Name: 라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 학습하세요 라이브 제브라피쉬 배아에서 형광 표지된 염색질과 세포막 단백질을 이용한 고해상도 공초점 현미경으로 유사분열을 관찰하는 방법을. 이 기술은 발달 생물학 및 종양 형성 연구에 활용됩니다.

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pCS2-H2A.F/Z-EGFP 및 pCS2-mCherry-CAAX 벡터에 대해 Kristen Kwan에게 감사드립니다. 제브라피쉬의 라이브 이미징을 가르쳐 준 Chris Rodesch에게 감사드립니다. UAB의 컨포칼 이미징과 UAB의 고해상도 이미징 시설에 도움을 준 Shawn Williams, Erik Malarkey 및 Brad Yoder에게 감사드립니다. 고해상도 이미징 시설은 UAB 종합 암 센터 지원 보조금(P30CA013148) 및 류마티스 질환 핵심 센터(P30 AR048311)의 지원을 받습니다. J.M.P.는 NIH R21 NS092105(National Institute of Neurological Disease and Stroke)의 지원을 받고 있으며, 미국 암학회(ACS IRG-60-001-53-IRG) 및 UAB 종합 암 센터(P30CA013148)의 파일럿 보조금을 받고 있습니다. S.M.P.는 Cell and Molecular Biology T32 Training Grant(5T32GM008111-28)의 지원을 받습니다.

1. 시험 관내 전사 <ol><li> 효소 (31)를 소화을 NotI 제한에 의해 PCS2-H2A.F / Z-EGFP 및 / 또는 PCS2-mCherry-CAAX 벡터를 선형화. 시험 관내 전사 키트에서 RNA를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 각각의 템플릿으로부터 5 &#39;mRNA의 캡 제품을 생성한다. </li><li> 정제 키트를 사용하여 캡핑 된 mRNA의 정제. 제조업체의 지침을 따르십시오. 의 RNase가없는 H 2 O로 용출 </li><li> 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도에 의해 RNA의 농도를 결정한다. (OD 260 X 희석 × 40 μg의 / ㎖). </li><li> 각각 H2A.F / Z-EGFP 및 mCherry-CAAX의 RNase없는 H 2 O에 대한 μL / 100 NG에 RNA를 희석 RNA의 농도가 너무 낮은 경우, 형광이 감소 또는 부재한다. 밝은 샘플은 광독성과 광표백을 통해 우려를 감소합니다. 한편, 너무 많은 RNA는 독성 및 / 또는 표적 효과를 일으킬 수있다. 참고 : 나머지 저장-80 ° C의 냉동고에서 정제의 mRNA. </li></ol> 2. Zebrafish의 사육, 배아의 수집 및 mRNA의 주입 36-38 <ol><li> 두 개의 영역으로 탱크를 분리 제브라 피쉬 시설에 사용되는 양식 시스템 물 각각의 사육 탱크를 채우기 위해 장벽 사육 탱크를 조립합니다. </li><li> 사육 전날 밤, 불의의 번식을 방지하기 위해 다른면에 배리어의 일측 두 개의 암컷 어류 수컷을 배치하기 위해. </li><li> 다음 날, 얼음에 이전에 제조 된 mRNA의 혼합물을 해동. 신선한 양식 시스템 물 사육 탱크에 물을 교체하고 장벽을 제거합니다. 장벽이 가져온 후 즉시, 28.5 ° C로 사출 금형을 따뜻하게하고 미세 주입을위한 장비를 설정합니다. 참고 : 사출 금형에 대한 자세한 내용은 라흐 (36)을 참조하십시오. </li><li> 차 여과기를 사용하여 15 분, E와 깨끗한 100 × 15mm 페트리 접시에 계란을 씻어 - 계란마다 10 수집3 블루 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 CaCl2를, 0.33 mM의 황산, 10 -5 % 메틸렌 블루). E3은 푸른 곰팡이 성장을 방지하고, 물고기 유충 적절한 발전을 위해 사용된다. 결합 및 배아 컬렉션에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오. </li><li> 삽입 한 셀은 가온 사출 금형에서 배아를 단계적 배아 (도 1a)의 목적하는 양으로 난황에 RNA를 주입. 자연 배아 죽음과 실험에 필요한 것보다 15 % 더 많은 배아에서 배아 주사를 수행하여 미 수정 배아를 차지한다. 제브라 피쉬 배아의 미세 주입에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오. 주 : mRNA를 처음으로 사용하기 위해서는 종래 5D 촬상을 수행하는 (최대 5 DPF없이 총 발달 결함으로 정의)의 형광과 생존에 대한 최적 투여 량을 결정하기 위해 용량 - 곡선 분석을 수행한다. 150-200 NG / μL수정란 내로 주입 따라서는 최종 농도를위한 좋은 출발점이 종종 최적 농도이다. </li><li> 조심스럽게 수정 된 9 &quot;유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 금형에서 주입 된 배아를 추출합니다. 피펫을 수정하려면,이 공을 형성 할 때까지 분젠 버너를 사용하여 끝을 용융. </li><li> 28.5 ° C 배양기에서 100 × 15mm 페트리 E3 블루에서 요리와 집에서 주입 된 배아를 놓습니다. </li><li> 포스트 분사 여섯 시간은 플레이트에서 죽은 또는 미 수정 배아를 제거하고 깨끗한 E3 블루를 추가합니다. 28.5 ° C에서 하우스 배아. </li></ol> 3. 준비 및 이미징에 대한 라이브 Zebrafish의 태아의 포함 (그림 1B) <ol><li> 두 시간 이미징 전에 형광 해부 현미경을 사용하여 GFP에 대한 주입 된 배아를 화면. E3 블루와 새로운 100 × 15mm 페트리 접시에 밝은 녹색 GFP 발현 배아를 놓습니다. </li><li> 아가 E3 블루 100 ml의 낮은 용융 1g을 첨가하여 1 % 저 용융 아가 로스의 스톡 용액을 끓여. 아가로 오스를 사용한 후 알루미늄 호일로 플라스크를 커버한다. 원액 한 달까지 유용 남아있다. </li><li> 분취 액을 17 X 100mm 배양 관 내로 용융 아가 3 ㎖. 사용할 준비가 될 때까지 42 ° C의 물을 욕조에 문화 튜브를 배치하여 아가 로스를 따뜻하게 유지합니다. 제브라 피쉬 배아 (36) 마취 탈 이온수에 15 mM의 Tricaine 솔루션을 준비합니다. 주 : 이전 시점의 영상을 원하는 경우, 한천의 농도가 0.3 %로 낮은 39으로 감소 될 수있다. </li><li> 15 mM의 Tricaine, 상영 배아, 낮은 용융 아가로 오스, E3 블루, 및 해부 광학 현미경에 35mm 유리 커버 슬립 바닥 배양 접시를 가져옵니다. 조심스럽게 # 5 핀셋으로 배아의 융모막을 제거합니다. 세 개의 배아에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 별도의 용기에 dechorionated 배아를 마취 할 수 놓습니다. 커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑은 주로 이러한 목적으로 사용된다. 전송 피펫을 사용하여, 세 방울을 추가 (약 150 μL)나까지 배아 충분히 마취 된 (커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑을 사용하는 경우) 5 ml의 E3 블루의 접시에 15 mM의 Tricaine의. 1 % 용융 아가로 오스 튜브에 15 mM의 Tricaine 솔루션 - (200 ㎕를 약 150) 또한, 3 ~ 4 방울을 추가합니다. </li><li> 차단 피펫 팁 1 cm와 P200 피펫을 사용하여; 커버 슬립 바닥 접시에 마취 배아를 전송합니다. Tricaine 솔루션 : 초과 E3 블루를 제거합니다. </li><li> 배아 실수로 서로 가까이 표류하지 않도록하기 위해 별도의 각 드롭을 유지, 배아를 통해 Tricaine 솔루션 : 낮은 용융 아가로 오스 10 ㎕의 - 천천히 다섯을 추가합니다. 경고 : 아가로 오스가 너무 따뜻 경우에는 배아를 손상시킬 수 있습니다. 42 °의 C이다에 좋은 온도는 한천을 유지합니다. </li><li> 21 G 1 ½ 바늘을 사용하여 부드럽게 원하는 위치로 오스에서 배아의 방향. 시간 경과 이미징을위한 거꾸로 현미경을 사용하는 경우, possib로 커버 슬립에 가까운 관심 (ROI)의 영역의 방향르. 주 : 일반 목적 꼬리 영역 인해 비교적 얇은 조직 (도 1a)에 배향하고 명료 용이성을 제공한다. 이러한 노른자 및 핀 폴드를 둘러싸는 상피층 등 기타 조직, 28, 29을 이용할 수있다. 이 조직은 그러나이 지역은 불과 몇 세포층 두께이며, 좋은 선명도를 제공합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 가능한 한 많은 세포 분열을 취득 꼬리 영역은 이미지에 유익하다. </li><li> 한천의 부분 응고에 대한 몇 분을 허용합니다. 그 응고를 테스트하기 위해 한천의 작은 조각 떨어져 휴식 바늘을 사용합니다. 한천의 조각을 드롭에서 멀리 당겨 할 수있는 경우, 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 낮은 용융 한천이 포함 된 배아를 통해 돔을 형성하는 전체 커버 슬립을 커버. 한천은 공 초점 영상 (그림 1A)의 요리를 이동하기 전에 응고하도록 허용합니다. </li><li> 한천 응고 공정 (약 10 분 소요) 동안, 3 ㎖ O 준비(약 250 μL) 15 mM의 Tricaine의 다섯 방울과 F E3 블루 솔루션은 영상 중에 포함 된 배아 위에 배치합니다. </li></ol> 라이브 Zebrafish의 배아 40, 41의 4 5D 공 촛점 이미징 참고 : 다른 공 초점 시스템을 사용하여 5D 영상을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 아리가 40 오브라이언 (41)을 참조하십시오. Z-간격, Z-스택, Z-깊이, 시간 간격 및 5D의 정의는 그림 1C를 참조하십시오. <ol><li> 이미징 소프트웨어를 열고 60X NA 1.4 대물 렌즈로 현미경을 설정합니다. 대물 렌즈에 침지 기름을 적용하고 현미경 무대에 슬라이드 홀더에 배양 접시를 놓습니다. 축 제어기를 사용하여, 대물 렌즈를 상기 관심 배아 센터와 배양 접시에 맞게 상승 대물 렌즈를 가져온다. </li><li> 눈 조각 아이콘을 클릭하고 현미경에 GFP 필터로 전환합니다. 투자 수익 (ROI)에 초점을 맞 춥니 다. O를 coverslip에 가장 가까운 조직에 초점을 것입니다최적의 촬상 결과 ffer. </li><li> 연동을 제거합니다. (소프트웨어에서 사전 설정된 파장)에 GFP 및 mCherry 채널을 선택하고 정상에 옵션을 평균 라인을 설정합니다. </li><li> 사용 &quot;보기 / 취득 컨트롤 / A1 스캔 영역&quot;은 A1 스캔 영역 도구를 엽니 명령. </li><li> 스캔을 시작합니다. 스캔 영역이 가능한 제브라만큼 충전되도록 축 제어기를 이용하여 태아의 위치. 레이저 출력은이 점에서 최적으로 할 필요가 없다. 불필요한 광표백을 피하기 위해 레이저 파워를 낮 춥니 다. </li><li> ND 취득 제어판을 열고 &quot;보기 / 취득 컨트롤 / ND 취득&quot;명령을 사용하십시오. </li><li> Z 축 스택 매개 변수를 설정 스캔을 시작합니다. 세포가 더 이상 볼 수 있습니다 위치로 Z-스택 세포에 초점이없는 경우에 상한과 하한을 설정합니다. 촬상 영역으로 확장 할 수있다 성장 및 세포 이동을 위해 샘플 위에 3 ㎛의 공간 허용한다. 이 프로에 도시 된 도면의 Z 스택로토콜은 배아의 꼬리에 40 ㎛의 Z-깊이 덮여있다. </li><li> 2 μm의에 Z-간격 스텝 크기를 설정합니다. 평균 셀 직경 10 ㎛의이며; 따라서, 2㎛는 촬상 데이터 다섯 간격은 각각의 셀에 대해 분석되도록 생성된다. 참고를 취득 할 수있는 화상의 깊이는 Z 간격에 의존한다. Z 해결 가능한 (Z-큰 깊이)와 같은 유사 분열을 겪고 많은 세포로서 이미지를 위하여 Z 차원의 전체 깊이를 얻기 위해 희생된다. Z 깊이 (Z-작은 깊이)를 희생하는 동안 그 역으로, 사실, 스텝 사이즈를 감소시킴으로써, Z 해상도가 얻어진다. </li><li> 화상 레이저 파워, HV을 조정 레벨 오프셋. 실험이 프로토콜에서 설명 들어, 다음의 레이저 파워, HV를 사용하여 GFP 채널에 각각 상응하는 레벨로 설정된 레벨을 오프셋 (5), (120) - - 2 (140), 및 -11에 -9. mCherry 채널 들어, 다음 레이저 파워, HV를 사용하고, 각 레벨을 오프셋 3-6, 120-140, 및 -3-8. 매개 변수가 설정되면, 샘플의 광독성 및 광표백 될 수 있습니다 불필요한 레이저 노출을 방지하기 위해 스캔을 종료합니다. </li><li> 2 번 라인의 평균 아이콘을 선택합니다. &quot;평균 4 배 라인은&quot;크게 스캔 시간을 증가하는 동안 &quot;아무 평균&quot;는 거친 이미지를 생성합니다. 배 선 평균의 사용은 이미지 품질과 빠른 스캔 시간 최고의 제공합니다. </li><li> 실험에 필요한 적절한 시간 간격 및 시간 지속 기간을 선택한다. 야생형 구분 내용을 2 시간 2 분의 시간 간격 (도 1,도 2,도 3a 및도 3b에서 사용) 분열 기간을 결정하기위한 최선이다. 이상 30 분 동안 스핀들 조립 검사 점을 활성화 부문도 3c에 설명 된대로 형광을 유지하기 위해 네 시간 다섯 분 간격으로 더 적합하다. </li><li> &quot;파일 저장&quot;상자를 선택하고이 획득되고 자동으로 파일을 저장할 파일 이름을 지정합니다. 모든 파 더블 체크rameters 올바르게 설정하고 &quot;실행을 시작합니다&quot;충돌한다. </li><li> 인수가 완료되면, 세 차원 형식의 파일을 볼 볼륨 임계 값 아이콘을 클릭합니다. </li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 방법의 사용은 하나가 생체 내에서 한 번에 의존하는 방식으로 두 개의 새로운 세포를 형성하는 핵 봉투 고장, 미세 소관 - 동원체 첨부하여 중기 판의 형성 및 자매 염색 분체의 분리를 유추 할 수 있습니다. 세포가 천연 생리에 묘화되기 때문에 제브라 유사 분열 관찰하는 능력은 조직 형광 단백질을 사용하기 위해, 그들은 비교적 빠른 개발 및 저속 촬상 허용하는 투명 고정 샘플 및 세포 배양 시스템에 비해 이점이있다 취득 할 수있다. 이 프로토콜에 대한 성인 제브라 피쉬의 사용으로 인해 피부 나 눈없는 두꺼운 조직으로 인해 취득 할 수 제한된 Z-깊이로 제한됩니다. H2A.F / Z-EGFP와 mCherry-CAAX 발현 트랜스 제닉 동물이 다른 돌연변이 제브라으로 mRNA의 주사 동일한 목적은 범용성 및 편리를 위해 사용될 수 있지만 유전 교배보다 유리하다. 상황에서 유사 분열 분석이고삼일 게시물 수정 (DPF) 이상 배아 필요, 형질 전환 동물로 인해이 급속하게 발전 유기체에서 RNA의 반감기에 필요하다. ...

유사 분열은 살아있는 유기체의 성장, 분화 및 재생을위한 중요한 세포 과정에 필수적이다. 정확한 준비와 계면에서 DNA의 복제하면, 셀 분할 할 준비가 끝났다. 유사 분열, 의향의 첫 단계는 사이클린 B /는 Cdk1의 활성화에 의해 개시된다. 의향은 염색체에 염색질 물질의 응축을 특징으로한다. 핵 봉투 고장 의향 및 prometaphase 사이의 전환에서 발생한다. prometaphase에서, 중심체는 스핀들 형성을위한 핵 센터는 동원체 첨부 파일의 검색 미세 소관을 확장하면서 반대 극으로 이주하기 시작합니다. 부착시, 전환은 미세 소관의 첨부 파일 - 종료하고 장력은 중기 판 (1)을 구성하는 염색체의 방향. 모든 염색체가 올바르게 연결된 경우, 스핀들 조립 검사 점은 만족 함께 자매 염색 분체를 들고 cohesin 반지가 절단되고, 미세 소관은 동생을 끌어 단축anaphase (핵분열 말기), 3 중 반대 극에 염색 분체. 마지막 단계는 telophase, 두 개의 새로운 핵 주위의 핵 봉투의 세포와 개혁의 신장을 포함한다. 세포질 분열는 두 개의 새로운 딸 세포 4-6의 세포질을 분리하여 분할 프로세스를 완료합니다. 키 유사 분열 경로 (즉, 스핀들 조립 검사 점, 중심체 복제, 자매 염색 분체의 응집, 등.)의 변경은 중기 체포, 염색체의 missegregation 및 게놈 불안정 7-10 발생할 수 있습니다. 궁극적으로, 경로 제어 유사 분열에 결함이 발달 장애 및 암, 유사 분열의 필요로 시각화 및 라이브, 척추, 다세포 유기체 10-16에서의 결함의 원인이 될 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 인해 투명한 조직, 미세 주입의 용이성, 빠른 발전에 라이브 영상을위한 훌륭한 모델 생물의 역할을한다. 제브라 피쉬를 사용하여,이 원고의 전반적인 목표는이다라이브 5D 분열 (17) (도 1C)의 (차원 X, Y, Z, 시간 및 파장) 이미징하는 방법을 설명한다. 다른 유사 분열 경로에 결함이있는 돌연변이 제브라 피쉬의 사용은 이러한 결함의 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜의 경우, 오로라 B와 Esco2 돌연변이는 이러한 결함을 설명하기 위해 선택되었다. 오로라 B는 스핀들 형성 및 미세 소관의 부착에 관여하는 염색체 승객 복잡 (CPC)의 일부인 키나제이다. 또한 세포질 분열 18,19 분열 고랑 형성을 위해 필요하다. 제브라 피쉬에서 오로라 B 결핍은 밭고랑 유도, 세포질 분열과 염색체 분리 (20)의 결함으로 이어집니다. Esco2 반면에, 자매 염색 분체의 응집 21,22 필수 인 아세틸이다. 그것은 이렇게 중기-anaphase (핵분열 말기) 천이 23 적절한 염색체 분리를 보장하기 cohesin 안정화 링 SMC3 부에 cohesin을 아세틸 레이트. 제브라 피쉬의 Esco2의 손실으로 Ch 리드romosome missegregation, 조기 자매 염색 분체 분리, 게놈의 불안정성 및 p53의 종속 및 독립적 인 세포 사멸 (24, 25). 인해 가용성 auroraB의 hi1045 및 esco2의 hi2865 돌연변이 제브라 25-27이 기술을 설명하기 위해 사용될 것이다 (이하 aurB m / m 및 m 개의 esco2 / m 각각이라 함). 형광 태그 셀 기계와 커플 링 공 초점 현미경은 유사 분열 25,28,29 동안 크로 마틴과 세포막 역학을 시각화하는 연구자 수있었습니다. 형광 태그가 히스톤은 역사적으로 염색질을 시각화하는 데 사용되었다. 히스톤은 염색체 (30)를 구성하는 뉴 클레오 구조에 대한 책임이 있습니다 네 가지 쌍 (H2A, H2B, H3 및 H4)로 구성된 핵 단백질이다. H2B는 틀림없이 형광 단백질을 가장 많이 사용되는 히스톤 동안마우스와 세포 배양, 히스톤 2A의 사용, 가족 Z (H2A.F / Z)는 제브라 피쉬 (31, 32)에 사용하기 위해 잘 입증하고있다. 콘 카나 발린 A와 카제인 키나제 1-γ는 예를 들어, 세포막에 지역화 및 이전 성게 초파리 (33, 34)의 세포막을 시각화 효과적인 것으로 나타났다. 다른 연구는 CAAX 형광 표지 된 단백질이 세포막 라벨 것을 도시 제브라 31에 성공했다. CAAX는 farnesyltransferases 및 geranylgeranyltransferases로 번역 후 수정 효소에 의해 인식되는 주제이다. 이 효소에 의해 변형 단백질 따라서 세포막 (35) 라벨, 멤브레인 관련되는 원인. 때문에 제브라 피쉬에서 사용하기 전에,이 프로토콜은 염색질과 세포막에 라벨을 H2A.F / Z와 CAAX를 사용하기로 결정했습니다. 이 방법의 응용 프로그램은 각각의 염색체를 관찰하는 연구자가 개별 세포 수준에서 유사 분열을 모니터링 할 수 있습니다역학뿐만 아니라, 동시에 조직 분화 및 발달에 영향을 미칠 수있는 여러 세포 분열을 모니터링한다. 이 문서는 개별 세포 수준에서 유사 분열시 염색체 분리의 역학 이미징에 초점을 맞출 것이다. 이 논문 내에서 여러 분열 분열 관찰 분할 시간을 계산하고, 유사 분열 표현형을 해독 할 수있는 능력은 도시되고 논의 될 것이다. 이러한 매개 변수를 사용하여 생리적으로 관련된 데이터가 수집 될 수 있고, 유사 분열 결함의 영향을 여러 질환 상태에 적용 하였다.

<table><tbody><tr><td>pCS2 벡터</td><td>K. Kwan</td><td></td>의 선물 <td>관심 플라스미드</td></tr><tr><td>NotI-HF 제한 효소</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>플라스미드 제한 분해용</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>in vitro 전사용</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>mRNA 정제용</td></tr><tr><td>100 x 15 mm 페트리 접시</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>FB0875712</td><td>배아 수용용</td></tr><tr><td>미세사출 금형</td><td>홈메이드</td><td></td><td>미세주입 중 배아 보관용</td></tr><tr><td>아가로스 II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>배아 삽입용</td></tr><tr><td>트리카인</td><td>시그마-알드리치</td><td>E10521-10G</td><td>배아 마취용</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9888</td><td>UltraPure H2O</td></tr> 염화칼륨에 용해된 배아 <tr><td></td><td>물(E3 Blue)의 경우 Sigma-Aldrich P3911 UltraPure H2O</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td>에 용해된 배아 수(E3 Blue)의 경우 <td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>배아 수2O</td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td>에 용해 <td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>UltraPure H2O</td></tr><tr><td>메틸렌 블루 하이드레이트</td>에 용해된 배아 <td></td><td>물 (E3 Blue><><)</td><td>Fisher</td></tr><tr><td></td> Scientific 50-819-812 녹은 아가르 35mm 유리 커버슬립 바닥 배양 접시 <td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>녹은 아가르</td></tr><tr><td>35mm 유리 커버슬립 바닥 배양 접시용&nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&nbsp;</td><td>0번, 20 mm 유리, 배아 매립용</td></tr><tr><td>#5 핀셋</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>배아 제거용</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 게이지 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>한천에 배아 배치용</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>배아 스크리닝 및 임베딩을 위해 모든 해부 스코프가 수행됨</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>타임 랩스 이미징</td></tr><tr><td>컨포칼 소프트웨어용</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>이미지 획득 및 처리용</td></tr></tbody></table>

라이브 zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

유사 분열은 유기체의 성장과 분화에 중요합니다. 이 과정은 매우 동적이며 작은 시간 프레임에 적절한 염색질 응축, 미세 소관 - 동원체 부착, 염색체 분리 및 세포질 분열을 수행하는 이벤트를 주문할 필요합니다. 섬세한 과정에서 오류가 출생 결함과 암을 포함하여 인간의 질병이 발생할 수 있습니다. 인간 유사 분열 질환 상태를 조사 전통적인 접근법들은 인간의 질병을 연구 할 때 천연 생리 유리한 개발 / 조직 특정 콘텍스트 부족한 세포 배양 시스템에 의존한다. 이 프로토콜은 고해상도, 척추 시스템에서 염색체 역학 제브라 피쉬으로 시각화하는 방법을 제공함으로써 많은 장애물을 극복한다. 이 프로토콜 세부 사항을 포함 분열하는 세포의 동적 이미지를 획득하는 데 사용할 수있는 방법 것 : 시험 관내 전사, 제브라 피쉬 번식 / 수집, 배아 삽입하고, 시간 경과 영상을. 최적화 및 modif이 프로토콜의 ications도 탐구한다. H2A.F / Z-EGFP를 사용하여 mCherry-CAAX (라벨 세포막) mRNA를 주입 배아, AB 야생형, auroraB의 hi1045 및 돌연변이 제브라 피쉬가 가시화 esco2의 hi2865의 유사 분열 (염색질 레이블). 제브라 피쉬의 고해상도 라이브 영상은 하나가 통계적으로 유사 분열의 결함 및 유사 분열 진행의 타이밍을 정량화하기 위해 여러 유사 분열을 관찰 할 수 있습니다. 또한, 잘못된 (즉, congression 결함, 염색체 missegregation 등) 유사 분열 과정 부적절한 염색체 결과 (즉, 염색체, 배수성, 소핵 등)을 정의 질적 측면 관찰 관찰된다. 상기 분석은 조직 분화 / 현상의 관찰에 적용 돌연변이 제브라 약리 제제의 사용 의무가 될 수있다. 유사 분열에 결함이 암과 발달 장애에 의지 크게 이끌어 방법의 시각화질병의 발병 기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

그림 2는 AB 야생형 제브라 피쉬 테일의 넓은 필드 뷰를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰 할 수있는 능력을 보여줍니다. 일곱 개 이상의 유사 분열 세포는 14 분의 시간 프레임 (동영상 1)에 몇 군데 있습니다. 두 시간 시간 코스 내에서 40 개 이상의 유사 분열 이벤트가 포착되었다. 평균적으로 50 분할 세포는 AB에서 관찰하고 AUR의 B m / m 배아 (그림 2B) 30 분열하는 세포. 묘화 셀의 수 (도 2C)을 산출 하였다 묘화 세포 유사 분열 세포 수의 비율을 차지한다. 이 데이터는 이미지화되는 AUR의 B m / m 배아 (그림 2B)하지만 세포의 적은 숫자 유사 분열을 겪고 세포의 낮은 숫자가없는 ...

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처할 형광 표지된 염색질 및 세포막 단백질을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 유사분열 중 염색체 분리의 충실도를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 유사분열 결함이 어떻게 발달 결함을 초래하는지 또는 살아있는 척추 동물 유기체에서 종양을 형성하는지와 같은 유사 분열 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 척추 동물 유기체에서 유사 분열을 관찰하여 생리학적으로 관련된 데이터를 수집 할 수 있다는 것입니다.성인 제브라피쉬를 번식시키고 알에 H2A를 주입 한 후. 이미징 약 2시간 전에 F/Z-EGFP 및/또는 pCS2 mCherry-CAAX RNA를 사용하여 형광 해부 현미경을 사용하여 GFP 양성 배아를 식별합니다. 밝은 녹색의 GFP 발현 배아를 E3 파란색 배지가 있는 새로운 100 x 15mm 페트리 접시로 이식합니다.1% 저용융 아가로스의 원액을 E3 블루로 끓입니다. 용융된 아가로스 3ml를 17 x 100mm 배양 튜브에 분취합니다. 사용할 준비가 될 때까지 배양 튜브를 섭씨 42도의 수조에 넣어 아가로스를 따뜻하게 유지합니다.15밀리몰 트리카인, 스크리닝된 배아, 저용융 아가로스, E3 블루, 35mm 유리 커버슬립 바닥 배양 접시, 해부 광학 현미경을 수집합니다. 다음으로, 5번 핀셋으로 3개의 배아에서 융모막을 조심스럽게 제거하고 배아를 별도의 용기에 넣어 마취합니다. 그런 다음 전사 피펫을 사용하여 배아와 5ml의 배지가 들어 있는 접시에 15밀리몰 트리카인 3방울을 추가합니다.15%가 녹은 아가로스 튜브에 15밀리몰 트리카인 용액 3-4방울을 떨어뜨립니다. 배아가 충분히 마취되면 P200 Pipetman을 사용하여 피펫 끝이 1cm 절단된 상태에서 마취된 배아를 커버슬립 바닥 접시로 옮깁니다. 과도한 E3 블루 트리카인 용액을 제거합니다.배아가 서로 가까이 떠다니지 않도록 각 방울을 분리하여 배아 위에 5-10마이크로리터의 저용융 아가로오스-트리카인 용액을 천천히 추가합니다. 그런 다음 21게이지 1/2 바늘을 사용하여 아가로스의 배아를 원하는 위치로 부드럽게 향하게 하고 도립 현미경을 사용하는 경우 관심 영역을 커버슬립에 최대한 가깝게 배치합니다. 발생할 수 있는 이동으로 인해 필요한 위치에 유지되도록 하기 위해 각 배아로 돌아가야 할 수도 있습니다.한천이 응고됨에 따라 이상적인 위치에 도달할 때까지 이 작업을 여러 번 수행해야 할 수도 있습니다. 몇 분 후 설정되었는지 테스트하기 위해 바늘을 사용하여 작은 아가로스 조각을 부수십시오. 방울에서 떼어낼 수 있는 경우 추가로 저용융 아가로스를 사용하여 내장된 배아 위에 돔을 형성하여 커버슬립 전체를 덮습니다.아가로스가 응고되는 동안 이미징 중에 내장된 배아 위에 놓을 15밀리몰 트리카인 5방울과 함께 E3 블루 배지 3ml를 준비합니다. 살아있는 제브라피시 배아의 5D 컨포칼 이미징을 수행하려면 이미징 소프트웨어를 열고 현미경을 60X 개구수 1.4 렌즈로 설정합니다. 렌즈에 이멀젼 오일을 바르고 배양 접시를 현미경 스테이지의 슬라이드 홀더에 놓습니다.축 컨트롤러를 사용하여 관심 배아를 대물 렌즈 위의 중앙에 놓고 배양 접시에 맞게 렌즈를 올립니다. 한천이 포함된 배아에 E3 블루 및 트리카인 용액을 붓습니다. 그런 다음 Eye Port 아이콘을 클릭하여 접안렌즈를 통해 배아를 봅니다.Eye Port 선택을 비활성화하고 View, Acquisition Controls, A1 Scan Area를 선택하여 A1 Scan Area 도구를 엽니다. GFP 채널을 선택하고 스캔을 다시 시작한 다음 커버슬립에 가까운 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 스캔을 중지하고 GFP 및 mCherry 채널을 선택한 다음 라인 평균화 옵션을 normal로 설정합니다.이제 보기, 획득 컨트롤, ND 획득을 선택하여 A1 ND 획득 도구를 엽니다. 스캔을 시작합니다. 그런 다음 축 컨트롤러를 사용하여 스캔 영역이 가능한 한 많은 제브라피시로 채워지도록 배아를 배치합니다.Z-stack 상한을 세포의 초점이 맞지 않는 위치로 설정하여 성장 및 세포 이동을 위해 샘플 위에 3마이크로미터의 추가 공간을 허용합니다. 그런 다음 셀이 더 이상 표시되지 않는 위치의 하한을 설정하고 Z 간격 단계 크기를 2마이크로미터로 설정합니다. 여기에 시연된 실험의 경우 아래 나열된 대로 이미징 레이저 출력, HV 또는 게인, 오프셋 수준을 각각 조정하십시오.매개변수가 설정되면 스캔을 차단하여 샘플의 광독성 및 광표백을 유발할 수 있는 불필요한 레이저 노출을 방지합니다. 이제 최상의 이미지 품질과 가장 빠른 스캔 시간을 제공하는 2X 라인 평균 아이콘을 선택하십시오. 실험에 필요한 적절한 시간 간격과 기간을 선택합니다.야생형 세포 분열의 경우, 2시간 동안 2분 시간 간격이 유사분열 지속시간을 결정하는 데 적합합니다. 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 30 분 이상 활성화하는 분할은 여기에서 볼 수 있듯이 형광을 보존하기 위해 4 시간 동안 4-5 분 간격에 더 적합합니다. 파일을 가져오는 동안 자동으로 저장하려면 파일에 저장 상자를 선택하고 파일 이름을 지정합니다.마지막으로 모든 매개변수가 올바르게 설정되었는지 다시 확인하고 지금 실행을 누르십시오. 획득이 완료된 후 파일을 3D 형식으로 보려면 Volume Threshold(볼륨 임계값) 아이콘을 클릭합니다. 이 그림은 AB 야생형 제브라피시 꼬리의 넓은 시야를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰할 수 있는 능력을 보여줍니다.세포 분열은 별표로 표시됩니다. 해당 동영상이 여기에 표시됩니다. 평균적으로 AB에서 50개의 분열세포와 오로라 B 돌연변이에서 30개의 분열세포가 관찰되었습니다.오로라 B 돌연변이 배아에서 이미징된 유사분열 세포의 감소된 수를 설명하기 위해, 이미징된 세포 수에 대한 유사분열 세포의 비율을 계산했는데, 이는 오로라 B 돌연변이 배아에서 유사분열을 거치는 세포의 수가 더 적은 것이 아니라 오히려 이미지화되는 전체 세포의 수가 더 적다는 것을 시사합니다. 유사분열 지속 시간을 정량화하기 위해 하나의 세포 분열을 차지하는 시간 간격의 수에 각 Z 스택 사이의 시간 간격을 곱합니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, AB 야생형 분열 시간의 평균은 25분이고, 오로라 B 돌연변이의 경우 58분이다.야생형 배아에서 볼 수 있듯이 각 유사분열 단계를 구별할 수 있습니다. 그러나 오로라 B 돌연변이 배아에서 유사분열 결함이 관찰되며, 여기에는 유사분열 정지 및 파일된 사이토키네시스가 포함되어 이핵세포가 생성되고 이후 소핵이 형성되어 이 돌연변이에서 측정된 분열 시간 증가를 뒷받침합니다. 이 기술을 완전히 익히면 배아 스크리닝부터 컨포칼 현미경 매개변수 설정에 이르기까지 1시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 관심 영역, 기간, 시간 간격 및 Z 깊이와 관련이 있으므로 당면한 실험의 컨텍스트를 기억하는 것이 중요합니다. 이는 효율성을 극대화하고 광표백 및 광독성을 방지하는 데 도움이 됩니다. 이 절차에 따라 염색체 확산과 같은 다른 방법을 수행하여 관찰된 유사분열 결함의 원인에 대한 추가 질문에 답하거나 유사분열 진행, 기간 또는 세포 운명에 대한 영향을 결정하기 위한 약물 치료 사용을 수행할 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시를 사용하여 발달 및 암 생물학의 맥락에서 유사분열을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 배아를 삽입하고, 유사분열의 실시간 이미징을 캡처하고, 유사분열 빈도, 지속 시간 및 세포 운명을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 고출력 레이저와 형광등으로 작업하는 것은 눈에 해로울 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 레이저와 직접적인 눈 접촉을 피하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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