사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

이 절차의 전반적인 목표는 선택적 배양 조건에 의해 인간 골수에서 중산혈구 전구 세포 또는 MPC를 분리하는 것입니다. 우리는 그들의 중간생성 및 혈관형성 전위를 모두 테스트하고 있습니다. 메산지생(Mesangiogenic progenitor) 세포는 임상 적용에 최적화된 mesen-ki-ma-stro-mo 세포 배양을 통해 낮은 비율로 확인되고 있습니다.

FBS가 인간 혈청으로 대체될 때. 이 기술은 실제로 독특하며, 발아 혈관 신생 및 동기화된 MSC 배양 생성에 적합한 많은 수의 alli-pol-ified NPC를 매우 일관되게 분리할 수 있습니다. 우리는 활석 혈청에서 MCS 배양을 소화 한 후 달걀 프라이 모양의 세포가 거의 붙어 있지 않지만 FPS 처리 후 MC로 분화되었을 때 이것을 발견했습니다.

인간의 골수 단핵 세포 또는 MNC를 분리하려면 먼저 5-10ml의 신선한 골수를 DPBS로 최대 50ml까지 희석하고 세포 용액을 역전으로 혼합합니다. 다음으로, 25ml의 세포를 두 개의 새로운 50ml 원추형 튜브에 균등하게 분배하고 각 튜브에 25ml의 새로운 DPBS를 추가하여 반전을 통한 두 번째 혼합을 수행합니다. 그런 다음 세포를 실온에서 쉬게 하여 미네랄 뼈 조각과 지방이 용액에서 분리되도록 합니다.

10분 후 파스투르 피펫을 사용하여 부유 지방을 조심스럽게 제거하고 미네랄 뼈 조각 펠릿을 방해하지 않고 개별 70미크론 필터를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. MNC 층을 20-25 밀리리터의 희석된 골수를 실온 위에 올려 2개의 50 밀리리터 튜브 각각에서 밀리리터당 1.007그램의 밀도 구배 배지를 분리하고 원심분리로 세포를 분리합니다. 그런 다음 멸균 파스투르 피펫을 사용하여 새로운 50ml 튜브의 입구 면에 있는 세포의 희끄무레한 고리를 모읍니다.

분리된 단핵 세포를 신선한 배양 배지로 400배 G 및 실온에서 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 5-10 밀리리터의 신선한 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. MPC를 소수성 T75 플라스크를 섭씨 37도에서 15ml의 신선한 배양 배지와 5%의 이산화탄소로 분리하기 위해.

30분 후, 플라스크당 인간 골수 단핵 세포 중 10-7개를 4-6배 파종하여 48시간 동안 배양합니다. 둘째 날에는 플라스크에서 배지 및 비부착성 세포를 버리고 세포에 15ml의 신선한 배양 배지를 공급합니다. 배양물을 6-8일 동안 배양기에 다시 넣습니다.

배양이 끝나면 새로운 DMEM으로 부착 세포를 세척합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5-15분 동안 2ml의 동물성 프로테아 분리 용액으로 세포를 배양합니다. 세포가 플라스크 바닥에서 들어 올려지면 10 밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가하여 반응을 멈추고 원심 분리로 세포를 수집하고 펠릿을 1-2 밀리리터의 신선한 배양 배지에 다시 현탁시킵니다.

MPC 플레이트를 10 제곱센티미터당 4배로 2회 계수한 후 조직 배양 처리된 T75 배양 플라스크에 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 15ml의 신선한 배양 배지에 하룻밤 동안 세포를 접착합니다. 다음날 아침, 배양된 배지를 제곱센티미터당 200마이크로리터의 미산콜멀스트로물(misancolmulstromul) 세포 또는 MSC 팽창 배지로 교체하고 7-10일 동안 세포를 배양합니다. 배양액이 3-5 배의 컨플루언스 서브 배양에 도달하면, MSC에서 2 개의 새로운 통로 합류점에 도달 할 때까지 평방 센티미터 당 3 개의 세포를 배양한 다음 프로테아 분해를 수행하여 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 수집합니다.

플레이트 2 배 10 평방 센티미터 당 네 번째 세포는 조직 배양에서 6 개의 우물 플레이트와 신선한 팽창 배지를 처리했습니다. 배양물을 다시 합류하도록 성장시킨 후 두 개의 웰을 분화가 없는 것으로 표시하고 팽창 배지를 새로 고칩니다. 두 개의 웰을 골 모세포로 표시하고 배지를 MSC 분화를 위해 특별히 설계된 표준 골 유전자 배지의 제곱센티미터당 200마이크로리터로 교체합니다.

그런 다음 두 개의 웰을 adipo 사이트로 표시하고 배지를 MSC 분화를 위해 특별히 설계된 표준 adipo genic 배지의 평방 센티미터당 200마이크로리터로 교체합니다. 세포가 분화될 때까지 2-3주 동안 세포를 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 그런 다음 여분의 세포 칼슘 침전물과 세포 지질 방울 축적을 도입하는 형광 검출로 진행합니다.

3D 스페로이드를 생산하려면 페트리 접시 뚜껑의 내부 표면에 갓 분리된 MPC 현탁액을 20마이크로 리터 방울 많이 떨어뜨립니다. 모든 방울을 조심스럽게 떨어뜨렸을 때 DPBS가 들어 있는 페트리 접시 바닥에 뚜껑을 놓고 매달린 방울 증발을 방지하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 밤새 놓습니다. 다음 날 아침, 섭씨 4도의 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 표준 엑스트라 세포 매트릭스 단백질의 300마이크로리터 알로쿼트를 추가하고 매트릭스 단백질을 섭씨 37도에서 30분 동안 겔화합니다.

겔화된 ECM 단백질에 700마이크로리터의 표준 혈관 내궁내부 성장 인자 풍부 내실 세포 성장 배지를 추가합니다. MPC가 3D 스페로이드로 응집되면 페트리 접시 뚜껑을 조심스럽게 뒤집고 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 스페로이드를 부드럽게 수확합니다. 마지막으로 스페로이드를 배양 웰에 파종하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.

형태 학적으로 MPC는 많은 philipodia를 나타내는 평평하고 얇은 주변부로 둘러싸인 두꺼운 코어 영역이있는 독특한 계란 후라이 모양이 특징입니다. 외부 세포 경계의 극 신장(polar elongation)도 종종 관찰됩니다. MSC 확장 배지에서 MPC 배양은 잔류 미분화 MPC가 여전히 검출 가능한 증식하는 평면 및 다중 분지 세포로 빠르지만 부분적인 분화를 초래합니다.

추가 배양 후 배양하면 세포와 같이 기하급수적으로 성장하는 MSC의 단층이 생성됩니다. 이 과정에서 MPC는 F-Actin을 응력 섬유로 재조직하는 반면 Nestin 발현은 몇 개의 희귀 세포에 국한됩니다. 갓 분리된 MPC의 Flows-itom-etry는 CD31 및 CD45를 발현하는 세포의 95% 이상을 보여주지만 mis-en-com-al 관련 항원 CD90 및 CD 73은 부족합니다.

이러한 최신 항원은 MSC로 완전히 분화된 후에만 높게 발현됩니다. 최소 2주 동안 분화 배지를 공급하면 mis-en-com-al 특성을 확인하면 이러한 세포는 칼슘 침전물 또는 지질 방울 축적에 의해 명백한 지방 세포로 나타나는 osteo blast로 쉽게 유도될 수 있습니다. 사전 분화된 세포 배양의 MSC 특성을 확인합니다.

MPC 유형은 발아 혈관 생성 분석에서 추가로 확인되었으며, 세포는 혈관 내피 성장 인자 자극 24시간 후 3D 스페로이드에서 myrian extra cellular matrix protein gel을 침범할 수 있는 능력을 나타냅니다. 일주일 후, 침입 세포는 훨씬 더 먼 거리로 이동하며, 침입 능력은 메산제닉 분화 후 두 번째 계대 MSC에서 손실됩니다. 일단 마스터하면 MSC 배양이 제대로 처리되면 1시간 내에 확립될 수 있으며, 일주일 이내에 100만 또는 200만 MPC를 제공할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 배양에서 사용하기 전에 human CR batch의 성능을 평가하는 것이 중요합니다. 현재 당사의 MPC 분리 프로토콜은 추가 다운스트림 적용을 위해 고재현 가능한 거의 순수한 MC 배양을 얻을 수 있는 유일한 프로토콜입니다. 개발 후 이 기술은 골격 조직 재생에 MPC를 적용할 수 있는 가능성을 모색하기 위해 세포 기반 치료 분야의 연구가 진행될 수 있는 길을 열었습니다.