Name: 대한 대퇴골 창 회의소 모델 생체 셀 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 학습하세요 쥐 대퇴골 창 회의소 모델을 이용한 생체 내 중성구 추적 방법입니다. 다광자 형광 현미경으로 혈관 및 골수 내 면역세포 역학을 장기간 관찰하여 감염과 종양 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 현미경과 지원을 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 시설 (www.aomf.ca)를 감사하고, 화장실, 이미징 단계의 제조 프린세스 마가렛 암 센터의 기계 공장에서 씨 제이슨 엘리스 것이다. 우리는 또한 원고 편집 박사 아이리스 Kulbatski에게 감사의 말씀을 전합니다.

참고 : 모든 동물의 작업은 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜 # 2615에 따라 실시 하였다. 마우스 1. 수술 준비 <ol><li> 이전 수술로, 모든 수술기구 및 고압 증기 멸균하여 윈도우 챔버 (WC)를 소독. 2 일전 수술 아목시실린의 50 mg / kg 체중으로 식수를 보충합니다. 복강 4 시간 전에 수술 부 프레 노르 핀의 0.1 ㎎ / ㎏ 체중와 마우스를 주입한다. </li><li> 80 ㎎ / ㎏ 케타민 13 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (주를 포함 350-400 μL 식염수 용액을 복강 내 주사에 의한 무 흉선 누드 마우스를 마취 :이 기관 동물 관리위원회의 승인을하고, 우리는 부작용 어떤 경험이 없었어요 ). 발 반사를 테스트하여 적절한 마취를 확인합니다. 절차를 수행하는 동안 호흡 패턴, 점막 색상과 발 반사에 대한 관찰을 계속합니다. </li><li> 수술 홍보를 수행바이오 안전성 캐비닛에서 ocedures 수술시 무균 상태를 유지합니다. 수술 동안 체온을 유지하는 수술 용 드레이프 피복 전기 난로에 마우스를 놓는다. 실체 현미경 아래에있는 모든 수술 절차를 수행합니다. </li><li> 수술하는 동안 촉촉한 눈을 유지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 수술하는 동안 필요한 경우 반복합니다. 연속적으로 7.5 % 포비돈 - 요오드, 70 % 이소 프로필 알코올 10 % 포비돈 - 요오드 닦아 마우스의 조작 영역을 소독 회이 과정을 반복한다. </li><li> 측면에서 대퇴골에 접근, 블레이드 (# 15)와 메스를 사용하여 10mm 길이의 피부 절개를합니다. 근육의 기능을 보장하기 위해 집게와 지혈제를 사용 무딘 절개하여 굴근과 신근 근육 사이의 대퇴골을 노출. </li><li> 뼈 아래에있는 U 자형 막대를 삽입하고, WC (그림 1)를 설치합니다. 2 개의 너트를 사용하여 창 막대를 고정하고, 용와 너트를 조이CEPS. 뼈 및 치과 시멘트와 화장실 사이의 공간을 채 웁니다. </li><li> 골수 공동 광학 액세스하는 마이크로 드릴 6 × 2 ㎜ × 2 영역의 피질골을 분쇄. 참고 :이 절차를 수행하는 동안 조심스럽게 현미경으로 피질골의 숱을 검사합니다. 뼈의 손상, 거의 투명 골막 층을 둡니다. </li><li> 창에 8 밀리 커브 글라스를 놓고 장소에 보관하는 스냅 링과 커브 글라스를 고정합니다. </li><li> 수술 다음 그 기능을 유지하기 위해 집게를 사용하여 다시 원래 위치로 굴근과 신근의 근육을 조정합니다. 5-0 봉합사와 바늘 홀더를 사용하여 진피 봉합사. </li><li> 이 의식 자유롭게 움직일 수있을 때까지, 복구를 위해 마우스를 모니터합니다. 복구 할 때 새 케이지에 동물을 넣습니다. </li><li> 복구 후, 같은 날 또는 다음 날 동물의 이미지 수집을 수행 (섹션 2 참조). 풍모를 모니터링매일 마우스의 칼 상태. 참고 : 무게가 빠르거나 얕은 호흡, 뒷다리의 부종, 자기 절단, 봉와직염, 심한 피부염을 hunching, 사지에 베어링과 같은 물리적 조건을 모니터링합니다. </li><li> 3 일간의 부 프레 노르 핀 / kg 체중 0.1 mg을 복강 내 주사를주고, 수술 - 후 통증 및 염증 치료를위한 수술 후 5 일간 멜 록시 캄의 1 ㎎ / ㎏ 체중. 5 일간 아목시실린 - 보충 물을 제공하는 계속합니다. </li><li> 실험 엔드 포인트, CO에 의해 보조 방법 (예를 들어, 경추 탈구)이어서이 마취를 동물을 안락사. </li></ol> 복합 다중 광자 및 공 초점 현미경을 사용하여 2. 이미지 획득 <ol><li> 종래 이미징 80 밀리그램 / kg 케타민, 13 밀리그램 / kg 자일 라진 함유 350-400 μL의 생리 식염수를 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 가능한 경우 또는 흡입 마취제를 사용합니다.눈 연고를 적용합니다. </li><li> 라벨 혈관에 대한 혈관 내 염료의 혼합물 (0.65 2 MDA 형광 (FITC) -dextran의 mg) 및 호중구 (Allophycocyanine (APC의 4 μg의) - 반대로 Ly6G 항체)를 주입한다. </li><li> 청색으로부터 적색에 여기 파장을 제공하는 705-980 nm 내지 이광자 여기 레인 징 다중 광자 레이저뿐만 아니라, 단일 광자 레이저를 구비 한 직립 결합 다중 광자와 공 촛점 현미경을 사용한다. </li><li> 현미경 (그림 1B)에 사용자 정의 만든 영상 단계를 설정합니다. 악어 클립으로 WC의 두 끝을 체결하여 무대에 마우스를 고정합니다. WC를 유지하기 위해 두 악어 클립 및 가열 요소는 이미징 동안 마우스의 생리적 온도 (37 ° C)를 유지하기 위해 다음 단계의 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다 있습니다. </li><li> 두 광자 레이저 공 초점 시스템의 전원을 켜고 &quot;시작 시스템&quot;을 클릭하여 이미지 수집 소프트웨어를 실행합니다. 4 탭 창이 (찾아획득, 처리 및 유지) 열립니다. </li><li> 이미징 채널을 설정합니다. 획득 탭에서 &quot;스마트 설치&quot;를 클릭하고 영상에 사용되는 염료를 선택 FITC (488 nm의 여기, 493-588 nm의 방출)와 APC (633 nm의 여기 및 638-743 nm의 방출을). &quot;최고의 신호&quot;를 선택하고 &quot;적용&quot;을 클릭합니다. </li><li> 수동 제 2 고조파 발생 (SHG) 화상 취득 채널을 추가한다. 획득 탭에서 &quot;레이저&quot;창 아래에있는 두 광자 레이저를 켭니다. [채널] 창에서 트랙을 추가하려면 &quot;+&quot;기호를 클릭합니다. </li><li> SHG 트랙을 설정합니다. 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 채널 창 아래 840 nm의 파장을 변경하고 슬라이더 막대를 사용하여 &quot;빛의 경로&quot;창에서 415-425 나노 미터로 검출 범위를 선택합니다. </li><li> 찾기] 탭에서 &quot;접안 온라인&quot;을 클릭합니다. FITC 관심의 영역을 확인하고 t을 돌려 초점을 수동으로 조정에 대한 필터 설정에서 FITC를 클릭합니다그 현미경 측에 손잡이를 집중한다. 관심 영역이있는 경우, 찾기 탭에서 &quot;접안 오프라인&quot;을 클릭합니다. </li><li> 획득 탭을 클릭합니다. 채널 창에서 FITC 트랙을 선택하고, 5 배 목표와 FITC-덱스 트란의 이미지를 미리 &quot;라이브&quot;를 클릭합니다. 필요에 초점을 조정하고 미리보기를 중지 취득 탭에서 &quot;중지&quot;를 클릭합니다. </li><li> 수동 렌즈 위의 휠을 이동하여 20 배의 물 목표로 설정합니다. 20 배 목표를 사용하여 FITC-덱스 트란에 대한 이미지를 다시보기 및 최적의 신호와 대비를 달성하기 위해 채널 창에서 마스터 게인 및 핀홀을 조정합니다. [채널] 창에서 APC 및 SHG 트랙을 선택하여 다른 채널에 대해 반복합니다. </li><li> 이미징 매개 변수를 선택합니다. 그 창을 엽니 다 &quot;수집 모드&quot;를 클릭합니다. 고품질의 이미지를 얻기 위해, 프레임 크기는 1024 X 1024 픽셀로 설정하고, 4 배의 평균. </li><li> 2 차원 스냅 샷을 취득. 채널 승리에서 모든 채널을 선택다우와 획득 탭​​에서 &quot;스냅&quot;을 클릭합니다. 이미지의 품질을 확인하고 필요한 경우 영상 매개 변수를 변경합니다. </li><li> 2D 시간 경과 이미지를 획득. <ol><li> 시계열 창을 엽니 획득 탭​​에 &quot;시간 시리즈&quot;를 해제하십시오. 시간 간격없이 연속 40 이미지를 취할 검사의 총 수의 간격에 따라 0, 40을 입력합니다. 참고 : 40 스캔은 7.5 초 / 프레임의 스캔 속도 및 600 μm의 × 600 μm의 이미지 크기는 약 5 분 장시간 시리즈를 생성한다. 간격과 현미경 화상 취득 설정 및 카메라의 프레임 레이트에 따라 스캔의 수를 조정한다. 일정 간격의 시간 (&gt; 0 초)은 상이한 시점에서 취득한 타임 랩스 영상과 비교하기 위해 사용될 수있다. 더 긴 시간 경과 영상 시간은 실험 조건에서 호중구 (또는 관심의 다른 세포)의 예상 평균 속도에 따라 요구 될 수있다. </li></ol></li><li> 3D 이미지를 획득.<ol><li> Z 축 스택 창을 엽니 획득 탭​​에 &quot;Z-스택&quot;을 해제하십시오. FITC-덱스 트란의 &quot;라이브&quot;미리보기 모드를 시작합니다. 샘플의 상단에 초점 &quot;우선 설정&quot;을 클릭하고 샘플의 다른 쪽 끝을에 초점을 클릭 Z 스택 창에서 &quot;최근 설정&quot;. </li><li> Z 축 스택 창에서 10 μm의 것으로 간격을 설정합니다. 이전 단계에서 선택된 제 1 및 최종 광학 슬라이스에 따라이 90-180 ㎛, 전체 광학 두께, 10-20 슬라이스를 생성한다. 주 : Z 스택 간격 광학 슬라이스 두께를 결정 핀홀의 크기에 의존한다. 광학 슬라이스의 두께 이상이어야 간격을 설정합니다. </li><li> 이미지를 수집하기 시작 획득 탭​​에서 &quot;시작 실험&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 3D 시간 경과 이미지를 획득. <ol><li> 시계열을 열 획득 탭​​에 &quot;시간 시리즈&quot;와 &quot;Z-스택을&quot;오프 확인그리고 Z-스택 창. </li><li> 단계 2.14과 2.15에 설명 된대로 시간 시리즈 설정하고 Z 스택 획득 매개 변수를 설정합니다. 이미지를 수집하기 시작 획득 탭​​에서 &quot;시작 실험&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 이 안정적이고 의식이 있는지 확인하기 위해 촬영하는 동안 마우스를 모니터합니다. 마우스가 촬영 중에 불안정 및 / 또는 의식이있는 경우, 무대에서 마우스를 제거 복강 마취 솔루션의 추가로 100 ~ 150 μl를 주입하고, 영상을 계속합니다. 참고 : 불안의 징후가 빠른 호흡과 획득 된 영상에서 아티팩트를 변화로 볼 수있다 마우스의 움직임을 포함한다. </li><li> 이미지 수집 한 후, 단계 떨어져 마우스를 가지고 케이지로 돌아갑니다. 따뜻하게 유지하고, 의식 때까지 마우스를 모니터링하는 가열 램프를 사용한다. </li></ol> 3. 이미지 분석 및 정량화 <ol><li> 3 차원 및 시계열 데이터를 분석하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 소프트웨어를 열고&quot;아레나&quot;보기라고 열려있는 화면으로 드래그하여 이미지를 추가 할 수 있습니다. 를 열 수있는 이미지 파일을 더블 클릭; 이미지가 &quot;능가&quot;보기에서 열립니다. </li><li> 2 차원 / 3 차원 이미지를 만듭니다. <ol><li> 오른쪽 상단에있는 &quot;추가&quot;줄에서 &quot;디스플레이 조정&quot;창을 엽니 다 &quot;편집 /보기 표시 조정&quot;을 클릭합니다. 각 채널에 대한 임계 값을 조정함으로써, 형광 표시를 최적화하며, 이미지를 저장하는 스냅 샷. </li></ol></li><li> 시간 경과 이미지를 사용하여 개체 트랙을 생성합니다. <ol><li> 이미지를 엽니 다하는 &quot;능가&quot;보기에 따라 분석한다. 은 &quot;능가&quot;아이콘 아래에있는 오렌지 도트의 이미지와 아이콘을 클릭합니다. 이 새로운 &quot;관광 명소&quot;창이 열립니다. </li><li> &quot;(시간 이상) 트랙 스포트를&quot;오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. &quot;소스 채널&quot;에서 추적 할 개체를 포함하는 채널을 선택하고, 추정 된 개체 diamet 설정에 숫자를 입력하여 &quot;예상 XY 직경&quot;에서 어입니다. 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. 참고 : 호중구 추적의 경우, 호중구에 대한 APC 형광을 포함하는 채널을 선택하고 호중구의 알려진 크기에 따라 12 μm의 객체 직경을 설정합니다. </li><li> 창에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 &quot;품질&quot;필터를 선택합니다. 소프트웨어에 의해 정의 된 지점을 관찰하고 포함하거나 지점을 제외 수동으로 임계 값을 조정합니다. 임계 값이 정의되면, &quot;추적&quot;단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. </li><li> 알고리즘에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 &quot;회귀 모션 알고리즘&quot;을 선택합니다. &quot;최대 간격 크기&quot;에 대한 &quot;최대의 거리&quot;에 대한 10 μm의 3 유형 매개 변수 아래에 있습니다. 추적을 시작하려면 &quot;모든 탐지 된 개체와 격차를 채우기&quot;오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. 주 : &quot;회귀 모션 알고리즘&quot;F를 사용또는 이전 운동에서 예측 된 위치에 따라 트랙을 생성하기 때문에, 운동을 지시 한 개체입니다. &quot;최대 거리&quot;와 &quot;최대 간격 크기&quot;추적뿐만 아니라, 시간 경과 이미지의 전체 지속되는 예상 치수 오브젝트의 속도에 따라 조정될 수있다. </li><li> 필터 유형에서 &#39;추적 기간 &quot;필터를 선택합니다. 추적을 완료하고, 생성 된 트랙을 확인하기 위해 녹색 화살표를 클릭합니다. 수동으로 트랙을 정렬 할 필요하면 이전 단계로 돌아갑니다. </li></ol></li><li> 번역 드리프트에 대한 올바른 생성 된 시간 경과 이미지 드리프트, 경우. <ol><li> 연필의 이미지로 아이콘을 클릭합니다. 이것은 &quot;편집 트랙&quot;창을 엽니 다 편집 탭입니다. 시간 경과 이미지를 검사하고 모든 이미지를 이동하지 않아야 참조 지점을 찾을 수 있습니다. </li><li> 화면의 왼쪽 상단 모서리에서 &quot;포인터&quot;창을 찾아 오프 확인 용돈을 활성화하기 위해 &quot;선택&quot;자리를 선택하는 rsor. 기준 지점을 클릭합니다. </li><li> &quot;편집 트랙&quot;창에서 &quot;올바른 드리프트&quot;를 클릭합니다. &quot;번역 상 드리프트&quot;를 해제하십시오. 이 소프트웨어는 자동으로 이미지를 보정 시리즈를 생성합니다. </li></ol></li><li> 시간 경과 영상에서 객체 추적에 의해 정의 된 세포의 움직임을 측정한다. <ol><li> &quot;편집 트랙&quot;창에서 &quot;트랙&quot;오프 확인하고 세포의 움직임을 나타내는 트랙을 선택합니다. 선택한 트랙은 시계열 이미지에서 노란색으로 강조 표시됩니다. </li><li> 은 &quot;통계&quot;창 (통계 탭) 열 그래프의 이미지로 아이콘을 클릭합니다. </li><li> &quot;선택&quot;에서 트랙 속도가 선택한 트랙에 대한 의미 생성 아래쪽 화살표를 클릭하여 &quot;트랙 속도 평균&quot;을 선택합니다. 다른 트랙을 선택하고 트랙 속도가 관심의 모든 세포에 대한 의미 측정하는 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

실시간 골수에서 동적 세포 과정의 일련 촬상 그렇지 같은 조직학 총 혈구와 같은 종래 기술을 이용하여 수득 도전 정보를 제공한다. 여기에 설명 된 대퇴골 WC 모델은 시간에 따른 골수 세포 및 구조적 변화를 조사하는 독특한 기회를 제공한다. 대퇴골의 WC 모델은 이전에보고되었지만, 우리의 새로운 디자인 성인 마우스에 사용하기위한 더 호환도 작아 WC 전체 크기의 큰 이미지 필드를 제공한다. 대퇴골 WC 모델은 면역 및 / 또는 트랜스 제닉 리포터 생쥐 포함 마우스 균주의 다양한 이용 될 수있다. 전체 기간과 영상의 품질을 결정하는 수술 중 중요한 단계가 있습니다. 대퇴골을 노출 할 때, 굴근과 신근 사이의 근육의 무딘 절개가 수행된다; 이러한 근육의 제거는 마우스와 뮤스의 감소 이동성 될 수 있습니다t는 회피 될 수있다. 또한, 피질골의 분쇄하는 것은 신중하게 수행해야합니다. 대퇴부 혈관 네트워크의 구조적 무결성을 유지하면서, 약 50 ㎛의 연삭 결상 적합하다. 뼈 시멘트 주...

골수는 조혈 및 면역 조절에 관여하는 중요한 기관이다. 이는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)를 함유하는 성분으로 구성 조혈 및 중간 엽 세포 하나를 야기 비 조혈 전구 세포를 포함하는 기질 성분. 조혈 활동 3 분의 2는 골수 세포 2의 생성에 전념하고 있습니다. 1-2 × 10 11 세포는 정상적인 인간 성인이 하루 당 생성에 특히 호중구의 다수는 골수에서 생성된다. 호중구는 미생물 감염에 대한 방어의 첫 번째 줄에있는 스트레스가 주변 호중구 1,3-을 보완하기 위해 자신의 동원을 트리거 할 때까지 주로 골수에서 예약되어 있습니다. 그 항균 효과에 더하여, 최근의 연구에 따라 바뀌는 성장 프로 및 항 종양 표현형 모두 갖는 암 생물학에서 호중구의 주요 역할을 시사종양 미세 환경의 4,5에 신호 인자 베타 (TGF-β). 또한, 연구는 순환 호중구 세포 독성, 항 전이 효과를 발휘하면서 8 차 종양에 축적 호중구, T 세포의 세포 독성 -6,7- 기능을 억제함으로써 프로 종양 및 전이성 영향을 미치는 것을 설명했다. 이와 같이, 골수의 조혈 세포, 특히 호중구의 조사가 종양 면역 조절의 역할을 밝히기에 중요하다. 조직 병리학 및 전체 말초 혈액 카운트는 정기적으로 골수 구 셀룰러 및 구조적 변화를 평가하기 위해 사용된다. 그러나, 이들 방법은 단지 다른 세포 집단 또는 조직의 미세 구조의 정적 인 정보를 제공한다. 생체 내 이미징 종 세포에서 C뿐만 아니라 여러 세포, 혈관 및 간질 성분의 동역학을 평가하기 위해 표준 방법을 병용 할 수있다길이 방식으로 엘 상호 작용. 미세한 분해능 10 살아있는 동물의 생체 내에 촬상 정의 현미경 (IVM)는, 동일한 샘플 시간에 걸쳐 동적 세포 과정을 평가할 필요 실험 동물의 수를 감소하는데 특히 유용하다. IVM은 종종 주 개월의 기간에 걸쳐 이미징 관심의 기관에 액세스 할 수있는 만성적 이식 윈도우 실 (WC)와 결합된다. 두개골과 지​​느러미 - 피부 집계 WC 모델은 다시 1990 년대 중반까지 거슬러 올라가는 사용의 긴 역사를 가지고 있습니다. 최근 이러한 유방 지방 패드 및 다양한 복부 장기의 것과 다른 기관 특이 WC 모델 (11)이 개발되었다. 생체 내에서 골수 이미징의 일반적인 접근 방식은 얇은 뼈가 최소한의 수술 적 치료 12-14 단일 세포의 직접 시각화를 가능하게 마우스의 덮개 뼈, 주로 참여 노출을 보유하고 있습니다. 그러나, 두개골 골수 ㄱ 수도E HSPCs (15)의 유지 보수 및 개발 감소 나타낸다의 두개골에 HSPCs 저산소 세포의 낮은 숫자에 의해 입증 된 바와 같이, 이러한 긴 뼈 다른 뼈의 구별. 따라서, 긴 뼈의 세포 구성 요소를 평가하기위한 다른 방법을 조사하고 있습니다. 다음은 대퇴 골수 (16)의 직접적인 노출과 등쪽 피부 집계 WC (17)의 분할 대퇴골의 이소성 이식을 포함한다. 그러나, 전자는 더 긴 기간에 걸쳐, 셀룰러 구조적 및 기능적 변화를 추적하는 것을 허용하지 않는 터미널 절차이고, 후자의 가능성 때문에 등쪽 피하 지방 WC 내부 자궁외 사이트 대퇴골 이식 정상적인 골수 기능을 방해한다. 시간이 지남에 따라 대퇴골 골의 소성을 연속 촬영을 가능하게하는 또 다른 방법은 대퇴골의 WC의 사용이다. 하나의 이전 보고서는를 사용하여 대퇴 골수 미세 장기 영상을 보여쥐 18 WC를 대퇴골. 또한 저자는 모니터링 골수 전이에서의 유틸리티를 나타내는 대퇴골에서 종양 세포의 가시화를 보여 주었다. 그러나,이 WC 설계가 큰 마우스 (26-34g 나이 3-6 개월)에만 적합했다 대형 사이즈 (1.2 cm 직경)과 상대적으로 작은 이미징 영역 (4mm 직경)에 의해 제한되었다함으로써 제조 일상적인 사용을위한 실용적 접근. 따라서, 작은 전체 크기 새로운 WC 큰 내부 이미징 영역이 연구의 목적으로 설계되었다. 본 연구의 목표는 대퇴골 골 다양한 세포 유형을 묘화 방법을 제공하는 것이다. 대퇴골의 WC 모델은 자체 개발하고, 3D 혈관 네트워크 내에서 호중구를 시각화하고 추적하는 데 사용되었다. 이 모델을 이용하여, 골수 IVM 40 일간 연속적으로 수행 할 수있다. 이 방법은 면역 조절 A를 조혈 과정의 해명을위한 다양한 분야에 적용될 수있다차 종양 개발.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F 흉선 누드 마우스</td><td>Taconic</td><td>Ncr 누드</td><td>8-10주령, 암컷</td></tr><tr><td>식염수</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>바이엘 헬스케어, 바이엘 Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>수술용 드레이프</td><td>프록시마</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>전기 가열 패드</td><td>라이프 브랜드</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>스테레오현미경</td><td>라이카</td><td>라이카 M60</td><td></td></tr><tr><td>눈 연고 (눈물 젤)</td><td>Novartis&nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% 베타딘</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% 이소프로필 알코올</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% 베타딘</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들</td> <td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>봄 가위 곡선</td><td>정밀 과학 도구</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Baby-Mixter Hemostat</td><td>Fine science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine science Tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 드릴</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 드릴 버</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>대퇴골 창 챔버</td><td>PMCC 기계 공장</td><td>맞춤형 설계</td><td>9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (외경에서 내경), 2.16 mm (두 구멍의 반경), 13.9 mm (두 구멍 사이의 거리), 0.7 mm (두께)</td></tr> <tr><td>U 자형 막대</td><td>PMCC 기계 공장</td><td>맞춤 설계</td><td>13.8 mm (길이), 1.6 mm (너비), 3.7 mm (높이)</td></tr><tr><td>커버글라스 (8 mm)</td><td>워너 인스트루먼트&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>고정 링(8mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>너트(육각 스테인리스 스틸)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>봉합사(5-0 Monosof black)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Halsey 바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 (Temgesic)</td><td>레킷 벤키저</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>멜록시캠 (메타캠)</td><td>베링거인겔하임</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>아목시실린 (클라마복스)</td><td>화이자</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-덱스트란</td><td>시그마-알드리치</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- 안티-마우스 Ly-6G (Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>이광자 현미경 LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>이미징 스테이지</td><td>PMCC 기계 공장</td><td>맞춤 설계</td><td>15.9cm(길이), 11cm(너비), 0.9cm(높이)</td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>프로토콜의 섹션 3에 설명된 이미지 분석 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>프로토콜 섹션 2에 설명된 이미지 수집 소프트웨어&nbsp;</td></tr></tbody></table>

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

골수는 다양한 조혈 및 비조혈 세포를 포함하는 복잡한 기관입니다. 이 세포는 조혈, 면역 조절 및 종양 조절을 포함한 많은 생물학적 과정에 관여합니다. 조직학 및 혈구 수와 같이 골수 내 세포 활동을 이해하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 생체 내에서 여러 세포 구성 요소의 동적 작용을 포착하기보다는 정적 정보를 제공합니다. 표준 방법을 보완하기 위해 쥐 골수에 있는 세포와 구조의 연속 생체 내 이미징을 가능하게 하는 창 챔버(WC) 기반 모델이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 대퇴골수에 대한 장기적인 광학적 접근을 용이하게 하기 위해 대퇴골에 WC를 설치하는 수술 절차를 설명합니다. 특히, 실험적 유용성을 입증하기 위해 이 WC 접근법을 사용하여 대퇴골의 혈관 네트워크 내에서 호중구를 이미지화하고 추적하여 골수에서 면역 세포 이동 및 조절을 시각화하고 정량화하는 새로운 방법을 제공했습니다. 이 방법은 조혈, 줄기세포 이식, 암을 포함한 병리학적 상태에서의 면역 반응과 같은 쥐 골수에서 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

쥐 대퇴골 골 성공적 개별 호중구 및 혈관 네트워크의 시각화를 활성화 WC를 사용하여 액세스된다. 하나의 WC 구를 도시하고 내부 광 액세스하는 대퇴골과 피질골의 박형화의 노광을 수반 수술을 설명 도표 뼈. 수술은 생쥐에서 잘 허용된다 그들은 고통없이 보고서와 같은 오일 수술 후의 화장실에 뒷다리의 부종, 비 체중이 다리에 베어링, 자기 절단, 봉와직염 및 피부염뿐만 아니라, 손상 등의 부작용 물리적 반응에 대해 평가 하였다. 특히, 윈도우는 다음의 개입 셀룰러 및 구조 변경의 장기 평가를 가능하게 할 수있는 40 일 대한 IVM을위한 광학적으로 투명한 남아있다. 골수 내 혈관이 같은 FITC-덱스 트란과 같은 혈관 염료, 시각화 할 수 있습니다(그림 2). 콘트라스트 ...

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

이 절차의 전반적인 목표는 대퇴골 위에 이식된 만성 창틀을 통해 쥐 골수 내 혈관 구조의 호중구를 장기간 현미경 이미징 및 추적하는 것입니다. 이 방법은 감염, 종양 형성 및 종양 전이 조절에서 단핵구의 역할에 대한 면역학 및 종양학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조혈의 중심 부위인 대퇴골수에 장기간 현미경으로 접근할 수 있고 기존 방법으로는 얻기 어려운 동적 정보를 제공한다는 것입니다.이 방법은 혈관 네트워크 내의 호중구 이미징에 특이적이지만 관심 있는 다른 면역 세포 집단을 시각화하는 데에도 사용할 수 있습니다. 수술 당일, 기분표가 없는 누드 마우스의 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없어 적절한 진정 수준을 확인하십시오. 그런 다음 실체 현미경 아래 수술용 드레이프로 덮인 전기 가열 패드에 마우스를 놓습니다.다음으로, 동물의 눈에 연고를 바르고 7.5%의 포비돈-요오드, 70%의 이소프로필 알코올, 10%의 포비돈-요오드로 두 번의 연속적인 물티슈로 수술 부위를 살균합니다. 동물이 준비되면 15번 날이 있는 메스를 사용하여 측면에서 대퇴골에 접근하는 10mm 세로 피부 절개를 만듭니다. 그런 다음 집게와 지혈기로 둔기를 절개하여 굴곡근과 신전근 사이의 대퇴골을 노출시킵니다.대퇴골이 관찰될 수 있게 되면 뼈 아래에 U자형 막대를 삽입하고 창실을 설치합니다. 두 개의 너트를 사용하여 바를 창에 고정합니다. 그런 다음 집게로 너트를 조입니다.겸자를 사용하여 굴곡근과 신근의 근육 조직을 원래 위치로 다시 조정합니다. 뼈와 창실 사이의 공간을 치과용 시멘트로 채워 창실을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 마이크로 드릴을 사용하여 6 x 2mm 영역을 피질 뼈에 갈아서 골수강에 광학적으로 접근합니다.뼈의 거의 투명한 골막층을 얻었을 때, 8mm 커버 글라스를 창문에 놓고 스냅 링을 사용하여 커버 글라스를 제자리에 고정합니다. 이제 5-0 봉합사와 바늘 홀더로 진피를 봉합합니다. 그런 다음 깨끗한 침구가 있는 새 케이지에 마우스를 넣고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.창 챔버를 통해 결합된 다광자 및 컨포칼 현미경 이미지를 얻으려면 먼저 적절한 형광 혈관 구조 호중구 라벨링 용액을 꼬리 정맥으로 마우스에 주입합니다. 창 챔버의 끝을 악어 클립으로 고정하여 마우스를 맞춤형 스테이지에 고정합니다. 그런 다음 이미징 스테이지를 결합된 다광자 및 컨포칼 현미경에 놓습니다.마우스가 고정되면 이광자 레이저와 컨포칼 시스템을 켜고 시스템 시작을 클릭하여 이미지 획득 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 채널을 설정하려면 Acquisition(획득) 탭에서 Smart Setup(스마트 설정)을 클릭하고 이미징할 레이저를 선택합니다. 최상의 신호를 선택하고 적용을 클릭합니다.레이저 창에서 이광자 레이저를 켜고 2차 고조파 생성을 위한 적절한 획득 파장을 설정하여 2차 고조파 생성 이미지 획득 채널을 수동으로 추가합니다. Locate(찾기) 탭에서 Oculars online(접안렌즈)을 클릭하고 육안 검사를 통해 현미경을 통해 관심 영역을 찾습니다. 오프라인에서 오구형을 클릭하고 획득 탭을 엽니다.Channels 창에서 FITC Track을 선택하고 Live를 클릭하여 5x 대물렌즈가 있는 FITC-Dextran 이미지를 미리 봅니다. 필요에 따라 초점을 조정합니다. 그런 다음 Acquisition 탭에서 Stop을 클릭하여 미리보기를 중지합니다.이제 20x 물 대물렌즈를 수동으로 선택하고 FITC-Dextran 이미지를 다시 보고 채널 창 아래의 마스터 게인과 핀홀을 조정하여 최상의 신호와 대비를 얻을 수 있습니다. 세 채널 모두에 대해 최적의 이미지를 얻었으면 채널 창에서 모든 채널을 선택하고 수집 탭에서 스냅을 클릭하여 2D 스냅샷을 획득합니다. 다음으로, 2D 타임랩스 이미지를 획득하려면 시계열을 선택하여 시계열 창을 열고 간격에 0을 입력하고 총 스캔 수에 40을 입력하여 시간 간격 없이 연속적으로 40개의 이미지를 얻습니다.이미지를 분석하려면 해당 이미지 분석 소프트웨어를 열고 이미지 파일을 엽니다. 타임랩스 이미지를 사용하여 개체 트랙을 생성하려면 Surpass 보기에서 분석할 이미지를 열고 주황색 점 이미지가 있는 아이콘을 클릭하여 새 스폿 창을 엽니다. 추적 매개 변수를 설정한 후 감지된 모든 개체로 갭 채우기 상자를 클릭하여 추적을 시작합니다.파란색 화살표를 클릭하여 다음 단계로 이동합니다. 필터 유형에서 트랙 기간 필터를 선택하고 녹색 화살표를 클릭하여 추적을 완료합니다. 그런 다음 생성된 트랙을 확인하고 필요에 따라 이전 단계로 돌아갑니다.타임랩스 이미지의 오브젝트 트랙에 의해 정의된 셀룰러의 움직임을 측정하려면 트랙 편집 창에서 트랙 상자를 선택하고 관심 셀의 움직임에 해당하는 트랙을 선택합니다. 선택한 트랙은 시계열 이미지에서 노란색으로 강조 표시됩니다. 마지막으로 Statistics 탭에서 그래프 이미지가 있는 아이콘을 클릭하여 Statistics 창을 엽니다.그런 다음 선택에서 아래쪽 화살표를 클릭하여 트랙 속도 평균을 생성합니다. 골수 내의 혈관 구조는 FITC-Dextran과 같은 혈관 내 염료로 시각화할 수 있습니다. 대비는 염료의 주입에 따라 달라지기 때문에 획득된 이미지는 충분한 혈류가 있는 기능적 혈관 구조를 나타냅니다.서로 다른 시점에 있는 골수의 동일한 영역에 대한 이러한 이미지는 며칠 동안 혈관 내 및 혈관 외 공간 모두에 호중구가 존재한다는 것을 보여줍니다. 주로 콜라겐 섬유로 구성된 이 피질 뼈의 이미징은 2차 조화 발생에 의해 수행되었으며, 이는 호중구에 의한 혈관 조직의 침투를 더욱 보여줍니다. 이러한 호중구는 각 스캔 사이에 추가 시간 간격 없이 골수 혈관 틈새에서 추적되어 움직임을 정확하게 추적할 수 있었습니다.그런 다음 이미지 분석 소프트웨어에 의해 생성된 트랙의 속도를 측정하여 각 셀의 속도를 분석할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 생체 외 라벨 세포 또는 형질전환 리포터 마우스를 사용하는 것과 같은 다른 방법을 사용하여 종양 진행 및 전이에 대한 면역 세포의 영향과 같은 다른 생물학적 과정을 현장에서 평가할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 골수 혈관 틈새와 콜라겐 구조를 통해 호중구를 추적하기 위해 쥐 대퇴골에 창문 챔버를 설치하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 마우스를 희생하지 않고 대퇴골수(BM)를 연속적으로 샘플링하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 시간 경과에 따른 마우스의 BM 구성에 대한 종단 연구를 용이하게 하고 생체 외 및 이식 연구를 위해 BM 내 세포에 대한 직렬 액세스를 제공합니다.

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

여기서, 우리는 투과 전자 현미경 검사법(TEM)을 사용하여 시투에서 거대 카르요세포의 초구조를 분석하는 프로토콜을 제시한다. 뮤린 뼈 졸은 수집, 고정, 에폭시 수지에 내장및 초박형 섹션에서 절단됩니다. 대조 염색 후, 골수는 120 kV에서 TEM 현미경으로 관찰된다.

시투에서 전염 전자 현미경 검사를 사용하여 뮤린 메가 카요포이스의 탐사

우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

생체 내 현미경 검사를 통해 조직 재생 및 종양 발달과 같은 동적 생물학적 과정을 연구할 수 있습니다. 매우 역동적인 조직인 calvarial bone marrow는 조혈과 혈관 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 생체 적합성 3D 프린팅 머리 고정 임플란트를 사용하면 반복적인 종방향 이미징이 가능하여 조직 역학 및 종양 미세환경에 대한 이해가 향상됩니다.

Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow(갈바리골수에서 혈관 역학의 생체 내 종단 영상)

쥐 골수 손상 모델은 막내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 단순화된 수술 프로토콜은 새로운 뼈 형성 및 손상 후 세포 반응의 다운스트림 평가를 위한 골수 절제 절차를 설명합니다.

쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

학습하세요 쥐 대퇴골 창 회의소 모델을 이용한 생체 내 중성구 추적 방법입니다. 다광자 형광 현미경으로 혈관 및 골수 내 면역세포 역학을 장기간 관찰하여 감염과 종양 연구에 활용할 수 있습니다.

대한 대퇴골 창 회의소 모델

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