Name: 전립선 암과 기타 노화 관련 병리 또는 대사 질환의 생물 물리학 트리거로 지하실 막 강성을 공부하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 학습하세요 지하실막 강성 모델링을 통해 전립선암 세포의 침습 행동을 분석하는 방법을. 이 기법은 화학, 물리학, 생물학을 결합하여 종양 미세환경을 재현하며, 노화 관련 병리 및 대사 질환 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BPH-1 세포에 대해 Simon Hayward(Vanderbilt University Medical Center)에게, 유변학적 측정에 도움을 준 Thomas Cox와 Janine Erler(코펜하겐 대학교 생명공학 연구 및 혁신 센터)에게 감사드립니다. MR-T는 전 세계 암 연구(Worldwide Cancer Research, 구 국제 암 연구 협회(The Association of International Cancer Research, JS에 08-0803 보조금), 몬테비데오 영국 대사관 및 국립 연구소 및 혁신 연구소(Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion, MR-T에 UK_RH_2015_1_2)의 자금 지원을 받았습니다. MC는 Prostate Cancer UK(JS 및 GS에 S14-017 보조금)의 지원을 받았습니다. KW는 중국 장학 위원회(China Scholarship Council)에서 자금을 지원받았습니다. MAM은 사우디아라비아 문화국의 자금 지원을 받았습니다.

<ol><li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+assembly+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li>
<li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li>
<li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li>
<li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+structure%2C+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li>
<li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+morphological%2C+biomechanical%2C+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li>
<li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line%3A+BPH-1%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li>
<li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+%28PC-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Urol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheology%22%5BJournal%5D)">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li>
<li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li>
<li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li>
<li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li>
<li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrason+Imaging%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li>
<li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benign+prostatic+hyperplasia%3A+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , Article ID:329456 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

순수 RBM 젤 6 MEC의에서 3D 선의 선포 세포의 생성을위한 프로토콜은 내가 RBM 행렬에 콜라겐 4 ㎎ / ㎖ 유형의 추가에 의해 이전의 연구에서 수정되었습니다. 콜라겐의 첨가는 1,589 ± 380 ± 175 파스칼 (37)로부터 증가 RBM 겔 탄성률 결과. 강성이 9.1 배 증가 MEC의 (21)의 성장, 생존, 마이그레이션 및 차별화를 변조. - (-) - RBM 겔에 첨가 한 타입 I 콜라겐의 비 효소 적 가교 결합을 촉진하기 리보스 프로토콜은 D와 처리 공정을 포함하여 다시 변경되었다. 강성의 결과로 15 배 증가 그들의 침략 행위 (22)을 촉진하기 위해 MEC의의 종양 변화와 협력 밝혀졌다. I가 RBM 겔 콜라겐 추가 유형의 실험 방법에만 기질 간의 물리적 배리어 후 인체 조직에서 발생하는 콜라겐 섬유와 MEC의 직접적인 상호 작용을 용이상기 BM에 의해 제공 상피 단백질 가수 분해를 거친다. 순수 RBM 젤 GLA로 사전 처리의 농도 (PEC)에서 3D 선의 선포 세포를 생성하여, 현재의 프로토콜은 BM 강성 자체가 자신의 침략 행위 (그림 3)을 실행할 수있는 방법을 연구하는 방법을 엽니 다. 이 프로토콜에 의한 BM 강성의 수준은 생리 학적 관련성을 가지고있다. 6 시간, 14 시간 동안 50 mM의 GLA와 배양은 각각 PBS (표 1)로 처리 RBM 젤 122 ± 55 파스칼에 비해 175 ± 90, 322 ± 160 순수 RBM 젤의 탄성 계수 증가했다. RBM의 강성이 1.7-3.2 배 증가는 정상 전립선 또는 BPH 조직 23-26에 비해 악성 관찰 강성에서 2.5로 3.4 배 증가 되풀이되었습니다. 최근 책에서 PEC 꽈리의 나이와 RBM 강성의 축적에 의해 유발 13 형태 학적 변화를 설명 된대로 아칸소에서 통계적으로 유의 한 변화에 대한 정량화 할 수있다다각형 모양에 ounded, 내강 / 총 선포 영역 및 AGE 풍부한 RBM (그림 3)에 acina에서 이주 돌출 세포를 감소. 면역 또한 EMT의 마커를 평가하기 위해 상기 수축 거동 (예 인산화 미오신 경쇄 -2 pMLC2 13) 강성 RBM 대 정상 성장 농도 (PEC)에서 (도 3) (E-cadherin의 (13)의 소멸)을 사용할 수있다. 130 : 및 GM130 초기 엔도 좀 항원 1 : 면역 염색 및 공 초점 현미경을 사용하여 추가 평가 (예를 들어, 라미닌, 콜라겐 IV와 AGE 축적 13), 휴대 혀끝 - 투 - 기초 극성 (예를 들어 정점 EEA1의 현지화 BM을 시각화에 적용 할 수 kDa의 시스 - 골지 마커 13)과 접착 분자의 세포 패턴 (세포 - 세포 접합 (13)에 예를 들어, E-cadherin의 현지화) (그림 3). <img aLT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3 :. 여기에 제시된 다른 프로토콜의 개요도 (준비 글리콜 알데히드 (메일 라드 반응)으로 재구성 기저막 (RBM), 뻣뻣한 RBM에게 세포를 시드하는 방법, 뻣뻣한 RBM을 분석을 단단하게하는 방법을 보여줍니다 메일 라드 반응) 및 AGE 풍부한 RBM에 의해 유도 된 세포 및 분자 변화를 분석 할 수있는 절차 정도. AGE, 당화 산물; BM, 기저막; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌; EEA1, 초기 엔도 좀 항원 (1); GAPDH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 데히드로게나; GLA, 글리콜 알데히드; GEE 글리신 에틸 에스테르; GM130, 130 kDa의 시스 - 골지 마커; P-MLC2 (Thr18 / Ser19), 미오신 경쇄-이 사이트에서 인산화 (18)과 세린 (19) 트레오닌; RBM, 재구성 기저막; SDS-PAGE 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동. RWPE1 꽈리 스케일 바 = 10 μm의; PC3 종양 전지용타원체 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림은 참조 (13)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> - (-) - 리보스 RBM위한 가교제로서 선택되는 D가 표시된 경우 단계가 필요할 것이다. (- -) - 72 시간 동안 리보오스, 이전에 RBM / 콜라겐 젤 (22)에 기재 한 바와 같이, RBM 젤의 탈수 및 수축의 결과 프로토콜 개발 과정은 1 M의 D와 치료를 한 것으로 나타났습니다. - (-) - D의 낮은 농도의 평가 리보스 짧은 치료 시간은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이된다. RBM 강성의 높은 수준이 요구되는 경우, 프로토콜의 미래의 애플리케이션에 제한 전위가 발생 될 수있다. 긴 배양 시간 및 GLA의 높은 농도가 RBM 겔 강성의 높은 수준을 유도하기 위해 사용되는 경우가 필요할 것이다<html> 이러한 처리 조건은 세포 생존 및 증식에 영향을 줄 수 있는지 여부를 미리 13 바와 같이 평가한다. 또한 혈청 RWPE-1 세포의 배양은 피해야 혈청 또는 혈청 - 함유 물질에 대한 표현형 EMT 같은 전이 노광을 유도함을 유의해야한다. 실험 짧은 RNA (siRNA의) 뉴클레오티드 간섭의 형질 전환을 포함하는 경우, 예를 들어, 절차는 낮은 혈청 형질 감염 배지로 세포를 전환하지 않고, KSFM 성장 RWPE-1 세포를 이용하여 최적화되어야한다. 일과성의 siRNA를 사용하는 모델에 접근 할 때 유전자 수준을 손상시킬 수있는 단점이 달성의 음소거. 일부 단백질 표적을 위해 그것은 조정 가능한 유전자 침묵과 단백질 수준에서 원하는 감소를위한 유도의 shRNA 벡터를 사용하는 것이 좋습니다 것입니다. 간질 세포 또는 종양 세포 관련 리실 산화 효소 (LOX) (17)에 의해 효소 가교를 통합 적응은 미래 모델에 통합 될 수있다. jove_content은 &quot;&gt;이 프로토콜은 프로 침습적 농도 (PEC)에 AGE 의존 BM 강성에 의해 트리거 메커니즘 (RWPE-1, BPH-1) 및 침입 PTCS (PC3)에 반 전이 대상의 평가의 미래 연구를 촉진 할 것이다. BPH 점을 감안 대사 장애 (27)로 간주됩니다,이 프로토콜은 또한 신진 대사 장애 및 증가 된 전립선 암 위험 사이의 링크의 우리의 개선 된 이해를 향해 길을 불법 체류자.은 AGEs에의 노출에 의해 유도 된 BM 강성이 다른 암에 침입하기위한 트리거가 될 수 있음을 감안할 때 유형은, 다른 기관 (예를 들어 유방, 결장, 난소, 췌장)에서 정상 상피 세포와 종양 세포를 포함 유사한 모델을 설정 프로토콜을 사용하여 관심을 가질 것이다. 함께 그들의 타이밍과 프로토콜 내에서 중요한 단계는도 4에 요약되어있다. 초기 단계에서는 그것의 POL 방지 해동하면서 4 ° C에서 RBM의 원액을 유지하는 것이 필수적이다ymerization. 그들은 4 ° C로 냉각 될 때까지 피펫 팁은 RM은 원액에 배치 할 수 없습니다. 다음 단계는 그들이 RBM 용액 코팅 전에 상기 챔버 슬라이드는 4 ℃에 평형화 보장하기 위하여 중요하다. 즉시 RBM 용액의 온도는 39 ° C의 이상 증가로는 겔을 형성하기 위해 비가역 중합을 거칠 것이다. 이는 필수적인 RBM은 짝수 세포 배양 및 현미경 분석에 적합한 표면을 형성하도록 중합 단계 동안 방해되지 않도록. 또는 메일 라드 반응 (시아 노 수소화 붕소 나트륨과 amingoguanidine)의 억제제없이 GLA와 인큐베이션 기간은 RBM 겔 방법 뻣뻣하게 결정할 것이다. 뻣뻣한 조건 (표 1) 필요한 경우는 반 강성 조건이 필요한 경우 GLA와 함께 6 시간 배양를 사용하는 것이 좋습니다, 14 시간 배양한다. GLA의 다른 배양 시간 또는 상이한 농도 수준 경우 사용될 수있다강성 요구된다. RBM 겔이 경우 유동 학적 분석에서 필수적인 단계로 통합 될 필요가있다. GEE 함께 배양하고 PBS로 후속 세척 단계에 의해 메일 라드 반응을 급냉하는 단계에 이어, RBM 겔 바로 사용되거나 종래의 세포 배양을위한 그들의 용도에 최대 48 시간 동안 4 ℃에서 보관. 세포 배양이 설정된 후에는 이틀 (모든 치료 포함) 배지를 변경하는 것이 중요하다. 조사중인 파라미터에 따라 3~12일 대한 3 차원 세포 배양 물을 유지하도록 권장한다. 3D를 들어 PEC는 6 일 후에 문화를 분석하는 것이 좋습니다 및 3D PTC는 첫 번째 인스턴스에서 배양 3 일 후 권장 분석을 회전 타원체위한 것입니다 꽈리. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> 그림 4 :. 중요한 단계 및 타이밍과 프로토콜의 간단한 개요 표기됩니다 플로w도 준비하고 표시된 중요한 단계 및 타이밍과 글리콜 알데히드 (메일 라드 반응)으로 재구성 기저막 (RBM)를 단단하게하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜이 중단 될 수 있고, RBM 겔 저장 지점도 표시된다. RBM, 재구성 기저막; GLA, 글리콜 알데히드; GEE 글리신 에틸 에스테르; ON, 밤새; PBS, 인산염 완충 염수; RT, 실내 온도가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

기저막(BM)은 기질(stroma1)에서 상피 세포층을 분리하여 안정적인 조직 경계를 유지하는 특수 세포외 기질(ECM) 시트입니다. BM에서 콜라겐 IV의 인접한 삼중 나선 사이의 공유 가교는 초 꼬인 나선2의 불규칙한 네트워크를 구축하여 측면 결합을 안정화합니다. 이 콜라겐 IV 격자는 라미닌 및 기타 BM 구성 요소와의 상호 작용을 위한 발판 역할을 합니다1. BM의 구조적 배열은 선상피(glandular epithelia)3의 정상적인 발달에 필요한 기계적 강도와 강성을제공한다. 
노화와 질병 중에는 BM이 점차 두꺼워지고 뻣뻣해집니다3,4. 예를 들어, 정상 인구에서 50세에서 80세 사이에 안구 BM의 탄성 계수(E)가 3배 증가하며, 이러한 경직은 당뇨병과 같은 대사 장애에서 더욱 악화됩니다5. BM의 강성을 증가시키는 구조적 및 생체역학적 변화는 ECM 구성 요소인 콜라겐 IV 및 라미닌이 고급 당화 최종 산물(AGE)에 노출된 후 비효소적으로 가교될 때 발생합니다.
여기에 설명된 방법의 목적은 전이성 전립선암(PCa)으로의 전환과 관련하여 AGE 노출로 인한 BM 경직이 전립선 상피 세포(PEC) 및 전립선 종양 세포(PTC) 침습성을 촉진하는 방법에 대한 조사를 위한 모델을 확립하는 것이었습니다. 이를 수행하기 위해, 재구성된 rBM 겔6에서 유방 상피 세포(MEC)로부터 3D 선상 아시니를 생성하는 데 사용된 이전 방법은 rBM 겔을 글리콜알데히드(GLA)로 전처리하는 추가 단계를 포함하도록 조정되었습니다. 광도 분석, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE), 컨포칼 현미경 및 유변성 분석을 포함하여 GLA 유도 가교결합 및 전처리된 rBM 겔의 보강을 평가하기 위한 여러 기술에 대해 설명합니다. 사전 경직된 rBM에서 배양을 위해 선택된 전립선 세포 유형은 다음과 같습니다: RWPE-1, 정상 전립선7에서 유래한 PEC; BPH-1, BPH8의 영향을 받는 전립선에서 유래한 PEC; 및 PC3, 전립선암(PCa) 환자의 척추뼈에 위치한 이차 종양에서 유래한 전이성 PTC9. 
전립선 병리학 연구를 발전시키는 것 외에도 GLA 치료로 rBM 겔을 강화하는 프로토콜은 BM 경직이 다른 노화 관련 병리 및 대사 장애에 어떻게 기여하는지 조사하기 위해 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 이 모델을 직접 적용하여 유방, 결장, 난소 및 췌장과 같은 장기의 BM 경직에 의해 적절한 세포 유형의 통합에 의해 전이성 암이 어떻게 유발되는지 조사할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 뻣뻣한 BM이 당뇨병 관련 미세혈관 질환, 망막병증, 신병증 및 신경병증에서 질병 진행의 생체역학적 메커니즘을 어떻게 촉진하는지 조사하기 위해 조정될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>I - 단층 배양용 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>CaP 세포주 데이터베이스</td><td>PCaCL-132</td><td>연락처: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>완전한 각질 세포 무혈청 배지&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>37°C에서 예열하지 마십시오. 사용 전</td></tr><tr><td>C 태아 종아리 혈청&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>-20 &ordm에 매장; 부분 표본</td></tr><tr><td>PC의 C3&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수 (Dulbecco A) 정제</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>R5886 37</td><td>&ordm에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>II - 3D 배양용 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>아미노구아니딘 하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>396494</td><td>눈, 호흡기 시스템 및 피부에 자극적인</td></tr><tr><td>챔버 슬라이드, 8-웰&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>문화 매트릭스 재구성 기저막(rBM) 감소 성장 인자 추출물&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>-80 &ordm에 기저막(BM)을 보관하십시오. 부분 표본의 C</td></tr><tr><td>시아노겐 브로마이드&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>접촉 피부 및 흡입에 의해 독성</td></tr>이 있습니다. <tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Glycine 에틸 에스테르 염산염 (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>눈에 자극적인</td></tr><tr><td>글리콜알데히드 이합체 (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cyanoborohydride&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>고인화성; 접촉 피부 및 흡입에 의한 독성</td></tr><tr><td>주사기 필터 0.22 미크론</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>III - Maillard 반응을 정량화하는 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>감광성 및 -20°C 온도에서 보관; 부분 표본의 C</td></tr><tr><td>복제 실린더</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H + L) Alexa Fluor 488 접합체</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>감광</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (H + L) Alexa Fluor 488 접합체</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>감광</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>-20 &ordm에 저장; 부분 표본</td></tr><tr><td>Vectashield 장착 매체의 C&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 펜토시딘 클론 PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>-20 &ordm에 저장; C 부분 표본</td></tr><tr><td>토끼 항-인간 콜라겐 IV 다클론 항체&nbsp; &nbsp;</td><td>Acris 항체</td><td>R1041</td><td>-20 &ordm에 저장; C 부분 표본</td></tr><tr><td>토끼 안티 라미닌 A / C pAb</td><td>산타 크루즈 생명 공학 Inc</td><td>sc-7292</td><td>-20 &ordm에 저장; C 부분 표본 중</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르(Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트(Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>투석 카세트 Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>IV - 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 제어 변형 회전 레오미터</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert S100(20X 배율) 현미경</td><td>Zeiss</td> Axio S100 현미경용 Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 제어 가습 배양 챔버</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Axiovert 200M (40X, 63X 배율) 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A 현미경은 위상차를 사용하는 디지털 카메라가 장착되어 있습니다&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar Plus 플레이트 리더 분광 광도계</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>V - 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>National Institute of Health, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress</td><td>분자 다이비츠</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전립선 암과 기타 노화 관련 병리 또는 대사 질환의 생물 물리학 트리거로 지하실 막 강성을 공부하는 방법

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

여기서 우리는 연령과 관련된 병리 및 대사성 질환 (예를 들면 암, 당뇨병, 미세 혈관 질환, 망막증, 신장 병증 및 신경 병증) 중에 증가 된 두께 및 기저막 (BM)의 강도에 관련된 생물 물리학 적 미세 환경을 연구하는데 사용될 수있는 프로토콜을 설명 . 모델의 전제는 메일 라드 반응 (Maillard reaction)을 통해 당화 최종 생성물 인 (AGE) 생성을 촉진하는 글리콜 알데히드 (GLA)로 처리하여 재구성 BM (RBM) 행렬의 비 효소 가교이다. AGE 생성 비 효소 적 가교 결합을 확인하는데 사용 GLA의 강성을 증가시킬 수 실험실 기술로서는 RBM이 설명되어 처리 하였다. 광도 분석 및 면역 형광 현미경, 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드에 의한 그것의 비 효소 가교의 AGE 함량 : 이러한 결정 용 (GLA 처리) 단단한 RBM (포스페이트 - 완충 염수, PBS 처리) 네이티브 RBM의 제조를 포함겔 전기 영동 (SDS 페이지)과 공 초점 현미경, 그 증가 된 강성 사용 유변학. 여기에 설명 된 절차는 병든 인간 전립선 조직에 비해 건강에 대한 측정과 일치 3.2 배까지 RBM의 강성 (탄성 계수, E)을 증가시키기 위해 사용될 수있다. 노화와 질병 전립선과 관련된 생물 물리학 적 미세 환경을 다시 만들려면 세 가지 전립선 세포 유형을 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM에에 소개 된 글 랜드 : RWPE-1, 전립선 상피 세포 (농도 (PEC)) 정상 전립선에서 파생 된; BPH-1, 양성 전립선 비대증 (BPH)에 의해 영향을받는 전립선 유래의 농도 (PEC); 및 PC3 전이성 세포들은 전립선 암 유래 이차 골 종양으로부터 유래. 여러 매개 변수의 크기, 형상 및 강성 RBM 대 네이티브에 RWPE-1 BPH-1에 의해 형성된 3 차원 샘 꽈리의 침입 특성, 및 평균 셀 길이 이동성 속도 및 3D spher의 세포 이동의 지속성을 포함한 측정 할 수있다동일한 조건 하에서 PC3 세포에 의해 형성 된 OID. 경로 및 단백질의 세포 내 지역화 신​​호 셀도 평가 될 수있다.

뻣뻣한 RBM에 3D 전립선 선포 세포 배양 문화 6 일 후, 농도 (PEC)이 정상 전립선 조직에서 파생 된 (RWPE-1) (그림 1A)와 BPH 조직 (BPH-1) 상피의 균일 한 회전 타원체로 구성됩니다 (그림 1B) 기본 (PBS 치료) RBM에 양식 꽈리 세포. 이 꽈리는 극성 - 기초 - 정점 및 가시 내강 공간 13, 20 고도로 조직 된 페치 특성을 가지고있다. 정상 전립선 조직에서 파생 된 농도 (PEC)에 의해 형성된 꽈리 (RWPE-1) (그림 1A) 및 (GLA 처리) 보강 (AGE 리치) RBM에 BPH 조직 (BPH-1) (그림 1B)를 중단 구조를 가지고 (이동 모양과 세포의 다각형에 구상에서) 나이가 풍부한 RBM) (그림 1A로 선포 세포에서 이주 / 돌출. 이들<html> 꽈리 또한 작거나 존재하지 않는 공간 (13) 내강 그들의 정점 간 기저 극성을 잃었다 고 무질서 농도 (PEC)을 특징으로한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> 그림 1 :. 기본 및 뻣뻣한 재구성 지하 막 (RBM)에 3D 샘 꽈리로 자란 전립선 상피 세포 (A) RWPE-1 세포의 브라이트 이미지는 PBS (기본) 또는 처리 RBM 젤 6 일 12 시간까지 재배 14 시간 (; 뻣뻣한 AGE 리치) 50 MM의 글리콜 알데히드; 스케일 바는 50 μm의 =. 패널 (A)에 기재된 바와 같이 재배 (B) BPH-1 세포; 스케일 바는 50 μm의 =; 데이터는 3 독립적 인 실험의 대표입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> 표 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; 표 1. 기본, 세미 뻣뻣한과 까다로운 재구성 지하 막 (RBM)에 재배 전립선 상피 RWPE-1 꽈리의 특성 RWPE-1 꽈리 GLA (RBM 14 시간 (기본), 글리콜 알데히드 PBS로 전처리 성장했다 ) 6 시간 동안 (반 강성) 또는 14 시간 (딱딱한)에 대한 GLA. 선포 모양의 경우, 백분율 (%)은 라운드의 표준 편차 (SD)를 ±, 반 다각형과 다각형 꽈리는 (50 꽈리는 조건에 따라 정량) 5 독립적 인 실험에서 계산 하였다. 상대 선포 크기는 세 독립적 인 실험에서 (기본 RBM = 100 %)을 산출 하였다. 침입 들어, 하나 이상의 돌출 세포 SD 된 꽈리 % ± 3 독립적 인 실험으로부터 계산 하였다. 배 변화 기본 조건에 대응하는 값에 의해, 반 강성 또는 강성 조건에서 얻어진 평균값으로 나누어 계산한다. P 값은 스튜던트 t 검정 (α = 0.05)을 사용하여 계산 하였다. ontent &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; AGE 따라 증가 RBM 강성은 PC3 전립선 종양 세포의 이동을 촉진 PC3 세포는 나이가 풍부한 (딱딱한)에 성장하는 반면 기본 RBM 성장 PC3 세포는 서로 (그림 2A)에서 독립적으로 연속 세포 - 세포 접촉을 유지하여 RBM 움직임을 마이그레이션 할 수 있습니다. 문화 PC3 세포에 72 시간은 기본에 초점 (타원체)를 형성 한 후 회전 타원체에서하지 않고 독립적으로 (그림 2B)를 마이그레이션 강성 (AGE 리치) RBM에 PC3 세포 반면, RBM을 (PBS 치료). 뻣뻣한 (AGE 리치) RBM에 PC3 세포는 기본 RBM (그림 2C)에 성장 PC3 세포보다 더 긴합니다. 뻣뻣한 RBM에 PC3 세포는 기본 RBM (그림 2D)에 성장 PC3 세포보다 더 빠르게 이동한다. 뻣뻣한 RBM에 PC3 세포는 네이티브 RBM (도 2e) 상에 성장 PC3 세포에 비해 지속성의 저하를 표시. <img aLT = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 :. 기본 및 뻣뻣한 재구성 지하 막 (RBM)에 전립선 종양 세포 마이그레이션 (A) 14 시간 동안 PBS (기본) 또는 50 밀리미터 글리콜 알데히드로 처리 RBM 젤에 성장 PC3 세포의 브라이트 이미지 (AGE-풍부하고 뻣뻣한) . 세포를 명 시야 현미경 (10X 대물 렌즈) 및 궤도를 생성하는 트래킹 셀 다음 12 시간 동안 시간 당 1 화상의 취득 속도를 사용하여 영상화되었다. 도시 된 이미지는 0, 3, 6, 9 및 12 시간 이후의 시점에 대응한다. 단일 세포의 궤도는 12 시간 시점에 대해 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. 패널 (A)에 기재된 바와 같이 (B) PC3 세포는 72 시간 동안 천연 또는 뻣뻣한 RBM상에서 배양하고, 묘화. 스케일 바 = 100 μm의. 세부 배의 배율에서 선택한 영역을 보여줍니다. (C) 평균 ± SD 셀 길이 (μm의); 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM 사이에 유의 한 차이 (p = 1.2 × 10 -23). ( <str셀 궤도 계산 옹&gt; D) 평균 ± SD 속도 (μm의 / 시간) 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM (P = 0.004) 사이의 유의 한 차이. 세포 이동 (E) 평균 ± SD 지속성 (비 D / T, 여기서 D = 처음부터 셀 궤도, 세포 궤도의 T는 = 총 길이의 끝 부분까지의 거리) 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM (P = 0.0007) 사이에 유의 한 차이. CE&gt; 10 세포를 분석 하였다 패널의 경우, 데이터가 3 독립적 인 실험의 대표입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 가교 및 당화 산물 (은 AGEs)에 의해 유도 된 기저막 (BM)의 증가 강성 병리학 적 관련성이있는 생물 물리학 적 미세 환경을 모델링하기위한 프로토콜을 설명합니다.

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

이 모델의 전반적인 목표는 당화 최종 산물(advanced glycation end-products) 노출로 인한 기저막의 강성과 두께 변화가 전립선암 전이의 초기 및 진행 단계에 따른 침습적 세포 행동을 어떻게 조절하는지 연구하는 것입니다. 이 방법은 기저막의 강성과 두께 증가가 암의 진행뿐만 아니라 당뇨병과 같은 대사 질환에 어떻게 기여하는지와 같이 노화 관련 병리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 임상 환경에서 측정된 인간 전립선 종양의 강도 수준을 모방할 수 있는 간단한 방법을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 함의는 기저막의 강도가 어떻게 분자 및 세포 변화를 촉진하는지에 대한 이해를 높임으로써 전립선암의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 이 모델은 다학제적 성격을 띠고 있어, 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 초기 수행에 어려움을 겪을 수 있습니다.화학, 물리학, 생물학 분야의 기술을 결합하였습니다. 우리는 전립선으로의 기저막 강성이 기 전환된 상피 세포의 새로운 침습적 행동을 촉진할 수 있다는 가설을 세웠을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 학제 간 단계들에 대한 설명이 필요하므로, 이 방법에 대한 비디오 시연이 매우 중요합니다.기저막의 가교 결합과 그에 따른 3D 세포 배양을 포함합니다. 먼저 얼음을 평평하게 깔아 표면을 만들고, 이를 이용해 8-웰 챔버 글라스 슬라이드를 4 °C로 냉각하십시오. 그다음, 200 µL 피펫 팁의 끝부분을 잘라내고, 해당 팁 또한 4 °C로 냉각하십시오.냉각 후, 팁을 200 µL 용량의 피펫 보조 기구에 장착합니다. 이를 사용하여 얼음처럼 차가운 BM matrix 용액 40 µL를 냉각된 8-웰 챔버 유리 슬라이드의 각 웰에 분주합니다. 그다음 챔버 슬라이드를 37 °C에서 30분 동안 배양하여 기저막의 중합을 촉진합니다.액상으로 재구성된 기저막이 흐트러지지 않도록 인큐베이터 문을 매우 조심스럽게 닫으십시오. 정확히 30분 후에, 중합된 재구성 기저막을 덮을 수 있도록 준비된 glycolaldehyde 용액 250 µL를 추가합니다. 다음으로, 천연 재구성 기저막 젤에 멸균 PDS 250 µL를 추가하여 음성 대조군을 준비합니다.또한, 기저막 젤에 첨가하기 전 글리콜알데히드 솔루션에 50 millimolar 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 250 millimolar 아미노구아니딘을 각각 첨가하여 두 개의 추가 대조군을 준비합니다. 그 후, 젤을 37 °C에서 6시간 동안 배양하여 반경성(semi-stiff) 젤을 생성하거나, 14시간 동안 배양하여 경성(stiff) 젤을 생성합니다.배양 후, 겔에서 용액을 조심스럽게 제거하고 각 겔에 1 M glycine ethyl ester 250 µL를 첨가합니다. 그리고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. glycolaldehyde 용액과 glycine ethyl ester의 모든 흔적을 제거하기 위해 각 겔을 500 µL의 PBS로 10회 세척합니다.그 다음 탈수를 방지하기 위해 PBS 400 µL를 첨가하고, 재구성된 기저막 젤을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 계속 진행할 준비가 되면 재구성된 기저막 젤에서 PBS를 제거하고, 각 웰에 얼음처럼 차가운 2중 증류수 250 µL를 첨가합니다. 매트릭스가 완전히 액화되도록 4 °C에서 16~24시간 동안 젤을 배양합니다.그 다음 액화된 기저막을 1.5 milliliter 튜브로 옮기고, 분광광도계를 사용하여 용액의 형광 방출을 측정합니다. 이어서 용액을 원심분리하고 생성된 상층액을 제거합니다. 펠릿을 20 milligrams per milliliter의 cyanogen bromide와 70% formic acid가 포함된 500 microliters 용액에 재현탁합니다.샘플을 상온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그다음, 1 mL 일회용 주사기를 사용하여 재현탁된 기저막 젤을 분자량 컷오프 3.5 kDa의 투석 카세트에 옮깁니다. 이 카세트를 500 mL의 2차 증류수가 담긴 500 mL 유리 비커에 담급니다.마그네틱 스터 바를 사용하여 물을 교반합니다. 이 설정을 4 °C에서 하룻밤 동안 유지하여 시아노겐 브로마이드와 포름산의 모든 흔적을 제거합니다. 1 mL 일회용 주사기를 사용하여 카세트에서 투석된 용액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.그 다음, 12% polyacrylamide 겔에서 용액을 전기영동하여 분석합니다. silver stain으로 겔을 염색하여 cyanogen bromide matrix 펩타이드의 전기영동 패턴을 시각화합니다. PBS로 덮인 기저막 겔을 사용하여, 0.1 millimoles의 calcium chloride가 포함된 300 microliters의 PBS로 겔을 두 번 더 헹굽니다.그리고 0.5 millimoles의 염화마그네슘을 넣고 실온에서 5분 동안 둡니다. 그 다음, PBS를 제거하고 재구성된 각 기저막 젤이 잠길 정도로 300 microliters의 4% paraformaldehyde를 첨가합니다.재구성된 기저막 성분을 고정하기 위해 젤을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 고정액을 제거하고 75 millimoles의 염화암모늄과 0.5 millimoles의 염화마그네슘이 포함된 퀀칭 솔루션(quenching solution) 300 microliters를 첨가합니다. 상온에서 5분 동안 배양한 후, 솔루션을 제거하고 헹굼 과정을 4회 더 반복합니다.마지막 세척 후, 비특이적 반응을 방지하기 위해 재구성된 기저막 겔에 300 µL의 면역형광 버퍼를 추가합니다. 쉐이킹 플랫폼 위에서 실온으로 2시간 동안 겔을 해당 용액에 넣어 배양합니다. 그 후 면역형광 블로킹 버퍼를 제거합니다.블로킹 버퍼로 희석한 1차 항체 300 µL를 추가합니다. 재구성된 기저막 겔을 4°C에서 16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 1차 항체를 제거하고 면역형광 버퍼 300 µL로 겔을 3회 세척합니다.각 버퍼를 추가한 후, 진탕 플랫폼(shaking platform)에서 실온으로 10분 동안 겔을 흔들어 줍니다. 그 다음 버퍼를 제거하고, 블로킹 버퍼에 희석한 300 µL의 형광 표지 2차 항체를 첨가합니다. 샘플을 진탕 플랫폼에 올리고, 실온에서 2시간 동안 겔을 배양합니다.2차 항체를 제거합니다. 면역형광 버퍼로 시료를 헹군 다음 PBS로 헹구고, 시료를 두 번째로 고정 및 퀀칭(quench)합니다. 마지막으로 겔을 마운팅하고 현미경을 사용하여 조밀한 번들의 형성을 분석합니다.전립선 샘 선포(acini)를 형성하려면, 2% 기저막 용액이 첨가된 300 µL의 완전 KSFM에 5,000개의 RWPE-1 세포를 희석합니다. 전립선 종양 세포 응집체의 경우, 2% 기저막 용액이 첨가된 300 µL의 RPMI-1640 배양 배지에 2,500개의 PC3 세포를 희석합니다. 재구성된 기저막 겔을 PBS에서 하룻밤 동안 배양한 후, 500 µL의 배양 배지로 두 번 헹굽니다.세포를 파종하기 전, 천연 및 당화최종산물(advanced glycation end product)로 경화시킨 재구성 기저막 위에 세포를 조심스럽게 파종합니다. 그 후, 성장하는 선조직(acini)과 구상체(spheroids)가 고르게 분포될 수 있도록 배양 용기를 인큐베이터에 주의 깊게 넣습니다.포피(acini) 형성 세포의 경우, 정상적인 포피 항상성에 필요한 성장 인자를 확보할 수 있도록 2%의 기저막 용액이 포함된 신선한 배양 배지로 2일마다 배지를 교체합니다. 배양 6일 후, 전립선 상피 세포는 천연 재구성 기저막 위에서 포피를 형성합니다.그리고 상피 세포의 균일한 구상체로 조직됩니다. 이러한 선포(acini)는 정단부-기저부 극성을 가진 고도로 조직화된 PEC의 특성과 가시적인 내강 공간을 가지고 있습니다. 경직된 막 위에서 6일 동안 배양했을 때, 세포들은 파괴된 구조를 보입니다.또한 형태가 구형에서 다각형으로 변합니다. 게다가 이러한 선포들은 매우 무질서하며, 내강 공간이 작거나 거의 없어 정단-기저 극성을 상실한 상태입니다.이는 양성 전립선 비대증이 있는 전립선에서 유래한 세포의 경우에도 마찬가지입니다. 전립선 종양 세포를 측정했을 때, 세포는 강도가 높은 재구성된 기저막 위에서 더 길게 나타났으며, 이동 속도가 더 빠르고 세포 지속성 또한 증가한 것으로 확인되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 기저막의 강도가 상피 세포 및 종양 세포의 행동에 미치는 영향을 모델링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.본 절차를 수행할 때, 원하는 수준의 기저막 강도가 유도되고 개별 선포(acini) 또는 s-spheroids가 적절하게 형성되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 개발 이후 종양학 분야의 연구자들이 전립선에서 기저막 강도에 의한 암세포 침윤 유도를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 본 프로토콜 이후, 기저막 강도에 의해 조절되는 신호 전달 경로와 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 세포 용해물(cell lysate)의 면역블롯팅(immunoblotting)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 시아노젠 브로마이드(cyanogen bromide) 및 포름산(formic acid)을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 반드시 흄 후드 내에서 작업하며 실험복, 장갑, 안면 보호구 및 호흡기 보호구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

how-to-study-basement-membrane-stiffness-as-biophysical-trigger

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델...

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

우리는 원자력 현미경을 사용하여 마우스에서 대동맥을 분리하고 탄성 계수를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

이 프로토콜은 쥐 폐 조직의 냉동 절편을 준비하고, 원자력 현미경 힘 매핑 실험을 수행하고, 데이터를 분석하여 천연 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하는 방법을 시각화합니다.

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Young's Modulus 추출

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

학습하세요 지하실막 강성 모델링을 통해 전립선암 세포의 침습 행동을 분석하는 방법을. 이 기법은 화학, 물리학, 생물학을 결합하여 종양 미세환경을 재현하며, 노화 관련 병리 및 대사 질환 연구에 활용됩니다.

전립선 암과 기타 노화 관련 병리 또는 대사 질환의 생물 물리학 트리거로 지하실 막 강성을 공부하는 방법

더 많은 동영상 탐색