Name: 적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다 Coxiella burnetii의 siRNA를 음소거시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 배우세요 Coxiella burnetii의 이펙터 단백질 전좌 효율을 siRNA 유전자 침묵화와 FRET 기반 리포터 분석을 결합하여 검사하는 방법을. 이 기법은 세포 미생물학에서 숙주-병원체 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 HJN에 수여된 NHMRC(National Health and Medical Research Council) 보조금(Grant ID 1062383 및 1063646)의 지원을 받았습니다. EAL은 Australian Postgraduate Award의 지원을 받습니다.

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분비 시스템, 세균 이펙터 단백질의 숙주 세포의 세포질에서 이러한 시스템의 전송은 많은 병원성 박테리아가 복제 성 고유 한 틈새 내에서 감염을 확립 이용하는 중요한 독성 성분이다. 많은 연구 그룹의 초점은 세균 이펙터 호스트 단백질 및 숙주 세포에서이 경로 이펙터가 영향 사이의 상호 작용을 조사했다. 매우 제한된 조사있는 경우 호스트 단백질 성공 세균 이펙터 전위 필요한 될 가능성을 검토했다. 이 연구에서 우리는 의무적 세포 내 병원균 Coxiella burnetii의, 인수 공통 Q 발열의 원인이 에이전트를 사용했다. 숙주 세포에 진입 한 후, Coxiella 함유 공포는 수동적으로 매우 높은 숫자에 복제 산성 리소좀 유래 공포를 도달 할 때까지 정규 세포 내 이입 경로를 통해 트래 피킹. 별도로 ADVANTA을 복용에서일반 호스트 인신 매매 경로의 GE는 성공적인 복제 성 틈새 시장을 구축하기 Coxiella의 능력은 기능 ...

Coxiella burnetii의는 인수 공통 인체 감염 Q 열병을 일으키는 독특한 세포 내 병원균이다. 이 질환은 증상이 혈청에서 종종 노출 한 후 심내막염 년으로 나타난다 생명을 위협하는 만성 감염 연장 임상 프레 젠 테이션의 광범위한 스펙트럼과 연결됩니다. 인간의 감염은 주로 반추 동물, 특히 젖소, 양, 염소 감염의 주요 저수지와 오염 된 에어로졸의 흡입을 통해 발생합니다. 이러한 동물 Coxiella 감염은 일반적으로 무증상이지만 감염 낙태를 트리거 할 수 있으며, 유체 출산 및 태반 내의 상당한 세균 부하는 한 로컬 환경을 오염시킬 수있다. 공중 보건과 농업 산업 모두 최근 네덜란드 2에서 발생한 Q 열병 발생이 관찰되었다에 엄청난 부담 등 오염의 예는 수 있습니다. 2007 년과 사이2010, Q 열병 4,000 통해 인간의 경우는 진단받은이 발발은 염소 농장 3의 중요한 오염에 연결되었다. 또한, Coxiella 인해 심각한 이환율과 사망률 (4)을 일으킬 수있는 박테리아와 필요한 낮은 전염성 선량의 환경 안정성에 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류로, 잠재적 인 생물학적 무기입니다. Coxiella은 두 단계에 존재하는 천연 소스에서 고립 된 단계 I 생물은 매우 악성이며, 단계 II 생물이 높은 생체 내에서 감쇠된다. 예를 들어, Coxiella burnetii 나인 마일 단계 I 생물의 여러 체외 통로 후, 단계 II 박테리아가 절단 된 리포 폴리 사카 라이드의 결과로 돌이킬 수없는 염색체 삭제를 포함하는 제조 하였다 (LPS) 5. 이 균주, C. burnetii NMII는 조직 배양 모델 I, 위상 표현형 유사하고 안전한 모드를 제공한다연구진은 실험실 5 Coxiella의 발병 기전을 연구하기위한 리터. 최근 몇 년 동안 몇 가지 혁신이 빠르게 Coxiella 유전학의 분야를 전진했다. 특히, 무균 매체의 개발 (시트르산 시스테인 매체 산성화 - ACCM-2)는 모두 액체 및 고체 배지에 6,7 Coxiella의 무 세포 성장을 허용했다. 이것은 유도 유전자 발현 시스템, 셔틀 벡터 및 랜덤 트랜스포존 시스템 8-11 포함 Coxiella 가능한 유전 도구 직접 개선 결과. 가장 최근에, 대상 유전자의 불 활성화에 대한 두 가지 방법이 특정 독성 유전자 후보 (12)를 조사하기위한 방법을 포장, 개발되었다. 폐포 대 식세포에 의해 내재화 이어 Coxiella는 막 결합 구획 내에 높은 번호에 복제는 액포 (CCV)을 함유 Coxiella- 불린다. CCV는 호스트 세포 내 이입 매매 일이 필요합니다거친 초기와 후기 엔도 좀이 리소좀 유래 세포 기관 (13)에 성숙 할 때까지. 이 과정을 통해 상기 CCV 중 하나가 일시적으로 나타나거나 포함 액포와 연관되지만 Rab5, Rab7, CD63 및 LAMP-1 13-15에 한정되지 유지 숙주 요인을 취득한다. 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제는 완전한 기능 도트 / ICM 형 IVB 분비 시스템 (T4SS) 8,16,17에 전적으로 의존한다. 이 분비 시스템 ancestrally 공액 시스템과 관련된 여러 단백질 구조 및 박테리아 단백질을 제공하기 위해 모두 세균과 액포 막에 걸쳐 호스트 세포질 18에, 이펙터 불린다. Coxiella T4SS는 기능적으로 레지오넬라 뉴모 필라 (19, 20)의 잘 특징 유형 IVB 점 / ICM 분비 시스템과 매우 유사합니다. Coxiella이 리소좀 유래 산성에 도달 할 때까지 흥미롭게 T4SS 이후 이펙터 전위의 활성화가 발생하지 않는다세포 기관, 약 8 시간 게시물 감염 17,21. 현재까지 130여 점 / ICM 이펙터는 9,17,22-24를 확인되었습니다. 이 이펙터의 대부분은 가능성이 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제시 중요한 역할을; 단, 약간의 이펙터 기능 25-29 특성화되었다. 본 연구에서 우리는 숙주 세포의 세포질 내 β-lactamase의 활성을 통해 (이하 BLAM 기판이라 함) CCF2-AM FRET 기판 (도 1)의 절단에 의존하는 형광 기반 전위 분석을 이용한다. 관심의 유전자는 구성 적 발현을 제공하는 리포터 플라스미드에 β-lactamase를 (연기하는거야)-1 TEM 융합된다. BLAM 기판을 FRET 쌍을 형성하는 두 개의 형광 발색단 (쿠마린 및 플루오 레세 인)로 구성되어있다. 플루 오레 신 및 이펙터 전위의 부재하에 녹색 형광 발광의 FRET의 쿠마린의 여기 결과; 그러나, 만약 즐M 이펙터 융합 단백질은 호스트 세포질로 전좌하고, 얻어진 β-lactamase의 활성을 절단 여진 다음 청색 형광 방출을 생산 FRET 쌍을 분리 BLA​​M 기판의 β 락탐 고리. 이 전위 분석이 잘 C. 등 다양한 세포 내 및 세포 외 박테리아의 범위에서 이펙터 단백질을 식별하는 방식으로 입증되었다 burnetii, L. 뉴모 필라, L. longbeachae, 클라미디아 트라코마 티스, 장내 유해 E. 대장균, 살모넬라 균 및 브루셀라 17,30-35. Coxiella 이펙터 전위 특정 숙주 인자의 역할을 결정하기 위해 우리는 특히 작은 간섭 RNA의 (siRNA의), RNA 간섭으로 알려진 유전자 침묵을위한 확립 된 방법을 이용한다. 원래 예쁜 꼬마 선충에서 발견, RNA 간섭은 타고난 defe에 사용되는 보존 내생 세포 과정바이러스에 대한 NSE뿐만 아니라 유전자 조절 (36, 37). 서열 - 특이 적 siRNA를 바인딩 한 후 mRNA를 분해 특정 유전자 침묵 또는 최저 38 결과 (RNA 유도 침묵 복합체) RISC 통해 발생한다. 이 연구에서의 siRNA가 세포 내 이입 경로의 중요한 레귤레이터 두 호스트 단백질 Rab5A 및 Rab7A를 대상으로 하였다. 이펙터 전위에 Rab5A 및 Rab7A 입을의 영향 C.을 사용하여 확인 하였다 burnetii pBlaM-CBU0077. 것은 이미 Coxiella 17 도트 / ICM 분비 시스템 전좌 것으로 나타났다 CBU0077로 선택 하였다. siRNA의 유전자 사일런 여기 기재된 fluorescencebased 전위 분석 양쪽을 이용하여 우리는 Coxiella 이펙터 단백질의 전위에 숙주 인자의 역할을 설정하기 시작한다. 이 방법은 유사한 secretio 소유 모두 세포 내 및 세포 외 박테리아의 넓은 범위에 적용될 수있다이펙터 단백질의 전위에 대한 책임 N 시스템.

<table><tbody><tr><td>< 강> 시약< / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>시그마</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>구연산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>인산 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>60218</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr>염화<td>마그네슘</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>: 염화칼슘</td>, <td>시그마</td><td>C5080</td>, <td>ACCM-2 중간 구성 요소</td></tr>, <tr><td>황산철</td>, <td>Fisher</td><td>S93248</td>, <td>ACCM-2 중간 구성 요소</td></tr><tr><td>, 염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S9625</td>, <td>ACCM-2 중간 구성 요소</td></tr>, <tr><td>L-시스테인</td><td>, 시그마</td><td>C6852</td>, <td>ACCM-2 중간 구성 요소</td></tr>, <tr><td>Bacto-neopeptone</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 중간 구성 요소 구성 요소</td></tr><tr><td>카사미노산</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 중간 구성 요소</td></tr><tr><td>메틸 베타 사이클로덱스트린</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 중간 구성 요소</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 중간 구성</td></tr><tr><td>요소 Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>박테리아 배양용</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus 비표적 대조군 풀 (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>비표적 제어</td></tr><tr><td>siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>세포 사멸을 일으킴; transfection 효율 측정</td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA 완충액</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>멸균 RNase가 없는 물을 사용하여 5x siRNA 완충액을 1x siRNA 완충액으로 희석</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 형질주입 시약</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>형질주입용</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>형질주입에 사용되는 환원</td></tr>혈청 <tr><td>배지 DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>세포 배양 및 감염</td></tr><tr><td>열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>대체 등가 제품</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Coxiella 균주 보관용</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>0.05% 트립신 + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>gDNA 추출을 위해 대체 등가 제품을 사용할 수 있음</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>qPCR 반응에 동등한 대체 qPCR 마스터 믹스 제품 사용 가능</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G 로딩 키트(CCF2-AM</td><td>Invitrogen 포함)</td><td>K1032</td><td>형광을 사용한 전좌 측정 및 6X 로딩 용액 (용액 A, B, C 및 DMSO 포함)</td></tr> <tr><td>수산화 나트륨</td><td>머크</td><td>106469</td><td>프로프로브 니치 용액 구성 요소</td></tr><tr><td>인산 나트륨 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>71505</td><td>프로베니치드 용액 구성</td></tr><tr><td>요소 디 나트륨 수소 오르토 인산</td>염 <td>머크</td><td>106586</td><td>프로베니시드 용액 구성 요소</td></tr><tr><td>: Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Probenicid 용액 구성 요소</td></tr><tr><td>: DRAQ5 형광 프로브 솔루션(5mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>세포 viablity를 결정하기 위한 핵 염색. PBS에 희석된 1:4000을 사용합니다.&nbsp;</td></tr><tr>PBS <td>Sigma</td><td>P6148</td><td>의 4% PFA(파라포름알데히드) 용액</td><td>HeLa 229 세포용 고정 용액</td></tr><tr><td>25cm2 통풍 캡이 있는 조직 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>박테리아 균주</td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear 바닥 검은색 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, Sterile</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 조직 배양 플라스크(벤트 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>430641</td><td>HeLa 229 세포 성장용</td></tr><tr><td>175cm2 조직 배양 플라스크(벤트 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>431080</td><td>HeLa 229 세포 성장용</td></tr><tr><td>혈구계</td><td></td><td></td><td>HeLa 229 세포 정량화용</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 웰 PCR 플레이트</td><td>4titude 4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>qPCR용 반응</td></tr><tr><td>8-뚜껑 체인, 플랫</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>qPCR 반응</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench top microfuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 볼텍스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>오비탈 믹서</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>세균 배양 펠릿화용</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>gDNA 정량화용</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR 기계</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>7일 배양에서 Coxiella 게놈 정량화용</td></tr><tr><td>ClarioSTAR microplate 리더</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>형광 측정용</td></tr></tbody></table>

적용 형광 공명 에너지 전달 (fret)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; coxiella burnetii의</em&gt; sirna를 음소거시

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii의, Q 발열의 원인 물질은 복제 성 틈새를 확립 타입 IV 도트 / ICM 분비 시스템에 의존하여 세포 내 병원체이다. 이펙터의 코호트는 호스트 프로세스를 조작 및 복제에 대한 고유 리소좀 유래 액포의 확립을 허용하는 숙주 세포에 본 시스템을 통해 전좌된다. 특정 유전자의 siRNA를 이용하여 침묵과 β-lactamase의 활성에 의존하는 FRET 기반의 기판을 사용하여 이펙터 전위 측정 : 여기에 제시된 방법은 두 개의 잘 확립 된 기술의 조합을 포함한다. 이 두 접근 방법의 적용, 우리는 박테리아 분비 시스템 기능 및 이펙터 전위에서 호스트 인자의 역할을 이해하기 시작할 수있다. 이 연구에서 우리는 Rab5A과 Rab7A, 모두 세포 내 이입 인신 매매 경로의 중요한 규제 기관의 역할을 조사했다. 우리는 이펙터 translocatio의 감소 중 단백질 결과의 발현을 침묵 입증N 효율. 이러한 방법은 또한 쉽게 분비 시스템을 이용하는 다른 세포 및 세포 외 병원체를 조사하도록 변형 될 수있다. 이러한 방식으로, 세균 이펙터 전위에 관련된 호스트 요인 글로벌 영상이 드러날 수있다.

이 연구를 들면, C. CBU0077 이전 Coxiella 도트 / ICM 분비 시스템 (17)의 전좌 이펙터로 도시 된 바와 같이 burnetii pBlaM-CBU0077 균주를 선택 하였다. 앞서 감염, 칠일 C.의 게놈 / ㎖의 총 개수 burnetii pBlaM-CBU0077 배양 물을 사용 qPCR에 열거 하였다. (4)는 순환 액의 예를 보여주는 도표 (TR) 값은 다음의 두 qPCR에 표준 샘플 예상. 4.3.3에 설명 된대로 (증폭 플롯 (그림 4B)과 수치 (그림 4C)에 그래픽으로 표시) 중부 표준시 값은 수출 및 분석 하였다. 도시 대표 데이터에 기초하여, 10 mL로 재현 탁 세균 배양 <strong...

세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 특정 호스트 프로세스가 박테리아 병원체의 이펙터 단백질 전위 능력에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 이 방법은 세포 미생물학 분야의 핵심 질문, 특히 호스트가 박테리아 독성 이펙터의 호스트 세포 내 전달을 차단하거나 촉진하는 과정에 어떻게 관여하는지에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 두 가지 기성 기술, 즉 siRNA 유전자 침묵과 박테리아 단백질 전위 측정을 위한 리포터 분석법을 결합했다는 점입니다. 이를 통해 병원체와 진핵세포 간의 상호작용을 조사할 수 있습니다.이 방법은 coxiella의 병원성에 대한 통찰을 제공하며, 효율적인 단백질 전이에 의존하는 다른 박테리아의 숙주-병원체 상호작용 연구에도 적용될 수 있습니다. 예를 들어, chlamydia, salmonella 및 부착성 침입성 E.coli 등이 이에 해당합니다. CBU0077을 발현하는 C.burnetii를 배양한 후, 통기성 캡이 있는 25 cm² 배양 플라스크에서 텍스트 프로토콜에 따라 betalactamase를 융합시키십시오.3 µg/mL의 chloramphenical이 함유된, 미리 가온된 ACCM2 10 mL에 박테리아 20 µL를 접종합니다. 5% CO₂ 및 2.5% O₂ 조건의 37 °C에서 7일 동안 배양합니다. HeLa 세포에 siRNA를 역전달하기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 siRNA를 준비한 후, 사용 전 DMEM + 10% FCS, 0.05% trypsin EDTA 및 PBS를 37 °C 항온 수조에서 30분 동안 가온합니다.각 실험용 siRNA transfection을 위해, 개별 마이크로 퓨젠 튜브에 0.4 microliters의 transfection 시약과 63.6 microliters의 저혈청 배지를 혼합합니다. 모든 마이크로 퓨젠 튜브를 볼텍싱하고, 성분들이 복합체를 형성하도록 상온에서 5분 동안 둡니다. transfection 복합체가 들어 있는 각 마이크로 퓨젠 튜브에 해당 실험용 siRNA 16 microliters를 첨가합니다.그 후 볼텍싱하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 20분간의 배양 시간 동안, 멸균된 검은색 평평한 투명 바닥 96-웰 트레이의 적절한 웰에 transfection 시약, 저혈청 배지 및 siRNA 혼합물 20 µL를 넣습니다. 또한 20분 배양 시간 동안, 미리 데운 PBS 10 mL를 사용하여 75 cm² 플

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Shi, J. 외. 식물 병원체의 분비 효과자로부터 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 확인. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 Nicotiana benthamiana 16c에서 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과 단백질을 규명하기 위한 공동 침투 분석 방식을 보여줍니다. 형광 리포터와 후보 효과기 유전자가 아그로박테리움 을 통해 식물 잎에 전달됩니다. 일반적으로 RNA 침묵은 보고자 전사체를 분해하여 형광을 감소시킵니다. 억제 효과기가 이 반응을 차단하여 형광을 보존합니다. 이 분석법은 숙주 방어를 방해하는 미생물 효과자를 빠르고 시각적으로 스크리닝하는 방법을 제공합니다.

식물 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과자를 선별하기 위한 공동 침윤 분석법

여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을...

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

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III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 이펙터 전좌는 그람 음성 박테리아 사이에서 일반적인 독성 전략입니다. 전좌의 정량 분석을 위한 beta-lactamase effector fusion 기반 분석법을 적용했습니다. Yersinia에 감염된 세포에서 베타-락타마제에 의한 FRET 리포터의 전환은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

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이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

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단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

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Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화)

배우세요 Coxiella burnetii의 이펙터 단백질 전좌 효율을 siRNA 유전자 침묵화와 FRET 기반 리포터 분석을 결합하여 검사하는 방법을. 이 기법은 세포 미생물학에서 숙주-병원체 상호작용 연구에 활용됩니다.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다

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