Name: 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 학습하세요 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 생쥐 뇌 미토콘드리아 형태와 분포를 3D로 분석하는 방법을. 이 기법은 신경퇴행성 및 신경발달 장애 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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기술적인 도움을 주신 Sidney Walker님께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 보조금(1R01EY024712-01A1)으로 부분적으로 지원되었습니다.

윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 버지니아 공대에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 주의 :이 프로토콜에 사용되는 여러 구성 요소를 처리하고 폐기 할 때 극단적 인 예방 조치가 취해 져야한다. 사용하기 전에, 제도적 지침 및 건강과 안전 사례 지역은 특히 인 중금속과 방사능 소스, 납, 질산 모두이다 휘발성 매우 유독 산화 오스뮴, 우라 닐 아세테이트, 대한, 설립 따라야합니다 중금속 독. Thiocarbohydrazide (TCH)을 잘못 취급하면, 폭발과 유독 가스를 생산하기 위해 분해 할 수 있습니다. 많은 기관이 시약은 일상적으로 사용하고 도움을 제공 할 수있는에 EM의 핵심 시설을 제공합니다. 뇌 조직과 SBFSEM 이미징 1. 준비 <ol><li> 5 % isoflura - 4를 사용 - (4 개월 ~ 2) C57 블랙 마우스 (C57BL / 6J 변형) 젊은 마취네브라스카 제도적 지침에 따라. 근육, 자발적인 움직임과 꼬리 핀치 같은 혐오 자극에 대한 반응의 부족의 손실을 모니터링하여 마취를 확인합니다. </li><li> 해부 트레이에 마우스를 고정하고 복부 중간 선을 따라 피부에 절개를합니다. 마우스의 갈비뼈를 노출 피부에 더 절개를합니다. 다이어프램을 절개 조심스럽게 뛰는 심장을 노출하기 위해 주변을 따라 흉강을 절개 한 후 우심방에 절개를합니다. </li><li> 나비 캐 뉼러를 사용하여 좌심실을 cannulate. 방혈은 간장의 색의 변화에​​ 의해 확인 될 때​​까지, 인산 완충 식염수 (PBS) pH를 7.2 ml의 20 - 10로 transcardially를 사용하여 마우스를 관류. 참고 간의 색의 변화는 방혈의 범위를 결정하는 기준으로 사용된다. 적갈색의 간 색상 변경 핑크 창백 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 2 % glutar 20ml를 -로 transcardially 10을 이용하여 마우스를 관류알데히드와 4 % 파라 포름 알데히드는 내에서 신속하게 뇌 조직을 고정, 0.10 M cacodylate 완충액 (pH 7.2)에했다. 고정은 꼬리 보강을 관찰 모니터링합니다. pH를 조정하고, 물 100ml로 볼륨을 만드는 염산, 80 ㎖의 물에 cacodylate 나트륨 2.14 g을 용해하여 0.10 M cacodylate 완충액 (pH 7.2)를 준비 참고. </li><li> 관류를 따르면, 마우스 참살 O 4 ℃에서 48 시간 동안 0.10 M 소듐 cacodylate 완충액 (pH 7.2)를 함유하는 2 % 글루 타르 알데히드 및 4 % 파라 포름 알데히드로 고정 하였다 뇌를 절개 </li><li> 48 시간 후, vibratome를 사용하여 400 ㎛의 코로나 부분을 확인하고 조심스럽게 해부 현미경 (42)에서 (예를 들면, 해마) 뇌의 관심 영역을 해부. 조심스럽게 조직을 잘라와 방향을 유지하기위한 사진 촬영을합니다. 참고 SBFSEM에서 조직 염색 후 처리 방법은 중금속 염색 방법의 다양한 결합순서는 해상도를 개선하고 Deerinck 등 (40)에 의해 이전에 개발 된 방법에 기초한다. </li><li> 글루 타르 알데하이드 고정 조직 3 회, 5 분 0.1 M cacodylate 완충액 (pH 7.2)의 각을 씻으십시오. </li><li> 0.1 M 나트륨 cacodylate 완충액 (pH 7.2)에 탄닌산을 용해시켜 0.1 % 탄닌산 용액을 제조 하였다. 용해 될 때까지 소용돌이 필요한 경우, 0.45 μm의 필터를 통해 필터링합니다. </li><li> 실온에서 60 분 - 접미사는 cacodylate와 조직은 30 일 ml의 시약에 배양하여 탄닌산 0.1 % 버퍼링. 참고 : 배양 시간은 조직의 크기에 의존하지만, 30 분은 대부분의 조직에 가장 적합합니다. </li><li> 조직 3 회, 5 분 cacodylate 버퍼의 각 (산도 7.2)를 씻으십시오. </li><li> H 2 O 증류수 10 ㎖ (DH 2 O) 0.3 g 칼륨 페로와 0.86 g 나트륨 cacodylate을 녹인다. 얼음에 페로 시안화 칼륨 용액을 유지합니다. 그냥 사용하기 전에, 4 %의 산화 오스뮴의 10 ㎖ (OSO 4)를 추가합니다. </li><li> 2 %의 운영 체제와 조직을 얼룩얼음에 90 분 동안 중요한 어 - 페로 솔루션. DH 2 O 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오 </li><li> 10 ml의 DH 2 O 0.1 g TCH를 용해하여 1 % thiocarbohydrazide (TCH) 솔루션을 준비 완전히 용해 될 때까지 매 10 분 소용돌이에 의해 60 ℃에서 녹인다. TCH를 처리하는 동안 밖으로 건조, 고온, 또는 허용하는 용액에 금속의 사용, 난방을 방지하기 위해주의를 기울여야 특히, 안전주의 사항을 준수하십시오. </li><li> 실온에서 20 분 동안 새로 제조 1 % TCH와 샘플을 취급합니다. DH 2 O 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오 </li><li> DH 2 O로 2 % 4 % 4 OSO 희석, 1 시간 동안 배양하여 2 % 수용액 산화 오스뮴으로 염색 조직. DH 2 O.과 조직 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오 </li><li> 4 ° C에서 DH 2 O의 1 % 우라 닐 아세테이트 샘플 O / N을 품어. </li><li> (Deerinck 등 (40)에 의해 설명 된 바와 같이) 월튼의 리드 아스 파르 테이트 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 250 ml의 DH 2 O에서 0.998 g L-아스 파르 테이트를 녹여pH가 5.5에 도달 할 때까지 다음 적하 방식으로 10 N 수산화 칼륨 (KOH)을 추가한다. pH 조정 후, 30 분간 60 ° C로 가열 산 스톡 아스파르트 10 ㎖ 리드 질산 0.066 g을 추가한다. </li></ol></li><li> DH 2 O에 조직을 씻어 60 ° C 오븐에서 30 분 동안 월튼의 리드 아스 파르 테이트 얼룩 품어. DH 2 O 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오 </li><li> 100 % 에탄올,이어서 5 분마다 20 %, 50 %, 75 %, 85 % 및 95 % 에탄올 용액을 냉각하여 알콜 등급 일련의 3 회, 10 분마다 시료를 탈수. 참고 : 열 에탄올 공기에서 물을 흡수로, 갓 열린 병에서 100 % 에탄올을 사용하여 실패를 포함 원인이된다. 긴 배양 큰 조직 샘플 필요합니다. </li><li> 워시 샘플 2 회, 15 분 프로필렌 옥사이드의 각. </li><li> (도데 세닐 숙신산 무수물) 25 ml의 수지 10.5 mL로 DDSA를 사용하여 플라스틱 매립 수지 15.5 mL로 NMA (메틸 나 딕산 무수물) 1 mL로DMP-30 (2,4,6- 트리스 디메틸 아미노 메틸 페놀). 진탕하여 수지를 혼합한다. 스핀과 수지가 거품 해결 될 때까지 방치한다. 참고 :이 표준 매체 경도 조리법이다. 전자 현미경 (EM)의 플라스틱 수지의 다른 종류를 사용할 수 있지만, 모든 수지 SBFSEM 작동하지 사전에 필수적이지 않은 대조군 샘플에서 테스트되어야한다. </li><li> 10 시간 - 산화 프로필렌은 약 8 시간에 걸쳐 증발되도록 2 시간 후, 초기 다음 캡핑 캡핑 바이알에, 매립 수지 및 프로필렌 옥사이드 50 믹스 : 50에 조직 O / N을 인큐베이션. </li><li> 2 시간 동안 깨끗한 유리 병에 100 % 신선한 매립 수지에 조직을 전송합니다. </li><li> 플랫 형 신선한 매립 수지에 포함 된 샘플은 종이 라벨을 인쇄하고, 48 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 경화을 함유. 약 1 시간 후에, 다시 조직 배치와 정렬을 확인하고 필요하다면 조정한다. </li><li> 관심 영역 샘플을 잘라 내고 gellin를 이용한 알루미늄 핀 마운트g 시아 노 아크릴 레이트의 순간 접착제 또는 도전 에폭시 수지는 다음 콜로이드 실버 코팅 알루미늄 핀에 도전로를 제공하는 블록의 측면 주위에 붙여. </li><li> 인 - 실을 Ultramicrotome 단계 낮은 kV의 후방 산란 전자 검출기 (32)를 구비 한 주 사형 전자 현미경 시스템을 이용하여 조직 시료를 조사한다. 참고 : 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용에서의 악기와 현장 교육을 구하여 승인 된 사용자가됩니다. 또한, 작은 프로젝트를위한 연구원 또는 핵심 시설과의 협력이 가능할 수있다. 엔진 마케팅 업체는 X 선을 발생으로 방사선 훈련도 필요할 수 있습니다. </li><li> 샘플 이미지, 다음 설정을 사용 : 2.25 kV로, 5시 - 10 nm의 / 픽셀 해상도, 80 사이의 필드 크기 - X 250 μm의, y를 (다른 필드가 가능한 크기), 50의 슬라이스 두께 - 100 nm의, 20 시간의 시간 - 16의 600 조각 - 250의 총. 참고 : 설정은 다른 현미경 사이에 크게 변화, INDI개 별 샘플, 원하는 해상도입니다. 이러한 설정은 많은 샘플 쉽게 해석 할 수있는 이미지를 생성한다. </li></ol> 2. 이미징 데이터 세트를 분석 참고 : 이미지 J / 피지 소프트웨어는 데이터 세트를 분석하는 데 사용하고 TrakEM2 플러그인에 의존한다. 전처리 단계는 다양한 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수 있고, 광범위한이나 숙련도에 따라 보조 할 수 있으며, 스택 얻는다. 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 주요 변형 여기에 설명되어 있습니다 (1.50b 버전 ImageJ에는 피지 시월 (1), 2015 다운로드). <ol><li> 소프트웨어에서 열고 메뉴 항목을 이미지 → 형 → 8 비트를 선택하여 원래의 고유의 16 비트 이미지에서 8 비트 TIFF 형식으로 이미지를 변환합니다. <ol><li> 이 단계에서 자동 명암 / 밝기 변환 이미지에 적합하지 않은 경우, 16 비트 이미지를 다시 누릅니다 이미지 밝기 / 대비 → 조정 →. 모든 이미지 작동 범위를 선택하고 Enter를 누르 적용합니다. 그런 다음 C를 수행onversion. 참고 : 일부 엔진 마케팅 업체에서이 단계는 현미경 제조 업체의 소프트웨어가 필요할 수 있습니다. </li><li> 때문에 조각 사이에 받아 들일 수없는 이미지 움직임에, 필요한 경우 (예. 때문에 충전에 드리프트) / 등록 이미지 스택 (메뉴 항목 플러그인 선형 StackAlignmentWithSIFT → → 등록)을 맞 춥니 다. 대부분의 등록 소프트웨어에서 &quot;번역 전용&quot;모드가 아닌 &quot;강체&quot;을 설정합니다. 많은 접근 방법 및 소프트웨어가 작동 할 수 있습니다 참고 : 많은 응용 프로그램에 대한 SIFT 등록 플러그인 작품과 가상 스택 버전이있다. <ol><li> 필요한 경우, 사전 등록에 (이미지 →이 CanvasSize → 조정) 또는 (자르기 → 이미지) 관심의 영역으로 감소 캔버스 크기를 확대. 일부 드리프트 또는 플레잉이 발생할 수 있으며, 다른 플러그인이나 소프트웨어를 시도하는 것이 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 수동 옵션도 (예를 들면. ImageJ에 / 피지, 플러그인 → 등록 →의 ManualLandmarkSelection)을 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> desir 경우에드, 더 작고 관리 크기로 스케일 이미지 (예. 25 %) ImageJ에 (이미지 → 규모)를 사용. </li></ol></li><li> 소프트웨어 선택 파일 → 가져 오기 → 이미지 시퀀스를 실행 한 후 TIFF 파일을 선택합니다. </li><li> (빈) 새 → TrakEM2 → 파일을 선택하여 플러그인을 시작합니다. 두 개의 창이 열립니다; 하나는 프로젝트 area_lists를 관리하고 다른 트레이스를 관리하고, &#39;캔버스&#39;로 지칭된다. </li><li> 캔버스 가져 오기에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 플러그인으로 이미지 스택을로드합니다. 가져 오기를 선택하고 가져 오기 스택을 클릭합니다. 팝업 옵션에서 가상 스택에 대한 확인란을 선택합니다. 참고 : 이미지 스택은 이미 소프트웨어에 오픈되어 있지만, 그들은 또한 플러그인에서 열려 있어야합니다. 가상 스택의 상자를 선택하면 컴퓨터가 원활하게 실행할 수 있습니다. </li><li> 밉맵이 생성되고, 스택이로드 된 후, 바로 플러그인 창에서 프로젝트 이름을 클릭합니다. 오른쪽 템플릿 COL에 &#39;새 프로젝트&#39;를 클릭UMN, 그 프로젝트에 대한 &#39;새로운 아이를 추가&#39;를 선택합니다. 오른쪽 &#39;area_list&#39;를 선택하기 위해 다시 클릭합니다. </li><li> 캔버스에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 원래의 전자 현미경 설정에 동의하는 프로젝트의 Z 축 스케일을 설정 한 다음 표시를 클릭하고 교정을 선택합니다. 또한, 플러그인 창에서 모든 레이어를 선택하여 Z 스케일을 설정, 오른쪽 규모의 Z와 두께를 선택합니다. </li><li> 클릭하고 &#39;프로젝트&#39;프로젝트는 캔버스 창에서 &#39;Z 공간&#39;탭에서 &#39;지역 목록&#39;을 작성하는 섹션 개체에 모든 &#39;아이들&#39;을 끕니다. </li><li> &#39;영역 목록&#39;을 선택하고 마우스 오른쪽 선택하고 색상을 설정합니다. 이제, 전자 현미경 이미지에서, 이러한 미토콘드리아와 같은 객체를 추적하기 위해 페인트 브러시 도구를 사용합니다. 사용 &#39;Shift + 클릭&#39;밀폐 원 채우기 위해, &#39;Ctrl 키 + 스크롤&#39;확대 및 축소, 그리고 지우개로 페인트 브러시 커서를 설정하는 &#39;Alt + 클릭&#39;. </li><li> 15 μm의 - ~ (10)의 두 영역을 선택(10) - 이미지의 왼쪽 상단과 오른쪽 하단 모서리에 15 μm의 각 데이터 세트에서 미토콘드리아의 편견 샘플링을 할 수 있도록이 지역 내의 모든 미토콘드리아를 식별합니다. </li><li> &#39;캔버스&#39;에서 관찰하고 섹션을 통해 미토콘드리아를 추적. 참고 : 미토콘드리아 비슷한 크기의 아주 어두운 / 고밀도 나타나는 세포 소기관, 직경 느슨하게 원통형이다. 내부 막에 의해 형성된 고유의 cristae이 세포 기관 내부에 쉽게 구별 할 수 있습니다. </li><li> 추적이 완료되면, 오른쪽 Z 공간 탭에서 area_list 클릭 &#39;3D로 표시&#39;를 선택합니다. 이 추적 이미지의 3 차원 재구성을 볼 수있는 3D 뷰어 플러그인을 시작합니다. <ol><li> 미토콘드리아의 부피 측정, 3D 뷰어에서 개체 선택을 수행하려면 &#39;편집&#39;탭을 클릭하고 &#39;개체 속성&#39;을 선택합니다. 미토콘드리아 볼륨 추정치는 여러 가지 다른 측정과 함께 표시됩니다. </li></ol></li></ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다. Emily K Benson은 Renovo Neural Inc.의 유급 직원이며, Grahame J Kidd는 직렬 블록 페이스 SEM 서비스 및 분석의 상업 제공업체인 Renovo Neural Inc.에서 3DEM의 과학 이사로 재직하고 있습니다.

신경 시스템의 복잡성은 적절한 해상도와 미토콘드리아로 큰 조직의 볼륨을 재구성하고, 형태 및 세포 소기관의 분포를 분석에 상당한 도전을 포즈. 뉴런, 올리고 덴드로 사이트와 입체적으로 확장 된 다수의 프로세스와 성상 세포를 포함한 여러 세포는 뇌 조직 (43) 내에서 상호 작용한다. 미토콘드리아는 세포와 먼 프로세스의 소마에 모두 존재하기 때문에, 미토콘드리아 형태는 신경계 (그림 1)에서 매우 다형성이다. 충분한 해상도 적절한 3 차원 구조 정보 그러므로 이러한 촛점 또는 이광자 현미경 (44,45)과 같은 종래의 광학 현미경 기술에 의해 얻어 질 수 없다. 전자 현미경은, 충분히 높은 해상도로 신경 조직에 대량의 재구성을 허용하는 경우에만 현재 이용 가능한 기술이다. 전통적으로, 신경 조직의 3 차원 복원 달성했다얇은 부분 (29)의 직렬 단면 투과 전자 현미경 (SSTEM)에 의해 D. 그러나, 최근의 기술 발전은 볼륨 전자 현미경 ...

미토콘드리아는 세포의 세포 골격과의 긴밀한 상호 작용, 자신의 모양과 휴대 단서 및 필요에 따라 위치를 변경 동적 소기관이며, 이러한 뉴런 1 칼슘 전류와 같은 셀룰러 이벤트에 대한 응답이다. 다른 세포 소기관이 차례로 자신의 역학과 신진 대사 2를 조절 소포체를, 예와 미토콘드리아는 또한 상호 작용합니다. 미토콘드리아 형태, 즉 서로 다른 세포 유형의 이질성을 보여줍니다. 세포 기관의 모양은 시트, 자루 및 타원 3 구성된으로 관에 따라 다릅니다. 미토콘드리아 융합과 분열주기 단백질 위치, 크기, 형상 및 미토콘드리아 (4)의 분포를 조절할 수 있음을 보여왔다. 또한, 미토콘드리아 형상의 변화는 신경 퇴화, 신경 세포의 가소성, 근육 위축, 칼슘 신호, 반응성 산소 종의 생성뿐만 아니라, 수명 및 세포사 연루 그쪽와 연관된T 세포 특이 미토콘드리아 형태는 정상적인 세포 기능 5-11의 유지에 중요하다. 미토콘드리아의 주요한 생체 에너지 함수는 TCA 사이클을 통해 완전한 영양소 파괴 (즉, 글루코스, 지방산 류 또는 아미노산)를 포함하고 OXPHOS 12 경로 대사 된 일련의 반응을 실행함으로써, 아데노신 삼인산 (ATP)를 생성한다. 인간의 뇌는 체중의 2 %에 불과하지만 그것이 ~ 그것을 기관 (13)을 요구하는 매우 에너지 생산을 전체 에너지의 20 %를 소비 구성한다. 인간의 미토콘드리아 기능 장애는 신경 학적 증상 14-17의 큰 숫자에 이르게 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 유전 ~ 1의 유병률과 임상 질환의 이종 집단이다 미토콘드리아 장애 17,18에 ATP 생성 오퍼 손상 OXPHOS 성분 돌연변이 : 5000 개인, 및 m의 가장 흔한 원인 중 하나어린이와 성인 etabolic 장애. 미토콘드리아 유래 ATP의 결핍은 뇌, 심장과 골격 근육은 주로 환자 14,17,18에 영향을받지 높은 에너지를 요구하는 기관으로 여러 기관의 시스템에 영향을줍니다. 최근 몇 년 동안, 여러 연구는 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환 15-17,19,20 모두 미토콘드리아의 기능 장애에 대한 증거를 제공했다. 미토콘드리아 필수적인 뇌 발달과 기능에 중요하기 때문에, 모두 건강하고 질병 상태하에 미토콘드리아 뇌 형태, 구조, 크기, 수 및 분포의 변화를 분석 할 수있는 프로토콜을 개발하는 것이 필수적이다. 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질 (GFP)과 마우스 모델은 뇌 (21, 22)에서 미토콘드리아의 움직임과 현지화를 시각화하기 위해 제작되었습니다. 이것은 미토콘드리아 운동성 일반적인 분포를 조사하기 위해 매우 유용한 도구이지만 포함하여 몇 가지 단점이있다전자 제한된 해상도와 형광 현미경의 감도. 이러한 특성은 어려운 비교적 소형 미토콘드리아를 추적 할 수 있습니다. 마찬가지로, 시리얼 전송 전자 현미경 성공적 시냅스 미토콘드리아 23를보기 위해 사용하지만, 이러한 방법은 매우 시간이 걸리고있다. 미토콘드리아 형태들은 연속 분열 및 융합 사이클을 겪는다으로 매우 동적으로 알려져 있고 대부분의 세포에서 미토콘드리아 고도로 연결된 네트워크 24-26을 유지한다. 뉴런은 매우 그들이이 신경 돌기를 통해 그들의 방법 (그림 1) 확인으로 분리 할 수있는 다수의 수상 돌기 및 확장 축삭과 세포체에 연결된 망상 네트워크를 형성 미토콘드리아와 세포를 편광된다. 이 크기와 모양이 매우 다양 뇌 미토콘드리아를 만든다. 예를 들어, 일련의 블록 표면을 주사 전자 현미경 법을 사용하여 (SBFSEM) 기술, 우리는 이전에 관찰 extrasynaptic mitochondr의 양 또는 크기의 차이16 개의 27 배로 신경 말단에 존재하는 미토콘드리아에 아이오와만큼 할 수있다. 볼륨을 수행하기위한 여러 가지 방법이 있습니다을 Ultramicrotome SEM (30) 수집 시리얼 섹션 TEM (29), 자동화 된 테이프를 포함, 28 분석은, 이온 빔 SEM (31), 및 SBFSEM (32)을 집중했다. SBFSEM 분석은 뇌의 1mm까지의 영역에서 미토콘드리아는 형태 학적 형태, 크기, 분포 및 세포 소기관의 수 정량에 데이터를 제공하는 해상도를 가지고 있다는 장점을 갖는다. 기술적 동작 이전 EM 경험 부족 많은 생물학 실험실의 능력 내에서 데이터 수집 및 분석, 또한 상기 요구하고있다. 직렬 섹션 같은 이미지를 생성하기위한 상용 장비의 출현은 조직의 3 차원 미세 구조 분석을했다 더 신속하고 반복 가능한 방식 (28)의 편견 부피 분석을 허용하는 일상적인 기술, </&gt; SUP. SBFSEM는 우선 신경 회로 (34)의 재구성 분석에 중요한 수단으로이 기술을 확립 한 이후 1981 33. 여러 연구에서 레이튼 도입 아이디어에 기초하여 2004 년 32 신경 생물학의 분야에 기술 하였다. 또한, 많은 작은 규모의 프로젝트를 위해, 그것은 세포 소기관 27,35-39를 식별하기 위해 재구성 분석을 제공합니다. 이후, 획득 된 이미지가 저전압 다시 산란 전자로부터 유도되며, 다른 공지 된 중금속 염색 기법을 결합하여 새로운 염색 프로토콜 해상도 40 높이기 위해 개발되었다. 본 논문에서는 3 차원 전자 현미경 이미징 및 이전에 우리와 다른 사람 38,39,41에 의해 사용 된 방법에 따라 뇌 미토콘드리아의 부피 분석을 활용하기위한 프로토콜을 제공합니다. 티슈 후 처리 방법 바와 Deerinck 등에 의해 설명 된 사용40.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 실험실&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, 상품명 Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Dissection</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>나비 캐뉼라</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>필터(0.45 미크론)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>진동 절편 시스템</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 카코딜레이트</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>탄닌산</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 페로시아나이드</td><td>J.T. 베이커</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 4% 용액</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>티오카르보하이드라지드</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>납 질산염</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 임베딩 키트</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>포함 812&nbsp; 레진, DDSA, NMA, 그리고 DMP-30.</td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드 25 % EM 등급</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td>트 <td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 몰드</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 시편 핀</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>콜로이드 실버 Liquid</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>하드웨어/공예품 상점에서 이 품목을 취급</td></tr>합니다. 전도<tr><td>성 에폭시</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr>SEM <td>Gatan Inc.</td><td>용 챔버 내 초박 절곡기</td><td>3View2</td>는 핀 준비를 위한 <td>다른 SEMs 트리밍 현미경을 위해 디자인될 수</td></tr> 있습니다 <tr><td></td><td>Gatan Inc.</td><td>3View 시스템</td><td></td></tr><tr><td>Low kV 후방 산란 전자 검출기</td><td>Gatan Inc.</td>의 일부로 공급<td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ 피지 프로세싱 패키지&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI 다운로드 2015년 10월 1</td>일<td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/<</td></tr><tr>td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

인간의 두뇌는 주로 연료 공급원으로서 포도당에 의존하는 고 에너지 소비 기관이다. 글루코스는 아데노신 삼인산 (ATP)의 형태로 세포 에너지를 생산 당분, 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클 및 산화 적 인산화 (OXPHOS) 경로를 통해 뇌 미토콘드리아 이화된다. 미토콘드리아 ATP 생산의 손상은 저명한 신경과 myopathic 증상이 임상 적으로 제시 미토콘드리아 질환을 발생합니다. 미토콘드리아 결함도 신경 발달 장애 (예를 들어, 자폐증 스펙트럼 장애) 및 신경 퇴행성 질환에 존재한다 (예 : 근 위축성 측삭 경화증, 알츠하이머와 파킨슨 질환). 따라서, 건강 상태 및 질환 모두하에 미토콘드리아 형태, 구조 및 분포의 3 차원 분석을 수행하기위한 필드에 증가 된 관심이있다. 뇌 미토콘드리아 형태는 특히 일부 미토콘드리아와 함께,에서와 매우 다양하다시냅스 영역 전통적인 광학 현미경의 해상도 한계 이하의 &lt;200 nm의 지름의 범위에있는. 뇌의 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 것은 상당히 공 초점 현미경에 의한 organellar 검출을 향상시킨다. 그러나, 대형 미토콘드리아의 이미지 oversaturating없이 비교적 작은 크기의 미토콘드리아의 검출 감도에 대한 제약을 극복하지 않는다. 시리얼 전송 전자 현미경 성공적 시냅스 신경 세포에서 미토콘드리아를 특성화하기 위해 사용되었지만,이 방법은 매우 시간 소모적 여러 샘플을 비교할 때 특히이다. 시리얼 블록면을 주 사형 전자 현미경 (SBFSEM) 기술은 조직 및 데이터 취득 촬상 블록 절편의 자동화 된 프로세스를 포함한다. 여기서 우리는 신속하게 재구성과 미토콘드리아 형태를 시각화하기 위해 쥐의 뇌에서 정의 된 영역의 SBFSEM을 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 이 기술nique 또한 정의 뇌 영역 미토콘드리아 번호, 볼륨, 크기 및 분포에 대한 정확한 정보를 제공하기 위해 사용될 수있다. 얻어진 이미지 해상도 (일반적으로는 10 nm 이하) 높기 때문에 어떤 형태 총 미토콘드리아 결함은 검출 될 수있다.

우리는 뇌 미토콘드리아 형태와 크기가 다른 신경 하위 구획의 유형이 있음을 보여줍니다. 렌티 바이러스는 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질 도입 저밀도의 연결을 문화에 공 초점 현미경은 말초 신경 돌기에 거주하는 사람들은 개별 연장 된 형태 (그림 1 AB)를 나타내는 반면, 신경 소마에 거주하는 미토콘드리아가하는 망상 네트워크를 형성하는 것으로 나타났다. SBFSEM 기술을 사용하여 미토콘드리아의 형태, 크기, 부피 분포는 마우스 뇌에서 분석 하였다. 미토콘드리아의 3 차원 (3D) 이미지는 마우스 뇌의 해마 신경 돌기 모두와 시냅스로부터 재구성되었다. 시냅스 미토콘드리아는 확인 및 주민 미토콘드리아을 품고 시냅스 부 튼스의 수를 정량화 하였다. 미토콘드리아의 크기 이질성은 인터넷 (축삭 구획 대 수지상에서 관찰gure 1 CD). 또한, 마우스 뇌의 해마에 많은 작은 시냅스 구획 <st...

포유류 뇌 조직에서 미토콘드리아 시각화 및 분석은 어려운 작업입니다. 여기에서는 연속 블록면 주사 전자 현미경(SBFSEM)의 3차원(3D) 재구성 분석을 사용하여 이 중요한 에너지 생성 소기관의 형태학적 및 체적 분석에 대한 통찰력을 얻는 방법을 설명합니다.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

연속 블록면 주사 전자 현미경 기술의 전반적인 목표는 마우스 뇌의 정의된 영역에서 미토콘드리아 형태, 구조, 분포, 부피 및 수를 분석하는 것입니다. 이 방법은 뇌 미토콘드리아 구조, 수 및 분포의 변화가 신경 퇴행성 및 신경 발달 장애에 실질적으로 기여하는지 여부와 같은 신경 생물학의 많은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저진공 주사 전자 현미경 챔버에 내장된 맞춤형 초박 절편을 통합하여 연속 절편을 이미징하는 프로세스를 자동화한다는 것입니다.실험을 시작하기 위해 미리 준비한 글루타르알데히드 고정 조직을 0.1 몰 카코딜레이트 완충액에서 각각 5분씩 3회 세척합니다. 1ml의 카코딜레이트로 조직을 완충시킨 0.1%탄닌산을 실온에서 30분 동안 사후 고정합니다. 포스트 픽싱 후, 카코딜레이트 버퍼로 조직을 씻으십시오.페로시안화칼륨 0.3g과 카코딜레이트 나트륨 0.86g을 증류수 10ml에 녹입니다. 사용 직전에 4% 사산화오스뮴 10ml를 넣고 얼음에서 2% 오스뮴 페로시안화물 용액으로 조직을 90분 동안 염색합니다. 염색 후 조직을 증류수로 씻으십시오.샘플을 갓 준비한 1% 티오카르보하이드라지드 또는 TCH 용액으로 실온에서 20분 동안 처리합니다. 그런 다음 샘플을 씻으십시오. 다음으로, 2% 사산화오스뮴 수용액으로 조직을 1시간 동안 염색합니다.염색 후 증류수로 조직을 씻으십시오. 샘플을 섭씨 4도의 증류수에 1% 우라닐 아세테이트로 밤새 배양합니다. 다음 날, 티슈를 증류수로 헹구고 오븐에서 Welton의 아스파르테이트 납 염색제와 함께 배양합니다.조직의 최상의 염색을 얻는 것은 이미징에 매우 중요한데, 염색이 불량하면 샘플에 하전 현상이 발생하여 이미징이 어렵거나 불가능하기 때문입니다. 조직을 증류수로 씻으십시오. 냉각된 에탄올 용액을 사용하여 등급이 매겨진 일련의 알코올을 통해 샘플을 탈수한 다음 각각 10분씩 3회 100% 에탄올 탈수를 수행합니다.샘플을 프로필렌 옥사이드로 각각 15분 동안 두 번 세척합니다. 임베딩 레진과 프로필렌 옥사이드를 1:1로 혼합하여 조직을 놓고 바이알을 덮고 밤새 조직을 배양합니다. 프로필렌 옥사이드가 9시간 동안 증발하도록 2시간 후에 바이알의 뚜껑을 엽니다.티슈를 깨끗한 바이알에 100% 새로 임베딩된 수지로 2시간 동안 옮깁니다. 인쇄된 종이 라벨이 들어 있는 평평한 틀에 새 포매 레진에 샘플을 삽입하고 오븐에서 경화시킵니다. 1시간 후 조직의 위치와 정렬을 확인하고 필요한 경우 조정합니다.샘플을 관심 영역으로 자르고 겔화 시아노아크릴레이트 슈퍼 글루를 사용하여 알루미늄 핀에 장착합니다. 그런 다음 블록 측면 주위에 콜로이드 은 페이스트로 샘플을 코팅하여 알루미늄 핀에 대한 전도성 경로를 제공합니다. 챔버 내 초박 절편기와 저킬로볼트 후방 산란 전자 검출기가 장착된 주사 전자 현미경 시스템을 사용하여 조직 표본을 검사합니다.이러한 설정을 사용하여 샘플을 이미지화합니다. 이미지, 유형, 8비트를 차례로 선택하여 분석을 시작하여 이미지를 원래의 독점 16비트에서 8비트 TIFF 형식으로 변환합니다. 이 단계에서 자동 대비 및/또는 밝기 변환이 이미지에 적합하지 않은 경우 16비트 이미지를 다시 열고 이미지, 조정, 밝기/대비를 누릅니다.모든 이미지에 적합한 범위를 선택하고 적용을 누릅니다. 그런 다음 변환을 수행합니다. 슬라이스 간에 허용되지 않는 이미지 이동이 있는 경우 Plugins, Registration 및 Linear Stack Alignment with SIFT를 선택하여 이미지 스택을 정렬하고 리지드 바디가 아닌 변환 전용 모드로 정렬을 설정합니다.등록하기 전에 Image, Adjust, Canvas Size를 선택하여 캔버스 크기를 확대합니다. 또는 원하는 영역을 선택한 다음 잘라서 이미지를 관심 영역으로 줄입니다. 필요한 경우 ImageJ를 사용하여 이미지를 더 작고 관리하기 쉬운 크기로 조정한 다음 이미지 및 배율을 선택합니다.저밀도 뉴런 배양에 대한 컨포칼 현미경 검사는 뉴런 소마에 상주하는 미토콘드리아는 망상 네트워크를 형성하는 반면, 원위 신경돌기에 상주하는 미토콘드리아는 별개의 길쭉한 형태를 나타내는 것으로 나타났습니다. 연속 블록면 주사 전자 현미경 또는 SBFSEM 기술을 사용하여 마우스의 뇌에서 미토콘드리아, 수상돌기 및 축삭 정맥류를 명확하게 관찰했습니다. 쥐 뇌 조직의 신경돌기에서 미토콘드리아를 3일 동안 재구성한 결과, 수지상 미토콘드리아와 축삭 미토콘드리아의 크기 차이가 나타났습니다.대표적인 2-D SBFSEM 이미지에서 추출한 데이터는 뉴런 시냅스 전(neuronal presynapse) 내에 존재하는 미토콘드리아의 부피 또는 크기가 시냅스 외 영역에 있는 미토콘드리아보다 현저히 작다는 것을 보여주었습니다. SBFSEM 분석으로 획득한 이미지는 개별 미토콘드리아의 초구조적 특성을 시각적으로 표현할 수 있는 향상된 해상도를 제공합니다. 미토콘드리아의 세포 구획을 분류하는 것은 비시냅스 체세포 미토콘드리아(non-synaptic somatic mitochondria) 및 시냅스전 미토콘드리아와 같이 쉽게 식별할 수 있는 구조에 대한 근접성을 결정함으로써 가능합니다.이 기술은 염색 3일, 수지 경화 2일, 이 분석에 적합한 스택을 생성하기 위한 이미징 1일, 분석 준비를 위한 이미지 후처리에 약 2-4시간을 포함하여 약 7일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 또한 유전적으로 표지된 미토콘드리아를 사용한 실시간 이미징과 같은 미토콘드리아를 이미징하는 다른 방법과 함께 사용하여 미토콘드리아 이동과 미토콘드리아 이동과 그 분열 및 융합의 역학에 대한 질문에 답할 수 있습니다.

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Mukherjee, K., et. al. 연속 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 뇌 미토콘드리아의 분석.J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 준비 과정을 보여줍니다.  미토콘드리아 초미세 구조를 시각화하기 위해 연속 블록 페이스 주사 전자 현미경(SBFSEM)을 사용하여 마우스 뇌 조직의 이미징 및 분석을 통해 축삭 및 수지상 신경 세포 구획의 형태 및 공간 분포를 정밀하게 매핑할 수 있습니다.

 Imaging of Neuronal Mitochondria Using a Serial Block-Face Scanning Electron Microscope(직렬 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 신경 미토콘드리아의 이미징)

공 초점 주사 현미경은 살아있는 동물의 관류 심장이나 골격근에 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징에 적용된다. 수퍼 옥사이드 깜박이고 막 잠재적 인 변동으로 단일 미토콘드리아 프로세스의 실시간 모니터링은 생리학 관련 맥락에서 병리학 섭동 동안 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게한다.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

미토콘드리아 네트워크는 매우 복잡하여 분석하기가 매우 어렵습니다. 새로운 MATLAB 툴은 타임랩스 이미지에서 실시간 컨포칼 이미징 미토콘드리아를 분석하지만, 출력 볼륨이 커서 개별 수동 주의가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 신속한 파일 분석이 가능한 루틴 최적화가 개발되었습니다.

동형 특이적 레티노산 수용체에 의한 살아있는 신경 미토콘드리아 항상성 조절의 최적화된 자동 분석

본 연구는 생쥐 뇌 조직의 면역염색 및 영상 분석을 기반으로 미토콘드리아의 형태를 분석하는 방법을 제시 한다. 또한 이를 통해 파킨슨병 모델에서 단백질 응집에 의해 유도된 미토콘드리아 형태의 변화를 감지할 수 있는 방법을 설명합니다.

파킨슨병 모델에서 미토콘드리아 형태학의 조직학적 검사

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

이 연구에서는 단계별 프로토콜을 설명하고 샘플 준비, 이미지 획득 및 데이터 분석을 포함하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 형태학적 특성을 결정하기 위한 주요 세부 사항을 강조합니다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위해 미토콘드리아 형태를 검사하는 데 일반적으로 사용됩니다.

컨포칼 현미경을 사용한 살아있는 세포의 미토콘드리아 형태 측정

학습하세요 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 생쥐 뇌 미토콘드리아 형태와 분포를 3D로 분석하는 방법을. 이 기법은 신경퇴행성 및 신경발달 장애 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

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