Name: 만성 아밀로이드 - 베타 올리고머 주입의 동물 모델에서 신경 퇴행은 삼투 펌프와 항체 치료 인 퓨즈에 의해 상쇄되어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 아밀로이드 베타 올리고머 신경독성을 연구하는 동물 모델 수술 기법을 삼투 펌프와 항체 치료를 활용하여 알츠하이머병 면역요법의 효과를 평가하는 방법입니다.

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쥐 연구에 대해 동물 시설의 Caroline Bouchard에게 감사드립니다. A.S.는 J.A. De Sève 마스터 펠로우십을, B.P.는 Université de Montréal의 COPSE 펠로우십을 보유하고 있습니다. 이 연구는 FRQS-Pfizer의 J.B.에 기부된 보조금과 Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center의 창업 자금으로 지원되었습니다.

윤리 문 :이 프로젝트의 동물 프로토콜은 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인 준수에 HOPITAL 뒤 크레 쾨르 드 몬트리올의 동물 관리위원회의 승인을 획득했습니다. 정위 수술 전에 1. 카테터 준비 <ol><li> 삼투 펌프와 캐 뉼러를 연결하는 데 사용되는 PE50 카테터 (길이 6cm) 컷 (도 1a 참조). 인공 뇌척수액 (ACSF)와 PE50 카테터를 입력하고 카테터의 양쪽 끝을 밀봉. 사용까지 4 ° C에서 카테터를 유지합니다. </li></ol> 정위 2. 정맥 주입 <ol><li> 무균 조건에서 수술을 수행합니다. 고압 증기 멸균하여 모든 수술기구 및 재료를 소독. 정위 장치 철저히 작업 공간을 청소하고, 70 % 에탄올 용액으로 소독. 수술 용 마스크, 헤어 모자와 멸균 장갑을 착용 할 것.</li><li> 복강 내 (IP) 및 케타민의 용액 자일 라진 (100 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / ㎏, 각각)을 주사하여 쥐를 마취. 부드러운 발가락 핀치 후 이동을 확인하여 마취를 확인합니다. </li><li> 적어도 30 분 수술 전에 피하 (SC) 마취 된 동물을, 비 - 스테로이드 계 소염 약물 (1 ㎎ / ㎏ 멜 록시 캄)를 주입한다. </li><li> 가위를 사용하여 동물의 머리를 면도하고, 클로르헥시딘 글루코 네이트 용액의 2 % 이소 프로필 알코올 2 % 3 회 피부를 소독. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 귀 막대와 정위 프레임에 동물을 배치합니다. 정위 프레임의 홀더 팔에 하나의 정맥을 수정합니다. 주사 (SC) 정수리 로컬 마취제 (부피 바카 인 (1.5 ㎎ / ㎏) 및 리도카인 (1.5 밀리그램 / kg). 마취가 3 % 이소 플루 란을 전달 노즈콘을 배치하여 전체 공정 동안 유지한다. 전체를 수술 부위는해야한다오프 드레이프 있지만 더 기술을 보여주기 위해 여기에 수행되지 않았다. </li><li> 메스와 머리의 상단에 3cm의 절개를합니다. 분명 두개골을 떠나 절개 주위에 4 클램프를 설치합니다. 라운드 팁 가위를 사용하여, 동물의 어깨 뼈 사이의 피부 아래에 포켓 (2 × 2cm 2)를 확인합니다. </li><li> 블레이드와 두개골의 골막을 다 쳤어요. 출혈이있는 경우 두개골에 거즈 패드를 적용합니다. </li><li> 두개골은 평평하고 잘 정위 프레임에 정렬 있는지 확인합니다. 두개골이 평평한 지 확인하려면 높이가 브레 그마에서와 람다 좌표 확인합니다. 기준점으로 사용되는 브레 그마의 좌표를 가라. </li><li> 해마에서 양측 이식 될이 가이드 정맥의 좌표 계산, 브레 그마에서 시작 (전후 : - 0.42 cm, mediolateral : 0.30 cm ±을, dorsoventral : - 0.28 cm를 팍시 노스 왓슨 쥐의 뇌 아틀라스에 따라) (29) . 나타냅니다마커로 정맥의 위치. </li><li> 두 캐 뉼러의 주입 시점에서의 두개골에 구멍 (0.5 mm)을 뚫는다. 약 5mm 이상 그 점 아래 드릴 다른 두 개의 구멍이 치과 시멘트를 적용 할 때 정맥을 공고히 할 나사를 삽입합니다. </li><li> 이전에 메스와 ACSF 가득 카테터의 한쪽 끝을 잘라하고, 정맥의 각도 팔에 삽입합니다. 치과 용 시멘트와 첫 캐 뉼러를 수정합니다. 두 번째 정맥에 위치 주위에 치과 용 시멘트를 넣어하지 마십시오. </li><li> 2 치과 시멘트 건조 보자 - 3 분 후, 첫 번째 정맥에서 홀더 암을 제거하고 그 안에 두 번째 캐 뉼러를 해결. 반복 2.11 및 2.12 단계를 반복합니다. 모두 가이드 정맥에 더미 정맥을 넣습니다. 더미와 가이드 정맥이 조직 침투 및 정맥 차단을 방지하기 위해 동일한 길이 있는지 확인합니다. </li><li> 이전에 동물의 어깨 뼈 사이에 주머니에 두 카테터의 끝을 삽입합니다. 클램프를 제거하고로 피부 스티치봉합 실 4-0. 참고 : 상단 가이드 정맥은 곧 Aβo의 주입 용 액세스 할 수 있어야합니다. </li><li> 정위 프레임에서 동물을 제거하고 그 새장에 다시 넣어. 동물이 깨어 때까지 수술 후 회복 중, 가열 물 담요에 새장을 배치합니다. 필요한 경우 쥐가 열에 가까이 이동할 수 있도록 케이지 패드에 부분적으로해야한다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 지속적으로 동물을 모니터링합니다. </li><li> 가까운 감시 아래 10 일 동안 수술에서 회복하기 위해 동물 시설에 쥐를 돌려줍니다. 참고 : 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 마십시오. 멜 록시 캄 (1 ㎎ / ㎏)의 통증을 치료하기 위해 수술을 다음 두 일 동안 하루에 한번 주어진다. </li></ol> 3. 삼투 펌프 설치 <ol><li> 및 제어의 IgG1, 어느 날 설치하기 전에, 6E10 항체 (100 ㎕를 1 ㎎ / ㎖)로 삼투 펌프를 채우기항체 (1 ㎎ / ㎖, 100 μL) 멸균 조건 제조업체의 지시에 따라. 펌프를 활성화하기 위해 밤새 37 ° C에서 멸균 증류수에 펌프를 유지합니다. </li><li> 삼투 펌프 (7 일 0.5 μL / 시간)를 설치하는 이소 플루 란 3 %와 쥐를 마취. 어깨 뼈 사이에 면도하고 클로르헥시딘 글루코 네이트 용액 2 % 이소 프로필 알코올 2 %로 피부를 소독. 가이드 정맥에 연결된 PE50 카테터를 찾을 어깨 뼈 사이의 메스와 2cm의 절개를합니다. </li><li> 메스와 치과 용 시멘트를 포함하는 PE50 카테터의 끝을 잘라. PE50 카테터에 삼투 펌프를 연결하고 연결을 확보하기 위해 펌프와 카테터 교차점에 일부 치과 용 시멘트를 추가합니다. </li><li> 봉합 실 4-0로 단단히 피부 만들기. 가열 물 패드의 장에 동물 다시 넣습니다. 이소 플루 란 마취 (약 5 분)에서 신속하게 동물의 여파를 관찰한다. 참고 : 수술 아프로 소요ximately 5 분 ~ 10. </li></ol> 4. Aβo 깨어에서 혼합 및 자유롭게 이동 쥐 <ol><li> 이전에보고 된 바와 같이 Aβo 용액 (0.2 μg의 / μL)를 준비합니다. (28, 30)는 Aβo는 주입 전에 실온에서 1 시간 동안 동적으로 자발적으로 집계하도록 허용합니다. </li><li> 주입 펌프에 2 개의 10 μL 주사기를 설치합니다. 멸균 증류수 5 μL와 주사기를 입력합니다. 메스로 길이 약 60cm 두 PE50 카테터를 잘라. 1 ml의 주사기와 21G 바늘을 사용하여 멸균 증류수로 두 카테터를 입력합니다. </li><li> 카테터의 한쪽 끝에서 1 ml를 주사기를 유지하고 해밀턴 주사기에 다른 쪽 끝을 연결합니다. 1 ml의 주사기를 제거하고 카테터 내에 기포가 없음을 확인합니다. </li><li> PE50 카테터의 끝에서 내부 캐 뉼러를 삽입합니다. 해밀턴 주사기에 μL TO1까지 멸균 증류수를 사용하여, PE50 카테터에 연결된 내부 캐 뉼러를 입력합니다. P에 의해 기포를 확인2 μL까지 피스톤을 다시 ulling. </li><li> 최대 피펫 팅에 의해 및 준수의 최소한의 팁을 사용하여 아래로 Aβo 솔루션을 섞는다. 혼합시 거품을 형성하지 마십시오. 3.5 μL까지 피스톤을 다시 잡아 당겨 Aβo 솔루션의 1.5 μL와 모두 내부 캐 뉼러를 입력합니다. </li><li> 전에 두 카테터에 다 기포 후 마커로 라인을 확인합니다. 이것은 지속적인 주입의 체크 포인트 역할을합니다. 주입의 경우, 주입 펌프 근처 케이지를 가지고와 그 덮개를 제거합니다. </li><li> 이 붙에서 쥐를 놓고 단단히 쥐의 머리를 고정하기 위해 목에 붙 다의 팔을 다 쳤어요. 두 개의 가이드 정맥에서 더미 정맥을 제거합니다. 이전 가이드 정맥에서 제조 된 내부 캐 뉼러를 삽입합니다. 그들이 완전히 삽입 및 가이드 정맥의베이스에 잘 고정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 이 붙에서 쥐를 놓고 경합 스트레스를 제한하기 위해 새장에 다시 넣어. 카테터를 벗어나서 마치 비틀 지 않도록 면밀히 모니터링그녀와 주입이 제대로 이루어집니다. </li><li> 주입 펌프를 켭니다. 0.1 μL / 분 (10 분)의 속도로 Aβo 액 1 μl를 주입한다. 주입하는 동안, 2.5 μL 3.5 μL에서 주사기의 피스톤 이동하는 것을 확인하고 모두 PE50 카테터에 기포가 연속적으로 이동한다는. </li><li> Aβo 솔루션을 효율적으로 확산 할 수 있도록 주입 후 또 다른 5 분 동안 자리에 내부 캐 뉼러를 남겨주세요. 주입 액의 역류를 방지하기 위해 내부 캐 뉼러 및 출장 가이드 정맥을 제거하기 위해 다시 껴안다에서 쥐를 가져옵니다. 단지 캐 뉼러의 각도 암 전에 중지 더미 캐 뉼러를 사용합니다. 그 새장에 동물을 돌려줍니다. </li><li> 6 연속 일 동안 하루에 한 번 Aβo 주입을 반복합니다. 잘린에 의해 동물을 안락사. </li></ol>

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<li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia%3A+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li>
</ol>

이 비디오 기사의 출판은 ALZET 삼투압 펌프의 후원을 받습니다.

특별한주의가 요구되는이 프로토콜 내에서 중요한 단계가 있습니다. 캐 뉼러를 주입 할 때, 두 번째 캐 뉼러의 구멍을 차단 방지하기 위해 너무 액체 치과 용 시멘트를 넣어하지 마십시오. 이는 자극 가능한 염증 반응을 방지하기 위해, 펌프에 연결된 P50 카테터의 자유 단부에 치과 용 시멘트를 배치하는 것이 중요하다. 정위 수술의 날, 정맥을 차단하지 않도록 가이드 정맥과 같은 길이입니다 더미 캐 뉼러를 사용합니다. 그러나 설치 한 후 펌프는 정맥의 각도 암이 해마에 펌프에서 솔루션의 적절한 주입을 허용하기 전에 중지 짧은 더미 캐 뉼러를 사용합니다. 밀접하게 Aβo의 주입을 모니터링하고 카테터에 다 기포가 주입 동안 연속적으로 이동되어 있는지 확인합니다. 항상 주입 정맥이 완전히 주입하는 동안 가이드 정맥에 삽입되어 있는지 확인합니다. 문제는 만남은 Aβ 주입시의 경우내부 정맥이 차단되어 있지 않은지 확인합니다. 이 경우라면, 내부 캐 뉼러를 통해 멸균 증류수 세척. 가이드 정맥이 차단되면, 가이드 정맥에 내부 캐 뉼러를 켭니다. 그렇지 않으면 위아래 내부 캐 뉼러를 이동합니다. 이 붙에서 경합 특히 첫 날, 쥐에 대한 스트레스가 될 수 있습니다. 동물의 스트레스를 감소하기 위해, 우리는 조작과 정위 수술 전에 껴안다에 쥐를 길들하는 것이 좋습니다. 많은 장점이 소설에 의한 생체 접근 방식에 유연하게 할 수있다. 실제로 Aβo의 특성을 정확하게 주입 전에 제어 될 수있다 주입 및 Aβ 제제의 상이한 유형 (뇌 유래 Aβ 솔루션 VS 예 합성 용) 생체 내에서의 세포 독성을 평가하기 위해 주입 될 수있다. 이 모델은 다양한 Aβ 올 종 (예를 들어, 모노머, 낮은하는 메커니즘 고 분자량을 조사하는데 사용될 수있다igomers는 protofibrils)는 생체 내에서 신경 독성 효과를 유도 할 수 있으며, 면역 요법 등의 치료는 뇌에서의 해로운 영향을 상쇄하는 방법. 주입 깨어, 자유롭게 움직이는 동물에서 수행되기 때문에 이전의 연구에서와 같이, 마취제 및 신호 전달 경로에 Aβo 솔루션 사이에 교란 효과는 없습니다. 자유롭게 동물 이동에 32, 33 팅크가있다 또한 행동 테스트와 호환 모든 시간 전과 주입 후. Aβo 및 펌프 설치의 주입은 노화 동안 Aβo의 효과와 치료를 결정하기 위해 서로 다른 연령대의 동물에서 수행 할 수 있습니다. 신경 퇴행은 주입 부위의 근방에 발생하기 때문에, 시냅스와 신경 세포의 손실은 다른 및 국소 뇌 영역에서 유도 될 수있다. 담보 Aβo의 주입 및 제어 (차량 또는 스크램블 Aβ)는 같은 동물 내에서 어떤 변화를 제어 할 수 있습니다. 반대로, Aβo 또는 제어 졸용액 사용이 오른쪽에서 양측 주입 행동 작업에 동물을 테스트 할 때, 예를 들어, 해마을 둘 수 있습니다. Aβo과 치료 주입을 동시에 수행 또는 대안 치료가 Aβ 증착 후 효과적인 경우 평가 Aβo 주입 후 설치할 수 있습니다 펌프 할 수 있습니다. Aβo의 뇌실 주입을 할 때 여기에 설명 된 것과 동일한 프로토콜을 사용할 수도있다. 세포 내 신호 전달 경로에 Aβo의 영향은 전에 상당히 짧은 기간내 신경 손실 후에 평가 될 수있다. Aβ의 주입의 투여 량 및 횟수는 또한 더 또는 덜 심각한 Aβ의 병원성을 얻기 위해 조절 될 수있다. 매우 다양한 있지만,이 기술은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 정맥 주입은 수술 후 처음 며칠의 조직과 신경 염증의 기계적 중단을 생산하고 있습니다. 따라서, Aβo의 주입 치료를 시작하기 전에 수술 후 1 주일 이상 기다려야 필수적시온, 이러한 이벤트 고려해야 할 적절한 컨트롤 (차량 또는 비활성 스크램블 Aβ의 주입)을 추가 할 수 있습니다. 또한 Aβo의 작은 부피의 용액의 확산을 제한하기 위해 주입 될 수있다. 삼투 펌프는 Aβ에 의한 신경 퇴행을 방지하기위한 에이전트의 임상 검증을위한 편리하고 독특한 전달 방법을 나타냅니다. 6E10 항체와 면역 요법 이전에, 뇌의 31 Aβ의 축적을 감소하는 것으로 나타났다 때문에 우리는 우리의 새로운 생체 접근 방식을 검증하기 위해 개념 증명으로 6E10 항체를 사용했다. 이 모델 삼투 펌프의 사용은 현재 전임상 AD 환자 Aβo의 증착 및 신경 독성을 방지 할 수있는 신규 질병 수정 요법을 개발하기 위해 사용될 수있다.

그것은 처음에 뇌에 불용성 Aβ 종의 축적이 AD의 발병 기전의 중심이었다 제안되었다. 1,2 그러나 아밀로이드 플라크는 노인 일부인지 정상에서 발견된다. 3-7 플라크 침착인지 적자 사이에 존재하는 가난한 상관 관계를 극복하기 위해 AD에서 최근 보고서는이 신경 독성이 매우 동적 제안 된 된 환자의 임상 상태에 훨씬 더. 8-14 Aβ 올리고머의 과정 이후의 상관 관계 질환의 발병에 독성 가용성 Aβo의 존재를 보여 주었다 대신 올리고머의 한 특정 유형의 다양한 Aβo에 의해 유도된다. 14 ~ 16을 많은 연구가 Aβo이 시냅스와 신경 세포 손실에 앞서 시냅스의 기능 장애를 시작할 수 있습니다 것으로 나타났습니다 때문에, 17-24 현재의 이론은 Aβ 관련 치료에 효과적 일 수 있음을 나타냅니다 임상 시험에서 지금까지 테스트로 오히려 나중 단계에서보다 일찍 AD. AD 병리의 한 특징 기능 기억력 결핍의 임상 수준에서 검출 될 때 국부 뇌 영역에서 관찰되는 질병의 말기에 관찰 크고 광범위한 세포 사멸 및 상당한 시냅스와 신경 세포의 손실이다. entorhinal 피질 이가있는 이랑에 (EC) (DG)에서 돌출 있으며, perforant 경로는 AD의 초기 발병에 크게 교란된다. (25, 26)를 AD의 전구 증상 상태에서 경도인지 장애 (MCI)가 분명 중요한 세포 사멸이되면 DG 시냅스의 손실뿐만 아니라 EC에서 발견된다. (25), (26) 증거의 큰 몸이 초기 AD에 용해 Aβo의 독성 작용을 지목했지만, 8-14 Aβo에 의한 신경 퇴행이 신경 세포 문화와의 Organotypic 뇌 조각 문화에서 관찰 된 동물 모델에서 재현 더 도전하고있다. (27) 형질 전환 AD 대부분의 를 과발현 모델β 아밀로이드 플라크 타우 과인산 시냅스 결핍 및 기억력 결핍이있다. (27) 그러나, 이러한 모델이 AD 환자의 해마에서 관찰 모델링 세포사에 덜 성공적이다. 이러한 기술적 문제를 극복하기 위해 우리는 수용성 Aβo의 뇌내 주입에 따라 모델을 개발했다. 우리는 수용성 Aβo의 해마 주입이 점진적으로 신경 세포의 손실과 타우 과인산, AD 메모리 감소와 연관이 병리학 적 특징을 유도 반복이 이전에보고했다. 28 여기, 우리가 특별히 Aβo의 동시 주입을 위해 디자인 캐 뉼러를 사용하여 AD 치료를 테스트 할 수있는 새로운 방법을 보여주고있다 및 삼투 펌프 Aβo 항체 (6E10)의 연속 주입. 삼투 펌프 직접 Aβo의 주입 부위에서 생체 내에서 Aβo 유발 신경 퇴행에 대한 모든 항체 (또는 다른 화합물)의 효율을 시험하는 독특한 방법을 제공한다. 따라서, 이러한 펌프를 repr고체 개념 증명 AD의 잠재적 치료제의 작용 메커니즘에 대한을 수립 할 수있는 편리한 도구를 ESENT. 최근 보고서 AD의 초기 단계에 용해 Aβo의 중요한 영향을 지적하기 때문에, Aβo 향해 많은 치료를 실제로 학계와 제약 연구소에 의해 테스트되고있다. 이 소설 동물 모델은 초기 AD에서 관찰 된 시냅스와 신경 세포의 손실을 흉내 낸 수 있으며, 삼투 펌프는 Aβo 주입 사이트에서 특히 지속적으로 치료 에이전트를 주입하는 데 사용됩니다. 사전 치매 환자에서 임상 시험을 시작하는 연구자 메시지로 환자를 중등도에서 지난 몇 년 동안 시험 AD 치료의 반복적 인 실패 Aβo 풍부하게 축적 돌이킬 수없는 뇌 손상을 생성하기 시작하기 전에. 이러한 맥락에서, 증착 및 Aβo의 결과적으로 신경 독성을 방지 새로운 화합물을 테스트하는 것은 사전 임상 환자에 대한 관심이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인공 뇌척수액(aCSF)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7316</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 카테터 박막</td><td>플라스틱 1개</td><td>C232CT</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염(100mg/ml)</td><td>Bioniche</td><td>1989529</td><td></td></tr><tr><td>자일라진 염산염(100mg/ml)</td><td>Bimeda</td><td>8XYL004C</td><td></td></tr><tr><td>멜록시캠(5mg/ml)</td><td>Norbrook</td><td>215670I01</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 글루코네이트 2% 및 이소프로필 알코올 2% 용액</td> <td>Carefusion</td><td>260100C</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine Hydrochloride</td><td>Alveda Pharma</td><td>0122AG01</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine Hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>1559</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Baussh and Lomb inc.</td><td></td><td></td>2125706</tr><tr><td>입체 프레임</td><td>스톨팅</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>입체 캐뉼라 홀더 암</td><td>하버드 장치</td><td>72-4837</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>가이드 캐뉼라</td><td>플라스틱 1개</td><td>326OPG/spc</td><td></td></tr><tr><td>사출 캐뉼라</td><td>플라스틱 1개</td><td>C315I/spc</td><td></td></tr><tr><td>더미 캐뉼러</td><td>플라스틱 하나</td><td>C315DC/spc</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 스레드 코팅 비크릴 라피드 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VR2297</td><td></td></tr><tr><td>치과 아크릴 시멘트</td><td>하버드 장치</td><td>72-6906</td><td></td></tr><tr><td>나사</td><td>JI Morris Company</td><td>P0090CE125</td><td></td></tr><tr><td>6E10 항체 (마우스 IgG1 isotype)&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803003</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 isotype control 항체</td><td>Abcam</td><td>AB18447</td><td></td></tr><tr><td>Alzet 삼투압 펌프 모델 1007D</td><td>Durect corporation</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>CA2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid-beta 1-42&nbsp;</td><td>r펩타이드</td><td>A-1163-1</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기(10 &마이크로; l)</td> <td>Fisher Scientique</td><td>14815279</td><td></td></tr><tr><td>주입 주사기 펌프 CMA 402</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CMA8003110</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>바늘 21 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2125R</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical</td><td>RTS04</td><td></td></tr></tbody></table>

만성 아밀로이드 - 베타 올리고머 주입의 동물 모델에서 신경 퇴행은 삼투 펌프와 항체 치료 인 퓨즈에 의해 상쇄되어

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

(사실과 이벤트 메모리) 해마에 의존하는 명시적인 메모리의 감소는 알츠하이머 병 (AD)의 초기 임상 증상 중 하나입니다. 잘 시냅스 손실과 계속되는 신경 퇴행은 AD 메모리 장애에 대한 최선의 예측 인자임을 설정됩니다. 최근 연구는 임상 증상이 명확하게이 약 10 ~ 15 년에 인간의 두뇌에 축적하기 시작 수용성 아밀로이드 - 베타 올리고머 (Aβo)의 신경 독성 역할을 강조했다. 대부분의 보고서는 가용성 Aβo가 AD 모델과 인간 메모리 적자와 상관 관계가 있음을 나타냅니다. 신경과 뇌 슬라이스 문화에서 관찰 된 Aβo에 의한 신경 퇴행 많은 동물 모델에서 재현 더 도전하고있다. 여기에 표시된 반복 Aβo의 주입의 모델은이 문제를 극복하고 새로운 질병 수정 요법을 개발하기위한 두 가지 핵심 도메인을 주소 수 : 조기 AD를 진단하는 생물학적 마커를 식별하고, 분자 메카를 결정예방기구는 AD의 발병에 Aβo 유도 메모리 적자를 뒷받침. 수용성 Aβo 집계 상대적으로 빠른에 환자의 임상 적 상태와 가난의 상관 관계 불용성 Aβ의 피 브릴 때문에, 수용성 Aβo 갓 준비와 해마에 표시된 세포 죽음을 생산하는 육일 동안 하루에 한 번 주사. 우리는 특별히 Aβo의 동시 주입 및 삼투 펌프를 사용하여 해마에서 Aβo 항체 (6E10)의 연속 주입을 위해 디자인 캐 뉼러를 사용했다. 생체에있어서 혁신이 이제 미리 치매 환자 Aβo의 증착 및 신경 독성을 방지 할 수있는 새로운 AD 치료의 효율을 검증하기 위해 임상 시험에 사용될 수있다.

Aβo의 신경 독성 효과에 캐 뉼러를 주입하여 긴 에반스 쥐에서 조사 하였다 해마의 DG. 가용성 Aβo 여섯 연속 일 동안 매일 주사 하였다. 우리는 특별히 Aβo의 동시 주입 및 삼투 펌프를 (그림 1A)를 사용하여 해마에서 6E10 또는 컨트롤의 IgG1 항체의 연속 주입을 위해 디자인 캐 뉼러를 사용했다. 면역 쥐를 마취시켰다 들면, 0.9 % NaCl로 관류로 transcardially 및 뇌 24 시간 48 시간 15 % 수크로오스 용액을 4 % 파라 포름 알데히드 용액에 침지. 부동성 관상 부 (40 μm의)을 1 시간 동안 1 % 염소 혈청으로 차단 된 30 분 동안 0.3 % H 2 O 2 처리, 및 항 - 팬 Aβ 항체로 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. 섹션은 항체를 적용하기 전에 3 분 동안 70 % 포름산으로 처리 하였다. 검출은 복합체 ABC 및 0을 사용하여 수행 하였다.05% 3,3- 디아 미노 솔루션입니다. 섹션 톨루엔 5 분간 배양 젤라틴 코팅 된 유리 슬라이드를 탈수, 건조 공기, 2 시간, (30, 70, 95, 100 % 에탄올)에 장착하고, coverslipped 하였다. 크레 실 바이올렛 염색을 위해, 절, 0.5 % 크레 실 바이올렛 용액에서 10 분간 배양 톨루엔을 5 분간 침지 한 탈색 0.5 % 아세트산 용액에 분 (70, 95, 100 % 에탄올)을 배양하고 덮었다 유리 커버 슬립. 여기에 제시된 결과는 본 축적과 관련된 주입 위치의 부근에서의 DG Aβo 증착 및 세포 사멸을 나타낸다. 우리는 수준 Aβo이 실질적으로 6E10 항체 치료 (그림 1B) 감소 것을 발견했다. 표시됨 신경 퇴행은 Aβo의 주입 부위 근처 관찰 및 6E10 항체 처리 (도 1b)에 의해 감쇠한다. 이러한 결과들은 우리가 DG 관찰 Aβo 축적과 일치여기에 표시된 6E10 항체와 면역 요법에 의한 아밀로이드 침착 마우스 반복 Aβo의 주입을 다음과 같습니다. (28) 통관은 형질 전환 AD 마우스 모델에서 수행 다른 보고서와 일치한다. (31) <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig1.jpg" /> Aβo 주입하는 동안 양자 간 정맥과 동물 그림 1. 사진 Aβo의 솔루션을 제공한다. (0.2 μg의 / μL 1 μL)가 내부 정맥에 연결 PE50 카테터를 사용하여 (6 일 동안 하루에 한 번) 깨어 자유롭게 이동 쥐에 주입 가이드 정맥에 삽입. 제어 CTL ()의 IgG1 또는 6E10 항체 치료는 동물의 견갑골 사이에 피하에있는 삼투 펌프를 사용하여 Aβo 주입 부위에 직접 주입했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig1large.jpg" target="_blank">일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그림입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig2.jpg" /> . FET의 (의 IgG1)와 함께 6 연속 일 동안 하루에 한 번 주입하고, 처리 또는에서 6E10 항체, Aβo 증착에 의해 유도 된 그림 2. 신경 세포 손실 6E10 항체 치료 A, Aβo (1 μL / μL 0.2 μg의)에 의해 감쇠 세포의 손실을 나타내는 크레 실 바이올렛 주입 삼투 펌프를 사용하여. B, 바로 옆에 캐 뉼러를 삽입에 대한 부분에 DG에서 Aβo 대표 축적, 대표 염색의 사이트. 스케일 바 : 50 μm의 (N = 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

생체 내에서 Aβo의 효과를 연구하기 위해 Aβo의 신경독성 효과를 상쇄하기 위해 삼투압 펌프를 사용하여 해마에 Aβo 항체(6E10)를 지속적으로 주입하는 용해성 Aβo의 반복적인 해마 주입을 기반으로 하는 모델을 개발했습니다.

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

본 외과적 중재의 전반적인 목표는 amyloid beta oligomer 독성에 대한 치료법의 효과를 in vivo에서 테스트하는 것입니다. 이 방법은 동물 모델에서 amyloid beta oligomer의 신경독성 효과를 표적으로 하는 새로운 치료법을 찾는 것과 같이, 알츠하이머병 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 amyloid beta oligomer가 in vivo에서 신경독성 효과를 유도하는 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.또한 면역 요법과 같은 우리의 치료법은 뇌에 미치는 유해한 영향을 상쇄할 수 있습니다. 절차 시연은 저희 실험실의 테크니션인 Chloe Provost가 맡아 진행하겠습니다. 캐뉼라 삽입 과정을 시작하기 위해, 먼저 PE50 카테터를 6cm 길이로 자릅니다.그다음, 카테터를 인공 뇌척수액으로 채웁니다. 열 밀봉기를 사용하여 카테터의 양 끝을 밀봉합니다. 양 끝에 치과용 시멘트를 도포합니다.승인된 방법에 따라 쥐를 마취시킨 후, 발가락을 가볍게 꼬집어 움직임 여부를 확인함으로써 마취 상태를 확인합니다. 그 다음, 마취된 동물에게 비스테로이드성 항염증제를 주사합니다. 클리퍼로 동물의 머리 부분을 제모한 후, 2% chlorhexidine gluconate와 2% isopropyl alcohol 혼합액으로 피부를 소독합니다.마취 중 안구 건조를 방지하기 위해 동물용 안연고를 눈에 도포합니다. 이제 이어 바(ear bar)를 사용하여 동물을 정위 고정기(stereotaxic frame)에 배치합니다. 정위 고정기의 홀더 암(holder arm)에 캐뉼라 하나를 고정합니다.국소 마취제를 주입하고 머리 상단에 3 cm 길이의 메스 절개를 한 후, 두개골을 노출시키기 위해 절개 부위 주변에 4개의 클램프를 설치합니다. 다음으로, 둥근 팁 가위를 사용하여 동물의 견갑골 사이 피부 아래에 2x2 cm 크기의 정사각형 포켓을 만듭니다. 다시 머리 부위로 돌아와, 메스로 두개골의 골막을 긁어냅니다.출혈이 발생하면 두개골에 거즈 패드를 적용하십시오. 이제 두개골이 평평하고 스테레오택식 프레임(stereotaxic frame)에 잘 정렬되었는지 확인하기 위해, lambda와 bregma의 높이 좌표를 확인하십시오. 기준점으로 사용할 bregma의 좌표를 기록하십시오.두 개의 가이드 캐뉼라를 정확한 양측 위치에 배치하기 위한 좌표를 계산한 후, 양쪽 캐뉼라의 삽입 지점에 0.5 mm 크기의 구멍을 두개골에 뚫습니다. 치과용 시멘트를 도포할 때 캐뉼라를 고정할 나사를 삽입하기 위해, 해당 지점에서 위아래로 약 5 mm 떨어진 곳에 세 개의 구멍을 더 뚫습니다. 다음으로, 미리 aCSF로 채워둔 카테터의 한쪽 끝을 가위로 자르고 이를 캐뉼라의 앵글 암(angle arm)에 삽입합니다.첫 번째 캐뉼라를 치과용 시멘트로 고정합니다. 이때 두 번째 캐뉼라가 들어갈 위치 주변에 치과용 시멘트가 묻지 않도록 주의하는 것이 매우 중요합니다. 치과용 시멘트를 2~3분간 건조시킨 후, 첫 번째 캐뉼라에서 홀더 암을 제거하고 다듬어진 두 번째 캐뉼라를 그 자리에 배치합니다.치과용 시멘트를 사용하여 두 번째 캐뉼라를 고정합니다. 다음으로, 양쪽 가이드 캐뉼라에 더미 캐뉼라를 끼웁니다. 두 카테터의 자유단을 동물의 견갑골 사이에 미리 만들어 둔 포켓에 삽입합니다.클램프를 제거한 다음, 4-0 봉합사로 피부를 봉합합니다. 캐뉼라 주변에 시멘트를 더 추가합니다. 동물을 정위 고정 틀에서 분리하여 깨끗한 케이지 안의 가열 패드 위에 올려둡니다.동물이 복와위(sternal recumbency)를 유지할 수 있을 만큼 충분히 의식을 회복할 때까지 지속적으로 관찰하십시오. 그 후, 동물을 사육실로 옮겨 10일 동안 면밀한 모니터링 하에 수술 후 회복 기간을 갖게 합니다. 펌프 설치 전날, 제조사의 지침에 따라 삼투압 펌프에 6E10 항체 또는 대조군 IgG1 항체를 충전하십시오.펌프를 멸균 증류수에 넣고 37 °C에서 하룻밤 동안 유지하여 펌프를 활성화합니다. 3% isoflurane으로 쥐를 마취시키고 양쪽 견갑골 사이의 털을 제거한 후, 2% chlorhexidine gluconate와 2% isopropyl alcohol 용액으로 피부를 소독합니다. 메스로 양쪽 견갑골 사이에 2 cm 절개를 가한 후, 가이드 캐뉼라에 연결된 PE50 카테터를 찾습니다.다음으로, 치과용 시멘트가 들어 있는 PE50 카테터의 끝부분을 메스로 절단합니다. 삼투압 펌프를 PE50 카테터에 연결하고, 연결 부위를 고정하기 위해 펌프와 카테터 접합부에 치과용 시멘트를 약간 추가합니다. 마지막으로 4-0 봉합사로 피부를 단단하게 꿰맵니다.동물을 따뜻한 히팅 패드가 깔린 케이지에 다시 넣고, isoflurane 마취에서 깨어나는 과정을 모니터링합니다. 이전에 보고된 방법대로 아밀로이드 베타 올리고머 용액을 준비한 후, 주입 전 실온에서 1시간 동안 용액이 동적으로 자발적 응집이 일어나도록 둡니다. 그 다음, 각 주사기에 5 µL의 멸균 증류수를 채웁니다.다음으로, 메스를 사용하여 PE50 카테터 두 개를 약 60 cm 길이로 자릅니다. 21-gauge 바늘이 장착된 1 mL 시린지 두 개를 사용하여 두 카테터를 멸균 증류수로 채웁니다. 1 mL 시린지를 각 카테터의 한쪽 끝에 그대로 둔 상태에서, 반대쪽 끝을 Hamilton 시린지에 연결합니다.1 mL 주사기를 제거하고 카테터 내에 기포가 없는지 확인합니다. PE50 카테터 끝에 내부 캐뉼라를 삽입합니다. Hamilton 주사기를 사용하여 각 내부 캐뉼라를 1 µL까지 채운 다음, 피스톤을 2 µL 표시선까지 뒤로 당겨 기포를 생성합니다.이제 저부착 팁을 사용하여 피펫팅으로 베타-아밀로이드 올리고머 용액을 혼합합니다. 혼합 과정에서 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 그다음, 피스톤을 3.5 µL까지 당겨 두 내부 캐뉼라에 베타-아밀로이드 올리고머 용액 1.5 µL를 채웁니다.다음으로, 두 카테터의 공기 방울 전후에 선을 표시합니다. 이는 지속적인 주입 여부를 확인하는 체크 포인트 역할을 합니다. 깨어 있는 쥐를 스너글 홀드(snuggle hold)로 잡고 머리를 고정합니다.두 개의 가이드 캐뉼라에서 더미 캐뉼라를 제거한 다음, 이전에 준비한 내부 캐뉼라를 가이드 캐뉼라에 삽입합니다. 내부 캐뉼라가 가이드 캐뉼라의 바닥까지 완전히 삽입되어 잘 고정되었는지 확인합니다. 이제 스너글 홀드(snuggle hold)에서 쥐를 놓아주고, 핸들링 스트레스를 제한하기 위해 다시 케이지에 넣습니다.주입 펌프를 켜고 아밀로이드 베타 올리고머 용액 1 µL를 분당 0.1 µL의 속도로 주입합니다. 주입하는 동안 시린지 피스톤이 3.5 µL에서 2.5 µL로 이동하는지, 그리고 두 PE50 카테터 내의 공기 방울이 지속적으로 이동하는지 확인합니다. 쥐를 살펴 카테터들이 서로 꼬이지 않았는지 확인합니다.아밀로이드 베타 올리고머 용액이 효율적으로 확산될 수 있도록 주입 후 5분 동안 내부 캐뉼라를 그대로 둡니다. 주입이 끝나면 쥐를 다시 안락한 홀딩 장치로 옮기고, 주입된 용액의 역류를 방지하기 위해 내부 캐뉼라와 캡이 씌워진 가이드 캐뉼라를 제거합니다. 가이드 캐뉼라의 굴곡진 암(angle arm) 직전까지만 삽입되는 더미 캐뉼라를 배치합니다.마지막으로, 동물을 케이지로 돌려보냅니다. 여기에 제시된 결과는 주입 부위 근처의 치상회(dentate gyrus)에 아밀로이드 베타 올리고머가 침착된 모습과 이러한 축적과 관련된 세포 사멸을 보여줍니다. anti-A-beta 항체를 이용한 면역 염색 결과, 6E10 항체 처리에 의해 아밀로이드 베타 올리고머의 수치가 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었습니다.Cresyl violet 염색 결과에서 나타난 바와 같이, A-beta-O 주입 부위 근처에서 뚜렷한 신경 퇴행이 관찰되었으며, 이는 6E10 항체 처리에 의해 완화되었습니다. 숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 캐뉼라 삽입은 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 삼투압 펌프 설치에는 약 10분이 소요되며, amyloid beta 주입에는 약 15분이 소요됩니다.이 절차를 수행할 때, 첫 번째 캐뉼라를 삽입할 때 두 번째 캐뉼라가 위치할 곳 주변에 치과용 시멘트를 바르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 가이드 캐뉼라에 내부 캐뉼라를 삽입하기 전 동물이 진정될 때까지 기다리십시오. 이 영상을 시청한 후에는 아밀로이드 베타 올리고머를 주입하고 면역 요법과 같은 알츠하이머병 치료제를 테스트하기 위해 캐뉼라와 삼투압 펌프를 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

neurodegeneration-an-animal-model-chronic-amyloid-beta-oligomer

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

알츠하이머병 중 하나는 기능은 Aβ의...

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

이 비디오는 아밀로이드-베타(Aβ) 펩타이드 특이적 항체를 쥐의 해마에 지속적으로 주입하는 기술을 보여줍니다. 이 연구는 올리고머와 항체 간의 상호 작용을 연구하기 위해 쥐 해마에 용해성 Aβ 올리고머(Aβo)를 주입하는 것과 결합된 Aβ 펩타이드 특이적 항체의 제어 주입을 위해 양측 캐뉼라 시스템을 이식하는 방법을 사용합니다.

Aβ 펩타이드 특이적 항체 및 Aβ 올리고머를 쥐 해마에 제어 주입

이 비디오는 알츠하이머병의 마우스 모델을 확립하기 위해 아밀로이드 베타를 치상회에 정확하게 입체적으로 주입하는 방법을 보여줍니다. 정확한 좌표 결정과 아밀로이드 베타 단백질의 제어된 전달은 신경 세포 분해를 초래하여 기억 처리를 방해하고 알츠하이머병 발병에 기여합니다.

알츠하이머병 모델을 위한 아밀로이드-베타 단백질의 직접 입체성 뇌 주입

출처: Maiti, P. et. al.,. 천연 폴리페놀 커큐민을 사용한 뇌 조직의 아밀로이드 플라크 라벨링 및 이미징. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 면역 표지 및 커큐민 염색을 사용하여 뇌 조직 절편에서 아밀로이드-베타 플라크의 이미징 절차를 보여줍니다. 면역 표지는 아밀로이드-베타에 대한 특이성을 제공하는 반면, 커큐민은 시트가 풍부한 β 섬유에 선택적으로 결합하여 시각화를 향상시킵니다. 적색과 녹색 형광의 공동 국소화는 플라크의 존재를 확인합니다.

Immunolabeling 및 Curcumin 염색을 통한 뇌 조직 절편의 아밀로이드-베타 플라크 이미징

우리는 카테터를 이식하거나 마우스의 오른쪽 측면 뇌실에 알약 주입을 수행하여 중추 신경계에 약물을 대상으로하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 특히 초점을 맞 춥니 다. 이 기술은 다른 약물과 쥐에 쉽게 적응할 수있다.

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을...

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

여기에서는 아밀로이드-베타의 직접 입체성 뇌 주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 뇌 뉴런에 대한 아밀로이드-베타의 단기적인 영향을 해결하기 위한 대안적인 생체 내 마우스 모델을 제공합니다.

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

아밀로이드-β (Aβ)의 동물 모델에 정의 된 수량 및 Aβ 단편 종의 관리를 가능하게하고 각 연구 그룹 내의 개별 차이를 줄여 주사 하였을. 이 프로토콜은 정상 마우스에서 알츠하이머와 같은 행동 이상의 생산을 가능하게 정위기구없이 Aβ​​의 뇌실 (ICV) 주입을 설​​명합니다.

일반 마우스의 아밀로이드-β의 펩티드의 뇌 실내 주사는 급성 치매와 같은인지 적자를 유도합니다

우리는 알츠하이머 병의 쥐 모델에서 단핵 식세포에 의해 대뇌 아밀로이드 β (Aβ) 식균 작용의 실리코 모델링 (q3DISM)의 양적 3D에 대한 방법론을 개발했다. 이 방법은 생체 내에서 거의 모든 식세포 이벤트의 정량화를 위해 일반화 될 수있다.

양적 3D 인 실리코 모델링 (q3DISM)

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

이 프로토콜은 세포를 고정화시키는 알긴산의 신속한 물리적 겔화에 의한 세포 캡슐화 방법을 예시한다. 얻어진 마이크로비드는 시간이 지남에 따라 아밀로이드-β의 제어되고 지속적인 분비를 허용하고 시험관 내 및 생체 내 모델에서 분비 된 아밀로이드-β의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

알츠하이머 병 모델링에 사용하기 위한 아밀로이드-β-분비 알긴산 마이크로비드 의 제조

배우세요 아밀로이드 베타 올리고머 신경독성을 연구하는 동물 모델 수술 기법을 삼투 펌프와 항체 치료를 활용하여 알츠하이머병 면역요법의 효과를 평가하는 방법입니다.

만성 아밀로이드 - 베타 올리고머 주입의 동물 모델에서 신경 퇴행은 삼투 펌프와 항체 치료 인 퓨즈에 의해 상쇄되어

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