰되지 않은assages 5,11. 태반 MSC 디스플레이 중간 엽 분화 가능성 정의에 의하면, MSC는 체외 중배엽 분화 능력 5,13을 가지고 있어야합니다. 중배엽 분화 잠재력은 일반적으로 트리 또는 이중 혈통 차별화 분석 중 하나를 통해 평가된다. 트라이 혈통 분석이 추가로 연골 분화 능력을 평가하는 동안 바이 계보 분석은 일반적으로 골 형성 및 지방 세포 분화 능력을 평가합니다. 여기에 제시된 대표적인 결과에서, 우리는 확장 된 MSC 인구가 두 골 형성 분화를 나타내는 칼슘 예금 및 지질 공포, 지방 조직을 나타내는 (그림 5B)를 형성 것을 보여준다. 여기에보고 된 MSC 집단을 특성화하기 위해 유도 배지 1 ㎖를 6 × 104 세포로 24 웰 배양으로 세포를 시딩. 중간 콤포넌트넌트는 재료 / 장비의 표에 나열되어 있습니다. 유도 매체 제제는 문헌에서 공통적 인 반면, 출판 제제에 상당한 변화가있다. 이러한 이유로 우리는 간단히 여기에 우리의 유도 매체 제제와 염색 방법을 나열합니다. 골 형성 유도 배지는 DMEM-HG 10 % FBS, 1X 항생제 항진균제 용액 된 10 mM β-글리세롤 한 인산, 100 나노 덱사메타손, 50 μM L- 아스 코르 빈산 -2- 인산을 함유 하였다. 지방 세포 유도 배지는 DMEM-HG 10 % FBS, 1X 항생제 항진균제 용액 10 μg의 / ㎖ 인슐린, 덱사메타손 100 나노 미터, 200 μM 인도 메타 신 (indomethacin), 500 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 산틴을 함유 하였다. 여기서 문화는 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 유지되고 14 일 동안 배양 하였다. 유도 매체는 배양 기간 동안 두 번 일주일 교환했다. 유도 14 일 후, 문화는 우리의 이전에 따라 뼈 같은 매트릭스 (골 형성) 또는 지질 액포 (지방 조직) 중 하나를 위해 특성화되었다빚을내는 게시 5. 조골 칼슘 매트릭스 증착 분석 먼저, 배지를 흡인을 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 문화를 정착, DPBS로 단층을 세척 한 다음 지시를 제조에있어서, 알리자린 레드 S 염색에 의해 달성 하였다. 지방 세포 유도는이 지침을 제조에 따른 오일 레드 O 솔루션, 매체를 흡입 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 문화를 고정, 단일 층을 세척하고, 염색으로 평가 하였다. 스테인드 칼슘 예금과 석유 공포 후 광학 현미경으로 시각화 및 이미지는 나중에 참조 할 수 있도록 저장되었습니다. 이전의 출판물에서, 우리는 더 광범위 4,5 태반 유래 MSC의 분화 잠재력을 특징으로하고있다. 지방 조직은 태반 유래 MSC 5 일반적으로 덜 효율적인 동안 태반 유래 MSC의 골 형성은 &lt;, 골수 유래 MSC와 유사하다/ SUP&gt;. 이 이전에 태반-MSC (5) 우리가보고되어 있지만 우리는 정기적으로, 여러 가지 이유로 연골 분화를 수행하지 않습니다. 중배엽 분화 능력은 MSC의 특성을 정의하면서 먼저, 상기 치료 효과가 분비 분비물 MSC (26)로부터 유래 될 가능성이 특히 여기서, 이차적 23-25 ​​쉽다. Dominici는 등. 인간의 성인 골수 유래 MSC 16의 임상 적 생산을위한 최소한의 기준을 제시하지만, 다른 틈새 시장이 서로 다른 고유의 특성과 분화 능력 5,13,27-32가에서 두 번째로, 최근 연구는 MSC를 나타냅니다. 실제로는 Parolini 외. 태반 유래 MSC &quot;은 하나 이상의 중배엽&quot;계통이 아닌 세 개의 계통 ​​(10)으로 분화하도록 제안 하였다. 이는 유사한 통해 발생 마지막으로, 다수의 MSC 연구는 연골 분화를 제외골 형성 등의 세포 내 신호 전달 경로 (TGFβ 가족 경로) 33-35. 태반 MSC는 출발 물질의 해부학 적 위치에도 불구하고,이 배양 방법을 이용하여 모체 기원이다. 대부분의 출판물은 세포 배양 14시 태아의 융모막 수율 태아 MSC에서 분리 된 것으로 가정합니다. 우리가 이전에 5보고 그러나, 모든 문화는 빠르게 직관적으로 산모의 탈락 MSC 문화에 대해 예상되는 바와 같이 산모의 MSC에 대한 풍부한 될이 프로토콜을 사용하여 태아의 융모막에서 유래. 쉽게 확장 된 세포 집단에서 태아와 모체 세포 기여를 묘사 할 수 있었다 있도록 이러한 대표적인 결과에서 우리는 남자 아기의 태반 조직을 사용했다. 이러한 연구를 위해 우리는 자재 / 장비의 표에 나와있는 XY 생선 키트를 사용하고, 제조 업체의 지침을 따랐다. (그림 6) . 통로 (2)에 의해, 모체 조직으로부터 유래 된 세포 집단은 (XX) ~ 100 % 모체 세포이었고, 태아 세포 (XY)이 탐지되었다. 이것은 모성 조직의 물리적 해부 후속 문화의 모체 세포의 농축되었다 제안합니다. 그러나, 태아 융모 융모막 판 유래 배양에서 배양 결과를 고려하는 것이 중요하다. 통로 0에서 태아의 융모막 융모 융모막 두 판 파생 된 문화 타겟 절개 태아 세포 (그림 6)에 대한 풍부한 것을 나타내는 ~ 85 % XY, 또는 태아 기원했다. 통로 0에서 두 문화 ~ 15 % 모체 세포 (XX) 오염 물질이 포함되어 있습니다. 놀랍게도, 통로 (2)에서 모두 태아 배양 ~ 100 % 모체 세포 (XX), 태아 세포 (XY)로 채워했다더 이상 검출되지 않았다. XY의 FISH 분석은 모체 세포 (XX 염색체가) 신속하고 지속적으로 인수 문화 태아의 융모 조직에서 파생 된 것을 알 수있다. 이것은 종종 5를 간과되는 중요한 문화의 관측이다. 이 DMEM는 태아 유래 인구를 지원하도록 설계 추가 요소없이 사용이 10 % FBS와 보충 할 때 모체 세포가 빠르게 모든 문화를 채우는 매우 중요한 관찰을 보여줍니다 때문에이 분석의 세부 사항은이 프로토콜에 포함되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig1.jpg" /> 그림 1 :. 태반 MSC 분리 절차의 개요 (1 단계) 태반 해부학와 함께 자신의 방향을. (2 단계) 수동으로 탈락, 융모막 융모 또는 가위를 사용하여 융모 판 중 하나에서 조직의 10g을 해부하다. (단계 3) t 말하다그는 가위 나 메스와 미세 조각으로 탈락, 융모막 융모 또는 융모 판 조직의 일부를 해부. (4 단계) 디스 파제와 콜라게나 I.에서 1 ~ 2 시간의 소화를 통해 미세 조각에서 세포를 해방 (단계 5) 펄스를 원심 분리 및 / 또는 셀 스트레이너를 통해 세척하여 섬유 조직으로부터 세포를 분리. 수집 및 배지에서 세포를 재현 탁하고 배양 플라스크에 넣고. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 중간 엽 기질 세포 (MSC)는 플라스틱 준수 및 생존과 배양 배지에서 증식 능력에 대한 자신의 성향에 따라 선택됩니다. 마지막으로, 결과 섹션에서 팽창 MSC 특성화 될 수 있고, 미래의 실험에 사용하기 위해 저장된다. 그림 2 :.이 절차에 고립 된 인간의 용어 태반 조직의 해부학 수확하는 첫 번째 조직은 산모의 탈락이다. 탈락 그것이 (탈락 녹색 마커에 의해 식별된다) 자궁벽에서 흘린 후 태반의 표면에 얇은 층으로 남아있는 조직이다. 태반의 내부에서 수확됩니다 두 번째 조직은 태아의 융모막 융모 (파란색 마커)입니다. 수확하는 세 번째 조직 (참조 36에서 적응) 태아의 융모 판 (빨간색 마커)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig3.jpg" /> 그림 3 : 48 시간 격리 다시 후 문화의 형태학조직 파편을 이동. (A) 배양 상등액의 모양 부스러기를 세척하기 전에 태반 기증자 사이에 실질적으로 변할 수있다. 예 배양 물 1 및 2는이 변화를 보여준다. 이 두 아이솔레이션을 동시에 수행하지만, 두 개의 서로 다른 태반에서 있었다. 후속 팽창 결과는 일반적으로 일치하는 실시 예 3에 나타낸 바와 같이 한번 세정 배양 적혈구 및 조직 파편이 명백 할 것이다. 48 시간의 미디어 교환하기 (B)는 단지 몇 세포가 플라스크에 부착 될 것이다. 스케일 바 = 200 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig4.jpg" /> 그림 4 :. 시간이 지남에 MSC 문화의 형태학 (A) 분리 후 7 일, 작은 F비 MSC 세포는 원형 또는 느슨하게 연결된 세포와 같은 존재한다하더라도 ibroblastic MSC 식민지 볼 수 있습니다. (B) 분리 후 십삼일, 섬유 모세포 MSC 식민지가 크고 자주 MSC의 단층이 합류 및 통로 준비입니다. 통로 (2) 이후부터 (C)는 MSC의 단층이 합류 특성 소용돌이 모양의 형태를 개발합니다. 스케일 바 = 200 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig5.jpg" /> 그림 5 :. 유동 세포 계측법 및 중배엽 분화에 의해 MSC의 특성 (가) 태반의 융모막 융모 유래 MSC는 유동 세포 계측법 분석에 의해 고전 MSC 마커 프로파일을 표시이 세포 표면 마커, EXPRES 있지만,시온은 인간 MSC의 모든 종류의 유사합니다. 각 히스토그램은 y 축 (최대의 %)에 상기 정규화 된 셀 계수 대 신호 강도 (X 축)을 나타낸다. 설정이 대표 데이터에서 세포는 조혈 마커 CD45 및 CD34 및 HLA-DR에 대한 CD73, CD105과 CD44 양성 및 음성이었다. (B) 태반 MSC는 일반적으로 단 (C)이 지방 세포 분화가 골수 유래 MSC보다 덜 효율적일 수 있으며, 강력한 골 형성 분화를 겪는다. 자막 B와 C의 이미지가 40 배 배율로 촬영되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig6.jpg" /> 그림 6 : 태반 MSC는 출발 물질의 해부학 적 위치에도 불구하고, 문화의이 방법을 사용하여 원점에서 산모 있습니다.플롯은 태아 (남성 XY)와 어머니의 모든 제 2 통로에서 탈락, 융모막 융모와 융모 판 조직에서 분리 태반 MSC 문화의 (여성 XX) 세포 성분의 정량을 보여줍니다. 산모 세포 (XX)는 신속하고 재현성 태아의 융모 조직에서 파생 된 문화를 정복. 태아 = 남성 = 개별 세포에서 발견 XY 염색체, 개별 셀에서 검출 된 산모 = 여성 = XX 염색체. 여기에 제시된 데이터는 XY의 물고기를 염색하고 각 데이터 포인트 계산 100 셀의 최소, 남자 아기에서 N = 3 독립적 인 기증자 태반에서였다. 바는 평균을 나타내며, 오차 막대가 하나의 표준 편차를 반영한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 태반 조직 유래 중간엽 줄기 기질 세포를 분리하고 확장하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 호주 브리즈번의 Translational Research Institute 내 Queensland University of Technology의 그룹 리더인 Mike Doran입니다.안녕하세요, 저는 퀸즐랜드 대학교 임상 연구 센터의 연구원 레베카 펠레카노스(Rebecca Pelekanos)입니다. 오늘은 MSC 분리 절차를 시연하겠습니다. 태반은 보통 출산 후 폐기됩니다.조직의 무게가 5~700g에 달하기 때문에, 이는 동종 중간엽 줄기세포의 독특하게 거대한 공급원이 됩니다. 일반적으로 태반 MSC 분리를 처음 접하는 연구자들은 태반의 해부학적 구조에 익숙하지 않고, 조직 처리 방법이 생소하며, 최종 MSC 배양물에 모체 세포와 태아 세포 중 어떤 유형의 세포가 분포하게 될지 잘 모르기 때문에 어려움을 겪습니다. 연구자들을 돕기 위해, 본 영상에서는 이러한 중요한 세부 사항들을 논의합니다.이 절차의 첫 번째 단계는 태반의 해부학적 구조를 파악하는 것입니다. 두 번째 단계는 가위를 사용하여 탈락막, 융모막 융모 또는 융모판에서 10 g의 조직을 수동으로 절제하는 것입니다. 처음 두 단계가 여기에서 다시 도식적으로 요약되어 있습니다.세 번째 단계에서는 가위로 탈락막, 융모막 융모 또는 융모판 조직을 더 잘게 다집니다. 네 번째 단계에서는 dispase와 collagenase I을 이용해 1~2시간 동안 소화시켜 작은 조직 조각으로부터 세포를 분리합니다. 다섯 번째 단계에서는 셀 스트레이너(cell strainer)로 세척하여 섬유 조직으로부터 세포를 분리합니다. 그 후 세포를 수집하여 배양 배지에 재현탁한 뒤 배양 플라스크에 넣습니다.중간엽 기질 세포(MSCs)는 플라스틱 부착 성향과 세포 배양 배지에서의 생존 및 증식 능력을 기준으로 선택됩니다. 마지막으로 결과 섹션에서 확장된 MSC의 특성을 분석하고 향후 실험에 사용할 수 있도록 보관합니다. 태반은 임신 기간 동안 태아와 모체 사이의 영양분 및 노폐물 교환을 가능하게 하는 일시적인 기관입니다.태반은 제왕절개술과 아기의 안전한 출산 후에 무균적으로 쉽게 수집할 수 있습니다. 태반은 주로 태아 유래의 혈관과 막으로 구성되어 있습니다. 하지만 일부 모체 세포도 포함하고 있습니다.태반은 모체 유래의 자궁 탈락막 세포와 태아 유래의 침습적 영양막 세포 모두에 의해 자궁과 연결됩니다. 일반적으로 모체 조직과 태아 조직 사이의 정확한 경계면을 육안으로 구별하는 것은 불가능합니다. 하지만 태반의 태아측은 탯줄이 위치한 쪽으로 쉽게 식별할 수 있습니다.태아가 분만되면 탈락막 조직의 얇은 층만이 태반에 연결되어 남게 됩니다. 태반의 물리적 방향을 통해 오늘 채취할 세 가지 조직의 위치를 파악할 수 있습니다. 첫 번째로 채취할 조직은 모체 탈락막입니다.초록색 마커는 태반이 자궁벽에서 탈락한 후 표면에 남아 있는 탈락막 조직을 가리킵니다. 태반 내부에서 채취할 두 번째 조직은 태아 융모막 융모입니다. 이는 도식의 파란색 원으로 표시되어 있습니다.세 번째로 채취할 조직은 태아 융모판입니다. 이 조직은 도식의 빨간색 표시로 확인할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다.태반을 생물학적 안전 작업대(biological safety cabinet)에 놓습니다. 태아막을 펼치고 태반의 각 부위의 위치를 확인합니다. 제대가 삽입된 태아 측, 융모양막(chorioamniotic laeve) 또는 양막을 확인하십시오.태반의 태아면은 융모판에 뚜렷하고 큰 혈관들이 있으며, 그 위를 양막이 덮고 있는데 이 양막 또한 기계적으로 쉽게 분리됩니다. 모체면은 태아면의 반대쪽이며, 뚜렷한 태반엽 또는 엽들이 관찰됩니다. 모체면이 위를 향하도록 하십시오.태반의 모체측 또는 탈락막에서 0.5 cm 두께로 조각을 절단합니다. 해부 과정 동안 조직 조각이 마르지 않도록 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)이 담긴 페트리 접시에 넣으십시오. HBSS가 담긴 접시에서 조직을 흔들어 혈액을 일부 제거합니다.50 mL 튜브의 10 mL 표시선까지 채울 수 있을 만큼의 조직(약 10 g)을 옮깁니다. 참고로, 실험 종료 시 더 많은 세포가 필요한 경우에는 이 단계에서 더 많은 조직을 분리할 수 있습니다. 이때 태아면이 위를 향하도록 하십시오.태반의 태아면에서 양막을 기계적으로 제거하고, 융모판은 그대로 둡니다. 융모판을 아래쪽 융모 조직으로 약 0.5 cm 깊이까지 절개하여 조각으로 자릅니다. 그런 다음, 융모판이 제거된 부위로부터 태반 내부로 약 1 cm 깊이까지 융모 조직을 박리합니다.조직을 HBSS에 넣고 이전과 동일하게 조직 약 10 milliliters를 측정합니다. 액체 전이를 최소화하여 조직 조각들을 10 centimeter 페트리 접시에 옮긴 후, 가위로 약 1 cubic milliliter 크기의 미세한 조각으로 다집니다. 다져진 조직을 다시 50 mil 튜브로 옮깁니다.나머지 모든 조직 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 조직과 최소 1:1 비율로 갓 준비한 소화 배지를 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다.조직을 소화 배지가 들어 있는 튜브에 넣고, 진탕 인큐베이터에서 37 °C로 1~2시간 동안 배양합니다. 조직 소화액이 탁하게 변하고 용액 내에 흰색 혈관이 뚜렷하게 보이면, HBSS 15 mL를 첨가하여 소화 배지 내의 효소를 희석합니다. 샘플을 340 g에서 5초 동안 짧게 펄스 원심분리한 후 정지시킵니다.이렇게 하면 커다란 부스러기들이 튜브 바닥에 모이게 됩니다. 샘플을 생물안전작업대(BSC)로 옮기십시오. 새로운 50 milliliter 튜브에 셀 스트레이너를 넣으십시오.단핵세포가 포함된 상층액을 스트레이너에 피펫팅하여 용출액을 새 튜브에 받습니다. 태반 조직 잔해는 첫 번째 튜브에 남겨둡니다. 태반 잔해에 HBSS 15 milliliters를 추가하고, 세게 흔들어 더 많은 세포를 회수한 후 샘플을 펄스 원심분리합니다.다시 한번 상층액을 수집 튜브 내의 세포 스트레이너가 들어 있는 튜브로 피펫팅합니다. 샘플의 점도에 따라 상층액을 세포 스트레이너에 붓는 방식이 더 적합할 수 있습니다. 세포 스트레이너를 5 milliliters의 HBSS로 세척합니다.태반 조직 잔해물이 포함된 튜브를 폐기합니다. 상층액 샘플을 340 g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 적혈구는 펠렛 바닥의 층으로 관찰되며, MSC를 포함한 단핵구는 적혈구 위의 더 밝은 층으로 나타납니다.샘플을 생물안전작업대(biological safety cabinet)로 옮깁니다. 상층액을 조심스럽게 따라내어 폐기합니다. 손가락으로 튜브를 여러 번 튕겨 세포 펠렛(cell pellet)을 떼어낸 후, 35 milliliters의 MSC 배지로 세포 펠렛을 재부유시킵니다.조직 10 mil당 T175 플라스크 1개에 세포 현탁액을 옮기고, 5% CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다. 분리 후 48시간 뒤에 배양액을 교체합니다. 세포가 confluence 상태가 될 때까지 일주일에 한 번씩 배양액을 공급합니다.배양 세포는 약 14일경에 합류(confluent)되어야 합니다. 마지막으로, 세포를 확장 및 동결 보존하고, MSC 특성을 분석한 후 실험에 사용합니다. 48시간의 배양 후, MSC는 조직 배양 플라스틱에 부착되지만, 조혈 세포 및 기타 세포군은 부착되지 않습니다.이 시점에서 배지를 35 milliliters의 신선한 배양 배지로 교체합니다. 배양 상등액의 외관은 태반 기증자에 따라 상당히 다를 수 있습니다. 예시 1과 2에서 이러한 차이를 확인할 수 있습니다.이 두 가지 분리 과정은 동시에 수행되었으나, 서로 다른 두 개의 태반에서 진행되었습니다. 세 번째 예시에서 보는 바와 같이, 세척 후의 배양물에는 적혈구와 조직 파편이 없으며, 이후의 확장 결과는 일반적으로 일관되게 나타납니다. 48시간 후 배지를 교체하면 플라스크에 소수의 세포만 부착되어 있습니다.분리 7일 후면 섬유아세포 모양의 MSC 콜로니가 관찰되지만, 둥글거나 느슨하게 부착된 형태의 비-MSC 세포들도 함께 존재합니다. 분리 13일 후에는 섬유아세포 모양의 MSC 콜로니가 커지며, 흔히 MSC 단일층이 충분히 합쳐져 계대 배양할 수 있는 상태가 됩니다. 계대 배양 이후부터는 MSC 단일층이 세포 밀도가 높아짐에 따라 특징적인 소용돌이 모양의 형태를 띱니다.태반 유래 MSC는 유세포 분석을 통해 전형적인 MSC 마커 프로필을 나타냅니다. 이 세포들은 CD73, CD105, CD90에 대해 양성을 보이며, 조혈 마커인 CD45, CD34, HLA-DR에 대해서는 음성을 보입니다. 태반 유래 MSC는 일반적으로 강력한 골분화를 거치지만, 지방분화 능력은 낮습니다.많은 문헌에서는 태아 융모막에서 분리한 세포를 배양하면 태아 MSC를 얻을 수 있다고 가정합니다. 하지만 본 연구진이 이전에 보고했듯이, 이 프로토콜을 사용하여 태아 융모막에서 유래시킨 모든 배양물은 모체 탈락막 MSC 배양물에서 기대되는 바와 같이 빠르게 모체 MSC 위주로 농축됩니다. 여기에 제시된 데이터는 탈락막, 융모막 융모 및 융모막판 조직에서 분리한 태반 MSC 배양물의 태아 및 모체 세포 구성 비율을 정량화한 것입니다.이 영상을 시청하신 후, 태반 조직에서 유래한 MSC를 분리하고 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 이러한 방법들이 태반 유래 MSC를 활용하는 귀하의 연구 및 임상 응용 분야에 유용하게 쓰이기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

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지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI높은MFGE8높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBIhighMFGE8high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다.  우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

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배우세요 인간 태반 조직에서 중간 엽 줄기/기질 세포를 분리하고 확장하는 방법을. 수동 절제와 효소 소화를 통해 MSC를 분리하고 배양하여 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

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