라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처할 형광 표지된 염색질 및 세포막 단백질을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 유사분열 중 염색체 분리의 충실도를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 유사분열 결함이 어떻게 발달 결함을 초래하는지 또는 살아있는 척추 동물 유기체에서 종양을 형성하는지와 같은 유사 분열 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 척추 동물 유기체에서 유사 분열을 관찰하여 생리학적으로 관련된 데이터를 수집 할 수 있다는 것입니다.

성인 제브라피쉬를 번식시키고 알에 H2A를 주입 한 후. 이미징 약 2시간 전에 F/Z-EGFP 및/또는 pCS2 mCherry-CAAX RNA를 사용하여 형광 해부 현미경을 사용하여 GFP 양성 배아를 식별합니다. 밝은 녹색의 GFP 발현 배아를 E3 파란색 배지가 있는 새로운 100 x 15mm 페트리 접시로 이식합니다.

1% 저용융 아가로스의 원액을 E3 블루로 끓입니다. 용융된 아가로스 3ml를 17 x 100mm 배양 튜브에 분취합니다. 사용할 준비가 될 때까지 배양 튜브를 섭씨 42도의 수조에 넣어 아가로스를 따뜻하게 유지합니다.

15밀리몰 트리카인, 스크리닝된 배아, 저용융 아가로스, E3 블루, 35mm 유리 커버슬립 바닥 배양 접시, 해부 광학 현미경을 수집합니다. 다음으로, 5번 핀셋으로 3개의 배아에서 융모막을 조심스럽게 제거하고 배아를 별도의 용기에 넣어 마취합니다. 그런 다음 전사 피펫을 사용하여 배아와 5ml의 배지가 들어 있는 접시에 15밀리몰 트리카인 3방울을 추가합니다.

15%가 녹은 아가로스 튜브에 15밀리몰 트리카인 용액 3-4방울을 떨어뜨립니다. 배아가 충분히 마취되면 P200 Pipetman을 사용하여 피펫 끝이 1cm 절단된 상태에서 마취된 배아를 커버슬립 바닥 접시로 옮깁니다. 과도한 E3 블루 트리카인 용액을 제거합니다.

배아가 서로 가까이 떠다니지 않도록 각 방울을 분리하여 배아 위에 5-10마이크로리터의 저용융 아가로오스-트리카인 용액을 천천히 추가합니다. 그런 다음 21게이지 1/2 바늘을 사용하여 아가로스의 배아를 원하는 위치로 부드럽게 향하게 하고 도립 현미경을 사용하는 경우 관심 영역을 커버슬립에 최대한 가깝게 배치합니다. 발생할 수 있는 이동으로 인해 필요한 위치에 유지되도록 하기 위해 각 배아로 돌아가

한천이 응고됨에 따라 이상적인 위치에 도달할 때까지 이 작업을 여러 번 수행해야 할 수도 있습니다. 몇 분 후 설정되었는지 테스트하기 위해 바늘을 사용하여 작은 아가로스 조각을 부수십시오. 방울에서 떼어낼 수 있는 경우 추가로 저용융 아가로스를 사용하여 내장된 배아 위에 돔을 형성하여 커버슬립 전체를 덮습니다.

아가로스가 응고되는 동안 이미징 중에 내장된 배아 위에 놓을 15밀리몰 트리카인 5방울과 함께 E3 블루 배지 3ml를 준비합니다. 살아있는 제브라피시 배아의 5D 컨포칼 이미징을 수행하려면 이미징 소프트웨어를 열고 현미경을 60X 개구수 1.4 렌즈로 설정합니다. 렌즈에 이멀젼 오일을 바르고 배양 접시를 현미경 스테이지의 슬라이드 홀더에 놓습니다.

축 컨트롤러를 사용하여 관심 배아를 대물 렌즈 위의 중앙에 놓고 배양 접시에 맞게 렌즈를 올립니다. 한천이 포함된 배아에 E3 블루 및 트리카인 용액을 붓습니다. 그런 다음 Eye Port 아이콘을 클릭하여 접안렌즈를 통해 배아를 봅니다.

Eye Port 선택을 비활성화하고 View, Acquisition Controls, A1 Scan Area를 선택하여 A1 Scan Area 도구를 엽니다. GFP 채널을 선택하고 스캔을 다시 시작한 다음 커버슬립에 가까운 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 스캔을 중지하고 GFP 및 mCherry 채널을 선택한 다음 라인 평균화 옵션을 normal로 설정합니다.

이제 보기, 획득 컨트롤, ND 획득을 선택하여 A1 ND 획득 도구를 엽니다. 스캔을 시작합니다. 그런 다음 축 컨트롤러를 사용하여 스캔 영역이 가능한 한 많은 제브라피시로 채워지도록 배아를 배치합니다.

Z-stack 상한을 세포의 초점이 맞지 않는 위치로 설정하여 성장 및 세포 이동을 위해 샘플 위에 3마이크로미터의 추가 공간을 허용합니다. 그런 다음 셀이 더 이상 표시되지 않는 위치의 하한을 설정하고 Z 간격 단계 크기를 2마이크로미터로 설정합니다. 여기에 시연된 실험의 경우 아래 나열된 대로 이미징 레이저 출력, HV 또는 게인, 오프셋 수준을 각각 조정하십시오.

매개변수가 설정되면 스캔을 차단하여 샘플의 광독성 및 광표백을 유발할 수 있는 불필요한 레이저 노출을 방지합니다. 이제 최상의 이미지 품질과 가장 빠른 스캔 시간을 제공하는 2X 라인 평균 아이콘을 선택하십시오. 실험에 필요한 적절한 시간 간격과 기간을 선택합니다.

야생형 세포 분열의 경우, 2시간 동안 2분 시간 간격이 유사분열 지속시간을 결정하는 데 적합합니다. 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 30 분 이상 활성화하는 분할은 여기에서 볼 수 있듯이 형광을 보존하기 위해 4 시간 동안 4-5 분 간격에 더 적합합니다. 파일을 가져오는 동안 자동으로 저장하려면 파일에 저장 상자를 선택하고 파일 이름을 지정합니다.

마지막으로 모든 매개변수가 올바르게 설정되었는지 다시 확인하고 지금 실행을 누르십시오. 획득이 완료된 후 파일을 3D 형식으로 보려면 Volume Threshold(볼륨 임계값) 아이콘을 클릭합니다. 이 그림은 AB 야생형 제브라피시 꼬리의 넓은 시야를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰할 수 있는 능력을 보여줍니다.

세포 분열은 별표로 표시됩니다. 해당 동영상이 여기에 표시됩니다. 평균적으로 AB에서 50개의 분열세포와 오로라 B 돌연변이에서 30개의 분열세포가 관찰되었습니다.

오로라 B 돌연변이 배아에서 이미징된 유사분열 세포의 감소된 수를 설명하기 위해, 이미징된 세포 수에 대한 유사분열 세포의 비율을 계산했는데, 이는 오로라 B 돌연변이 배아에서 유사분열을 거치는 세포의 수가 더 적은 것이 아니라 오히려 이미지화되는 전체 세포의 수가 더 적다는 것을 시사합니다. 유사분열 지속 시간을 정량화하기 위해 하나의 세포 분열을 차지하는 시간 간격의 수에 각 Z 스택 사이의 시간 간격을 곱합니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, AB 야생형 분열 시간의 평균은 25분이고, 오로라 B 돌연변이의 경우 58분이다.

야생형 배아에서 볼 수 있듯이 각 유사분열 단계를 구별할 수 있습니다. 그러나 오로라 B 돌연변이 배아에서 유사분열 결함이 관찰되며, 여기에는 유사분열 정지 및 파일된 사이토키네시스가 포함되어 이핵세포가 생성되고 이후 소핵이 형성되어 이 돌연변이에서 측정된 분열 시간 증가를 뒷받침합니다. 이 기술을 완전히 익히면 배아 스크리닝부터 컨포칼 현미경 매개변수 설정에 이르기까지 1시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 관심 영역, 기간, 시간 간격 및 Z 깊이와 관련이 있으므로 당면한 실험의 컨텍스트를 기억하는 것이 중요합니다. 이는 효율성을 극대화하고 광표백 및 광독성을 방지하는 데 도움이 됩니다. 이 절차에 따라 염색체 확산과 같은 다른 방법을 수행하여 관찰된 유사분열 결함의 원인에 대한 추가 질문에 답하거나 유사분열 진행, 기간 또는 세포 운명에 대한 영향을 결정하기 위한 약물 치료 사용을 수행할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시를 사용하여 발달 및 암 생물학의 맥락에서 유사분열을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 배아를 삽입하고, 유사분열의 실시간 이미징을 캡처하고, 유사분열 빈도, 지속 시간 및 세포 운명을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 고출력 레이저와 형광등으로 작업하는 것은 눈에 해로울 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 레이저와 직접적인 눈 접촉을 피하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.