July 9th, 2016
포유류 뇌 조직에서 미토콘드리아 시각화 및 분석은 어려운 작업입니다. 여기에서는 연속 블록면 주사 전자 현미경(SBFSEM)의 3차원(3D) 재구성 분석을 사용하여 이 중요한 에너지 생성 소기관의 형태학적 및 체적 분석에 대한 통찰력을 얻는 방법을 설명합니다.
연속 블록면 주사 전자 현미경 기술의 전반적인 목표는 마우스 뇌의 정의된 영역에서 미토콘드리아 형태, 구조, 분포, 부피 및 수를 분석하는 것입니다. 이 방법은 뇌 미토콘드리아 구조, 수 및 분포의 변화가 신경 퇴행성 및 신경 발달 장애에 실질적으로 기여하는지 여부와 같은 신경 생물학의 많은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저진공 주사 전자 현미경 챔버에 내장된 맞춤형 초박 절편을 통합하여 연속 절편을 이미징하는 프로세스를 자동화한다는 것입니다.
실험을 시작하기 위해 미리 준비한 글루타르알데히드 고정 조직을 0.1 몰 카코딜레이트 완충액에서 각각 5분씩 3회 세척합니다. 1ml의 카코딜레이트로 조직을 완충시킨 0.1%탄닌산을 실온에서 30분 동안 사후 고정합니다. 포스트 픽싱 후, 카코딜레이트 버퍼로 조직을 씻으십시오.
페로시안화칼륨 0.3g과 카코딜레이트 나트륨 0.86g을 증류수 10ml에 녹입니다. 사용 직전에 4% 사산화오스뮴 10ml를 넣고 얼음에서 2% 오스뮴 페로시안화물 용액으로 조직을 90분 동안 염색합니다. 염색 후 조직을 증류수로 씻으십시오.
샘플을 갓 준비한 1% 티오카르보하이드라지드 또는 TCH 용액으로 실온에서 20분 동안 처리합니다. 그런 다음 샘플을 씻으십시오. 다음으로, 2% 사산화오스뮴 수용액으로 조직을 1시간 동안 염색합니다.
염색 후 증류수로 조직을 씻으십시오. 샘플을 섭씨 4도의 증류수에 1% 우라닐 아세테이트로 밤새 배양합니다. 다음 날, 티슈를 증류수로 헹구고 오븐에서 Welton의 아스파르테이트 납 염색제와 함께 배양합니다.
조직의 최상의 염색을 얻는 것은 이미징에 매우 중요한데, 염색이 불량하면 샘플에 하전 현상이 발생하여 이미징이 어렵거나 불가능하기 때문입니다. 조직을 증류수로 씻으십시오. 냉각된 에탄올 용액을 사용하여 등급이 매겨진 일련의 알코올을 통해 샘플을 탈수한 다음 각각 10분씩 3회 100% 에탄올 탈수를 수행합니다.
샘플을 프로필렌 옥사이드로 각각 15분 동안 두 번 세척합니다. 임베딩 레진과 프로필렌 옥사이드를 1:1로 혼합하여 조직을 놓고 바이알을 덮고 밤새 조직을 배양합니다. 프로필렌 옥사이드가 9시간 동안 증발하도록 2시간 후에 바이알의 뚜껑을 엽니다.
티슈를 깨끗한 바이알에 100% 새로 임베딩된 수지로 2시간 동안 옮깁니다. 인쇄된 종이 라벨이 들어 있는 평평한 틀에 새 포매 레진에 샘플을 삽입하고 오븐에서 경화시킵니다. 1시간 후 조직의 위치와 정렬을 확인하고 필요한 경우 조정합니다.
샘플을 관심 영역으로 자르고 겔화 시아노아크릴레이트 슈퍼 글루를 사용하여 알루미늄 핀에 장착합니다. 그런 다음 블록 측면 주위에 콜로이드 은 페이스트로 샘플을 코팅하여 알루미늄 핀에 대한 전도성 경로를 제공합니다. 챔버 내 초박 절편기와 저킬로볼트 후방 산란 전자 검출기가 장착된 주사 전자 현미경 시스템을 사용하여 조직 표본을 검사합니다.
이러한 설정을 사용하여 샘플을 이미지화합니다. 이미지, 유형, 8비트를 차례로 선택하여 분석을 시작하여 이미지를 원래의 독점 16비트에서 8비트 TIFF 형식으로 변환합니다. 이 단계에서 자동 대비 및/또는 밝기 변환이 이미지에 적합하지 않은 경우 16비트 이미지를 다시 열고 이미지, 조정, 밝기/대비를 누릅니다.
모든 이미지에 적합한 범위를 선택하고 적용을 누릅니다. 그런 다음 변환을 수행합니다. 슬라이스 간에 허용되지 않는 이미지 이동이 있는 경우 Plugins, Registration 및 Linear Stack Alignment with SIFT를 선택하여 이미지 스택을 정렬하고 리지드 바디가 아닌 변환 전용 모드로 정렬을 설정합니다.
등록하기 전에 Image, Adjust, Canvas Size를 선택하여 캔버스 크기를 확대합니다. 또는 원하는 영역을 선택한 다음 잘라서 이미지를 관심 영역으로 줄입니다. 필요한 경우 ImageJ를 사용하여 이미지를 더 작고 관리하기 쉬운 크기로 조정한 다음 이미지 및 배율을 선택합니다.
저밀도 뉴런 배양에 대한 컨포칼 현미경 검사는 뉴런 소마에 상주하는 미토콘드리아는 망상 네트워크를 형성하는 반면, 원위 신경돌기에 상주하는 미토콘드리아는 별개의 길쭉한 형태를 나타내는 것으로 나타났습니다. 연속 블록면 주사 전자 현미경 또는 SBFSEM 기술을 사용하여 마우스의 뇌에서 미토콘드리아, 수상돌기 및 축삭 정맥류를 명확하게 관찰했습니다. 쥐 뇌 조직의 신경돌기에서 미토콘드리아를 3일 동안 재구성한 결과, 수지상 미토콘드리아와 축삭 미토콘드리아의 크기 차이가 나타났습니다.
대표적인 2-D SBFSEM 이미지에서 추출한 데이터는 뉴런 시냅스 전(neuronal presynapse) 내에 존재하는 미토콘드리아의 부피 또는 크기가 시냅스 외 영역에 있는 미토콘드리아보다 현저히 작다는 것을 보여주었습니다. SBFSEM 분석으로 획득한 이미지는 개별 미토콘드리아의 초구조적 특성을 시각적으로 표현할 수 있는 향상된 해상도를 제공합니다. 미토콘드리아의 세포 구획을 분류하는 것은 비시냅스 체세포 미토콘드리아(non-synaptic somatic mitochondria) 및 시냅스전 미토콘드리아와 같이 쉽게 식별할 수 있는 구조에 대한 근접성을 결정함으로써 가능합니다.
이 기술은 염색 3일, 수지 경화 2일, 이 분석에 적합한 스택을 생성하기 위한 이미징 1일, 분석 준비를 위한 이미지 후처리에 약 2-4시간을 포함하여 약 7일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 또한 유전적으로 표지된 미토콘드리아를 사용한 실시간 이미징과 같은 미토콘드리아를 이미징하는 다른 방법과 함께 사용하여 미토콘드리아 이동과 미토콘드리아 이동과 그 분열 및 융합의 역학에 대한 질문에 답할 수 있습니다.
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이 기사는 마우스 뇌 조직의 미토콘드리아 형태를 분석하기 위해 직렬 블록 면 주사전자현미경법(SBFSEM)의 사용에 대해 논의합니다. 신경퇴행성 및 신경발달 장애와 관련된 미토콘드리아 구조 및 분포를 이해하는 중요성을 강조합니다.
Serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) enables high-resolution, quantitative analysis of mitochondrial morphology and distribution in brain tissue, addressing a critical gap in neurodegenerative and neurodevelopmental disease research. This capability supports mechanistic de-risking and target validation by providing precise structural data on organelles implicated in disease pathogenesis. Integrating SBFSEM-derived insights at the discovery stage enhances predictive confidence for portfolio decisions involving mitochondrial targets.
SBFSEM integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative, high-resolution analysis of mitochondrial structure in defined brain regions.