전립선 암과 기타 노화 관련 병리 또는 대사 질환의 생물 물리학 트리거로 지하실 막 강성을 공부하는 방법

이 모델의 전반적인 목표는 진행된 당화 및 제품 노출로 인한 기저막 강성과 두께가 전이성 전립선암의 초기 및 진행 단계에 해당하는 침습성 세포 행동을 어떻게 조절할 수 있는지 조사하는 것입니다. 이 방법은 연령 관련 병리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 증가된 기저막의 강성과 두께가 암 진행에 어떻게 기여하는지, 그리고 당뇨병과 같은 대사 장애도 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 임상 환경에서 인간 전립선 종양에서 측정된 경직 수준을 모방하는 간단한 방법을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 기저막 강성이 분자 및 세포 변화를 촉진하는 방법에 대한 이해를 향상시킴으로써 전립선암의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 모델이 다학제적이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

화학, 물리학 및 생물학 분야의 기술을 결합합니다. 우리는 전립선의 기저막 경직이 알려진 변형된 상피 세포에서 새로운 침습적 행동을 촉진할 수 있다는 가설을 세웠을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법의 비디오 시연은 학제 간 단계를 설명해야 하기 때문에 매우 중요합니다.

기저막의 가교 결합을 포함하여 3D 세포 배양을 수행합니다. 먼저 평평한 얼음 표면을 준비하고 이를 사용하여 8웰 챔버 유리 슬라이드를 섭씨 4도까지 냉각합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫 팁의 끝을 자르고 팁도 섭씨 4도로 식힙니다.

냉각되면 팁을 200마이크로리터 용량의 피펫팅 보조 장치에 놓습니다. 그리고 이를 사용하여 40마이크로리터의 얼음처럼 차가운 BM 매트릭스 용액을 냉각된 8웰 챔버 유리 슬라이드의 각 웰로 옮깁니다. 그런 다음 챔버 슬라이드를 섭씨 37도에서 30분 동안 배치하여 기저막의 중합을 촉진합니다.

액체로 재구성 된 기저막을 방해하지 않도록 인큐베이터 도어를 매우 조심스럽게 닫으십시오. 정확히 30분 후, 준비된 글리콜알데히드 용액 250마이크로리터를 추가하여 중합되고 재구성된 기저막을 덮습니다. 다음으로, 250개의 멸균 PDS를 재구성된 기본 기저 멤브레인 겔에 추가하여 음성 대조군을 준비합니다.

또한 기저 멤브레인 겔에 추가하기 전에 글리콜알데히드 용액에 50밀리몰 시아노보로하이드라이드 나트륨 또는 250밀리몰 아미노구아니딘을 추가하여 두 가지 추가 대조군을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 6시간 동안 젤을 배양하여 반쯤 뻣뻣한 젤을 만듭니다. 또는 뻣뻣한 젤을 생성하기 위해 14 시간 동안.

배양 후 겔에서 용액을 조심스럽게 제거하고 각 겔에 1 몰 글리신 에틸 에스테르 250 마이크로 리터를 첨가하십시오. 그리고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 각 젤을 PBS의 500 mircoliters에 10 번 세척하여 글리콜 알데히드 용액과 글리신 에틸 에스테르의 모든 흔적을 제거하십시오.

그런 다음 탈수를 방지하기 위해 400마이크로리터의 PBS를 추가하고 재구성된 기저막 겔을 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 계속할 준비가 되면 재구성된 기저막 젤에서 PBS를 제거하고 각 웰에 얼음처럼 차가운 이중 증류수 250마이크로리터를 추가합니다. 매트릭스가 완전히 액화되도록 섭씨 4도에서 16-24시간 동안 겔을 배양합니다.

그런 다음 액화된 기저막을 1.5ml 튜브로 옮기고 분광 광도계를 사용하여 용액의 형광 방출을 측정합니다. 그런 다음 용액을 원심 분리하고 생성된 상층액을 제거합니다. 500 밀리리터당 20 밀리그램의 시아노겐 브로마이드와 70% 포름산을 함유한 용액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

샘플을 실온에서 밤새 배양합니다. 다음으로, 1밀리리터 일회용 주사기를 사용하여 다시 현탁된 기저막 겔을 분자량 컷오프가 3.5킬로달톤인 투석 카세트로 옮깁니다. 500밀리리터의 이중 증류수가 들어 있는 500밀리리터 유리 비커에 카세트를 담그십시오.

그리고 마그네틱 교반 막대로 물을 저어줍니다. 이 설정을 섭씨 4도에서 밤새 두어 시아노겐, 브로마이드 및 포름산의 모든 흔적을 제거합니다. 1밀리리터 일회용 주사기를 사용하여 다이얼화된 용액을 카세트에서 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 솔루션을 실행하여 솔루션을 분석합니다. 겔을 은 염색으로 염색하여 시아노겐 브로마이드 매트릭스 펩타이드의 전기영동 패턴을 시각화합니다. PBS로 덮인 기저막 젤부터 시작하여 0.1밀리몰의 염화칼슘이 포함된 300마이크로리터의 PBS로 겔을 두 번 더 헹굽니다.

그리고 0.5 밀리몰의 염화 마그네슘. 실온에서 5분 동안. 그런 다음 PBS를 제거하고 300마이크로리터의 4% 파라포름알데히드를 추가하여 재구성된 각 기저 멤브레인 젤을 덮습니다.

재구성된 기저막 구성 요소를 고정하기 위해 실온에서 30분 동안 겔을 배양합니다. 다음으로, 정착액을 제거하고 75 밀리몰의 염화 암모늄과 0.5 밀리몰의 염화 마그네슘을 포함하는 담금질 용액 300 마이크로 리터를 첨가하십시오. 용액을 실온에서 5분 동안 배양한 다음 용액을 제거하고 헹구기를 4회 더 반복합니다.

최종 헹굼 후 재구성된 기저 멤브레인 겔에 300마이크로리터의 면역형광 완충액을 추가하여 비특이적 반응을 방지합니다. 용액의 겔을 진탕 플랫폼에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 면역형광 차단 버퍼를 제거합니다.

그리고 차단 완충액에 희석된 1차 항체 300마이크로리터를 추가합니다. 재구성된 기저막 겔을 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 1차 항체를 제거하고 300마이크로리터의 면역형광 완충액으로 겔을 세 번 세척합니다.

완충액을 추가할 때마다 10분 동안 진탕 플랫폼에서 실온에서 젤을 흔듭니다. 그런 다음 완충액을 제거하고 차단 완충액에 희석된 형광 표지된 2차 항체 300마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 진탕 플랫폼에 놓고 실온에서 2시간 동안 겔을 배양합니다.

2차 항체를 제거합니다. 면역형광 완충액으로 샘플을 헹구고 PBS를 투여한 다음 샘플을 두 번째로 고정하고 담금질합니다. 마지막으로 겔을 장착하고 현미경을 사용하여 조밀한 다발의 형성을 분석합니다.

전립선 acini를 형성하기 위하여는, 5, 000의 RWPE-1 세포를 300 마이크로리터의 완전한 KSFM에 있는 묽게 하고, 기저막 해결책의 2%로 보충하십시오. 전립선 종양 세포 응집체의 경우, 300 마이크로리터의 RPMI-1640 배양 배지에 2, 500 PC3 세포를 희석하고 기저막 용액의 2%를 보충합니다. PBS에서 재구성된 기저막 겔을 하룻밤 동안 배양한 후 500마이크로리터의 배양 배지로 두 번 헹굽니다.

세포를 파종하기 전에. 세포를 네이티브 및 고급 당화 최종 산물인 보강된 재구성된 기저막에 부드럽게 파종합니다. 그리고 성장하는 아시니와 스페로이드가 고르게 분포할 수 있도록 배양액을 인큐베이터에 조심스럽게 배치하십시오.

acini 형성 세포의 경우, 기저막 용액의 2 %를 함유 한 신선한 배양 배지로 2 일마다 배지를 교체하십시오. 세포가 정상적인 아시니 항상성에 필요한 성장 인자를 갖도록 합니다. 배양에서 6일 후, 전립선 상피 세포는 천연 재구성된 기저막에서 아시니를 형성합니다.

그리고 상피 세포의 균일한 스페로이드로 조직됩니다. 이러한 acini는 또한 정점에서 기저 극성을 가진 고도로 조직화된 PEC와 눈에 보이는 내강 공간의 특성을 가지고 있습니다. 굳어진 막에서 6일 동안 배양하면 세포의 구조가 파괴됩니다.

그리고 모양이 구형에서 다각형으로 변경됩니다. 또한 이러한 acini는 매우 무질서합니다. 그리고 정점을 기저 극성으로 잃었고, 작거나 존재하지 않는 발광 공간을 가지고 있습니다.

이는 양성 전립선 비대증의 영향을 받는 전립선에서 유래한 세포에도 해당됩니다. 전립선 종양 세포를 측정했을 때, 뻣뻣하고 재구성된 기저막에서 세포가 더 길고 더 빠르게 이동하고 세포 지속성이 증가한 것으로 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기저막 경직이 상피 및 종양 세포 거동에 미치는 영향을 모델링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 원하는 수준의 기저막 강성이 유도되고 개별 아시니 또는 S-스페로이드가 적절하게 형성된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 전립선의 기저막 경직에 의한 암세포 침입 유도를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 프로토콜에 따라 세포 용해물의 면역 블로팅과 같은 다른 방법을 수행하여 기저막 강성에 의해 조절되는 신호 경로와 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다.

시아노보로수소화나트륨, 시안노겐 브로마이드 및 포름산으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 흄 후드에서 작업하는 동안 실험실 가운, 장갑, 안면 보호대 및 호흡기를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.