Name: 진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 배우세요 진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA를 게놈 차원으로 정화하고 증폭하는 Circle-Seq 방법을. Saccharomyces cerevisiae를 사용하여 고감도로 eccDNA를 검출하고 유전체 안정성 연구에 활용할 수 있습니다.

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기술 지원을 해준 Kenn D. Møller와 Claus Sternberg(DTU)와 정량적 PCR 분석을 제공한 Tue S. Jørgensen에게 감사드립니다.

주 : 원형 DNA 정제와 시퀀싱 방법 (원-SEQ)의 개요는도 1에 도시되어있다. 1. 배양, 세포 수확 및 플라즈마 멤브레인 혼란 <ol><li> 효모 펩톤 덱스 트로 오스 50 ml의 완전한 영양 배지 (YPD) 내로 O / N 문화에서 (예 : 사카로 마이 세스 세레 비지에 대한) 효모 세포를 접종한다. 1-3 X 105 세포 / ml의 낮은 초기 세포 밀도 또는 대략 0.01 OD 600의 광학 밀도로 접종한다. <ol><li> 세포가 약 24 시간 또는 OD 600&gt; 10.0에서 광학 밀도 48 후, 약 1 × 10 10 세포의 최대 세포 밀도에 도달 할 때까지 분 (RPM) 당 150 원에서 교반하면서 30 ° C에서 세포를 품어. 주 : 낮은 세포 농도가 사용될 수있는 바와 같이, 배양 시간은 중요하지 않다. </li></ol></li><li> , 50 ML 원뿔 튜브에 능가 문화를 전송에서 원심 분리하여 세포를 펠릿800 XG에 3 분 동안 상층 액을 버린다. </li><li> 3 분 800 XG에서 원심 분리하여 세포를 다시 펠렛 상층 액을 버리고, 10 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA, pH가 8.0 25 ml의 완충 용액으로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 플라스미드 컬럼 정제 키트로부터 공급 된 1.2 ml의 재현 탁 완충액에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 선택 단계 : 원형 DNA 요소 (20)의 정제를 위해 컨트롤과 같은 높은 희석 플라스미드를 추가합니다. 주 : 현재의 데이터 세트에서, 7.7 μL 플라스미드 혼합물 10 10 세포를 포함하는 각 샘플에 대해 적용 하였다. 플라스미드 재고 혼합물 다른 농도의 세 가지 플라스미드 구성; 0.01 NG / 샘플의 38 NG / 샘플에서 나 pBR322, pUC19를 0.5 NG / 샘플에서, 그리고 pUG72. </li><li> 총 현탁 부피 : 3 비율이 2 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송하고, 각각은 1에서 0.5 mm의 유리 비드로 보충. </li><li> 플라즈마 셀을 방해 10 분간 볼텍스 최대 속도로 각 튜브막. 30 초 동안 268 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛 새로​​운 튜브에 두 가지의 microcentrifuge 튜브에서 1.2 ml의를 결합 뜨는을 전송합니다. 참고 : 얼터너티브 0.6 ml의 부유 완충 용액의 세포를 파괴하는 zymolyase를 사용, 1.6-1.7를 진행한다. zymolyase 십 단위는 35 ° C에서 1.5 시간에서 5 × 10 7 세포를 파괴 할 수 있습니다. </li></ol> 컬럼 크로마토 그래피 2. EccDNA 심화 <ol><li> 플라스미드의 열 정제 키트에서 프로토콜을 따르십시오. 간단히, 1.2 ml의 알칼리 용액으로 각각의 샘플을 치료, 부드럽게 섞어 실온에서 3 분을 품어. </li><li> 1.2 ml의 중화 버퍼를 추가 5 분 9650 XG에 부드럽게 원심 분리기 섞는다. </li><li> 1 ML의 평형 용액과 평형을 열 상에 솔루션을로드하고 액체가 중력에 의해 열을 통과 할 수 있습니다. </li><li> 4 ml의 세척 용액으로 열을 씻으십시오. 용액이 수지를 통과 할 때 조심스럽게 0.3 ㎖의 용출 정도 추가lution는 0.35 ml의 컬럼 공극 부피의 대부분을 대체합니다. </li><li> 1 ㎖의 용출 용액 새로운 포집 관에 DNA를 용리 0.8 mL의 침전 혼합물을 첨가하여 DNA를 침전. 10 분 동안 9,650 XG에 원심 분리기. </li><li> 5 ~ 15 분 동안 5 분, 공기 건조를 위해 9650 XG에 0.5 ml의 70 % 에탄올, 원심 분리기와 DNA 펠렛을 씻고 25 ㎕를 멸균 물에 정제 된 DNA를 용해. 참고 : 물에 DNA 만, 단기간의 운용을 권장합니다. 우선적으로 3 단계로 직접 진행합니다. </li></ol> 3. 소화 선형 염색체 DNA 남은의 <ol><li> 선택 단계 : 엑소 뉴 클레아 제에 의해 선형 DNA의 특정 소화를 촉진 등을 NotI으로​​ 드문 절단 효소로 정제 된 DNA를 치료합니다. 5 μg의 DNA를 들어, 50 μL의 총 부피로 1 단위를 NotI, 5 ㎕의 10 배 소화 버퍼와 멸균 수를 사용합니다. 16 시간 가열하여 37 ℃에서 반응물을 인큐베이션을 5 분 동안 80 ℃에서 효소를 실활. </li><li> 20 추가단위 엑소 뉴 클레아 제 (2 μL) 4 μL의 ATP (25 mM)을 34 ㎕의 멸균 수와 50 ㎕의 효소 절단 된 DNA에 직접적으로 10 ㎕의 10 배 반응 완충액은 ATP 의존적 엑소 뉴 클레아 제를 사용하여 100 μL의 1X 반응 부피에 도달 전부. </li><li> 오일 이상 37 ° C에서 선형 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA의 가수 분해를 수행합니다. 추가로 4 μL의 ATP (25 mM)을 0.6 ㎕의 10 배 반응 버퍼와 1 배 반응 볼륨 효소 DNA의 소화를 계속 매 24 시간을 엑소 뉴 클레아 제 20 단위를 추가합니다. </li><li> 선형 DNA 제거한 후, 엑소 뉴 클레아 제 처리 용액으로부터 샘플 2 μL은 액틴 유전자 ACT1 20 염색체 마커를 사용하여 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)에 의해 염색체 선형 DNA의 제거를 확인한다. <ol><li> 각 20 μL qPCR의 반응 부피는 2 μL의 엑소 뉴 클레아 제 처리 된 샘플을 150 nm의 ACT1 프라이머 5&#39;-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;와 5&#39;-TGGACCACTTTCGTC를 포함GTATTC-3 &#39;, 2 % (부피 / 부피), 디메틸 술폭 시드 및 10 ㎕의 녹색 형광 마스터 믹스. </li><li> 반응 조건을 사용하여, 95 ° C에서 15 초 45주기와 60 ° C에서 30 초 다음에 95 ° C에서 3 분. 참고 :이 유전자의 복제 수 변이 너무 eccDNA는 ACT1을 수행하지 않아야 21-23 해로운 때문에 ACT1 선형 DNA에 특히 적합한 마커입니다. </li><li> qPCR에 의해 DNA 소화의 분석에 대한 대안은 표준 PCR (4.3) 또는 프로피 디움 요오드 염색 (4.4)입니다. <ol><li> ACT1 프라이머 5&#39;-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;와-GAACGACGTGAGTAACACC-3 5&#39;&#39;와 PCR 템플릿으로 2 μL의 엑소 뉴 클레아 제 처리 된 샘플을 사용합니다. 긍정적 인 ACT1 컨트롤로, 게놈 S.을 ng를 50 ~ 100을 사용 템플릿으로 cerevisiae의 DNA. PCR 반응 조건; 95 ° C, 56 ° C에서 30 초, 72 ℃에서 1 분 30 초 35주기 다음 95 ℃에서 3 분. </li><li> 겔 electrophore에 의해 실행 PCR은 반응0.5 μg의 1 % 아가로 오스에 동생 / ㎖ 에티 디움 브로마이드. 0.8 킬로바이트 ACT1 밴드를 찾습니다. </li></ol></li><li> 부재 또는 선형 DNA의 존재는 이전과 DNA 증폭 후 요오드화 프로피 듐 염색에 의해 검사 될 수있다. <ol><li> 20 mM의 요오드화 프로피 듐 주식의 1,000 H 2 O 희석 용액 : 1과 1 볼륨 : 1의 각 DNA 샘플을 섞는다. 실온에서 10 ~ 20 분 동안 어둠 속에서 해결책을두고 663-738 nm의 5 ~ 30 초 노출 시간에 빨간색 여기 형광 필터를 사용하여 100 배 배율에서 형광 현미경으로 DNA 염색을 분석 할 수 있습니다. DNA-염색 대조군으로 사용 효모 및 / 또는 ø29 증폭 플라스미드에서 게놈 DNA를 ø29은 증폭. </li></ol></li></ol></li><li> 가열을 30 분 동안 70 ° C에서 엑소 뉴 클레아 제 용액을 비활성화한다. </li></ol> 4. DNA 증폭 <ol><li> (가) 정제 증폭 ø29 DNA 중합 효소 24-26 협정과 단계 3.5)에서 eccDNA을 강화중합 효소 제조 업체의 프로토콜에 보내고. <ol><li> 간단히, 5 ㎕의 변성 버퍼로 eccDNA 풍부한 5 μl를 섞는다. </li><li> RT에서 3 분 후, 10 ㎕의 중화 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 믹스 29 μl의 반응 버퍼와 1 μl를 ø29 DNA 중합 효소를 포함하는 30 μl의 마스터 믹스를 추가합니다. (72 시간까지) 16 시간 이상 30 ° C에서 반응을 품어. 열은 3 분 동안 65 ° C에서 ø29의 DNA 폴리머 라제를 불 활성화. </li></ol></li></ol> 5. 시퀀싱 및 데이터 분석 <ol><li> 300 bp의 평균 목표 최대 크기 집속 초음파로 증폭 eccDNA 전단. 130 ㎕의 DNA 샘플에 대해 다음 설정을 사용하여 450W 피크 강도 전력, 60 초 처리, 30 %의 듀티 계수, 버스트 당 200 사이클, 온도 7 ℃로한다. </li><li> 조각난 라이브러리 준비를위한 적절한 방법을 사용하여 시퀀싱 라이브러리의 합성 읽기에 바코드 인덱스 라벨 및 어댑터를 추가합니다. </li><li>141 - 염기 단일 엔드는 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼에서 읽을 때, 예를 들어, 깊은 순서를 실행합니다. </li><li> 지도 조사중인 효모 참조 게놈을 읽고 수 있도록 여러 영역에 매핑 읽습니다. 예를 들어, 자유롭게 사용할 워크 플로우 시스템 27, 28 및 짧은 읽기 정렬 매핑 소프트웨어 (29)를 사용합니다. </li><li> 확인하고 간격 (20)없이, 예를 들어, 7 개 이상의 연속 읽기 읽기 연속 (&gt; 1킬로바이트)를 사용하여 추정 eccDNAs 지역에서 읽습니다. 참고 : 소프트웨어를 사용할 수있는 매핑 탐험 27,28 관심의 게놈 영역에서 읽습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

서클-SEQ 방법은 시퀀스 레벨 해상도 효모 세포 eccDNA 게놈 크기의 검출을 허용한다. 상기 방법은 집중 소용돌이 또는 피펫을 필요로하고, 다음 단계에서 엑소 뉴 클레아 제 소화에 이어질 것이다 eccDNA 파괴를 제한하는 중력 컬럼 분리를 사용하지 않는 온화한 eccDNA 정제이다. 방법의 이러한 기능은 유전자 서열을 포함하는 큰 eccDNAs을 검출하기위한 중요 할 수있다. 원 - 서열 전체 유전자 (데이터 집합 1) 등 다양한 eccDNAs를 발견했습니다. 또한 86 킬로바이트 효모 미토콘드리아 DNA를 발견했습니다. 따라서,이 프로토콜은 대형 원형 DNA 요​​소의 정화를 용이하게한다. 최소 DNA 추출 단계의 수를 유지하는 eccDNA 손실 위험을 감소시키고 수율을 최대화한다. 제어 결과에 기초하여, 아군 된 플라스미드, 원형 서열이 2500 세포로부터 단일 원형 DNA를 검출하는 매우 민감하다. 또한, 이러한 2μ 같은 풍부한 내인성 플라스미드를 제거; 플라스미드 또는 미토콘드리아 DNA는 크게 감도를 향상시킬 수 있습니다. 효모 문화 2μ의 경화 (30)을 설명 하였다. 또한, 2μ 및 미토콘드리아 DNA의 제거는 SwaI 같은 희귀 절단 효소, 달성 될 수 있습니다. 그러나, 제한 효소 공정은 다른 관심 eccDNAs 타겟팅 및 eccDNA 총 생산량을 제한 할 수있다. eccDNA 검출을위한 중요한 단계는 적절한 깊이로 선형 DNA (3 단계) 및 DNA 시퀀싱 (5 단계)을 제거했다. 셀 인구에서 eccDNAs의 대부분을 기록하려면, 깊은 시퀀싱 (20)를해야 할 수도 있습니다. 원형 DNA 접합이 페어 엔드를 얻을 것으로 예상 discordantly 그지도를 읽고대로 쌍 엔드 시퀀싱, eccDNA 검출의 더 큰 신뢰를 제공해야합니다. 이러한 불일치는 원형 DNA 구조의 검색을 지원 잠재적 추가 eccDNA 검출 필터로서 사용된다. 서클 - 괜찮다Q 방법은 3 개의 독립적 인 S.를 이용하여 검증 하였다 cerevisiae의 CEN.PK 인구. 감지 서열은 이전에 eccDNAs, 내생 플라스미드를보고 아군 된 플라스미드 및 추정 eccDNAs (데이터 집합 1) 수백 포함되어 있습니다. 이러한 연구 결과는 S.에서 이전 원 - 서열 데이터 세트를 지원 cerevisiae의 S288c 20. CEN.PK 및 S288c 집단에 공통적 인 몇 가지 eccDNAs의 발견은 이러한 궤적이 같은 원형 요소 (그림 4)이 존재하는 성향이 있음을 나타냅니다. 우리는 이전에 다른 변형 배경에 [GAP1 원]의 증거가 발견되지 않았습니다 불구하고 [GAP1 원이]를 CEN.PK 배경 8 질소 제한된 조건에서 농축되는 것으로 나타났습니다. S288c 및 CEN.PK 모두에서 CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 및 HXT6 HXT7 궤적에서 eccDNA의 발견은 DNA의 회람에 대한 경향은 사기꾼입니다 제안효모 균주 사이에 봉사했다. [HXT6 / 7 원], [ASP3-1 원], [COS111 원] 및 [CUP1-1 RSC30 원]을 세포 또는 경우에 선택적 이점을 부여하는 경우 그것은 그들의 존재는 단지 높은 비율의 효과가 나타 남아 DNA의 회람. 종합하면, 결과는 원형 서열이 킬로 크기 eccDNAs 검출에 적합하고 완전한 유전자 eccDNAs를 식별하는 장점을 가지고 있음을 나타낸다. 원 - 서열은 효모에서 eccDNAs의 전체 게놈 규모의 스크린을 가능하게하는 매우 중요한 방법이다. 서클-SEQ 방법은, 유전자 증폭 및 삭제를 생성 eccDNA의 역할을 해명을 목표로 연구의 새로운 필드를 열 수있다. DNA 구조와 구조가 크게 높은 진핵 생물에 진핵 효모에서 보존되는 점을 감안, 서클-SEQ 방법은 원칙적으로 상 해당해야한다약간의 수정과 함께, 모든 진핵 세포에 전자. 현재 방법은 megabase 크기 eccDNAs를 정화하는 능력이 아직 표시하도록했지만, 어떤 제한이 나타나지 않는다. 또한, 롤링 써클 증폭 방법 (31)을 사용 ø29 DNA 중합 효소의 사용, eccDNA 정량보다 어렵게 작은 eccDNAs쪽으로의 바이어스를 생성한다. 원형 서열 인간 체세포에서 두 분 원형 DNA에 대한 연구에 적합하다, 전체 유전자를 운반하기에 충분히 큰 eccDNAs를 검출한다. 프로토 암 유전자가 이러한 요소 32-37에서 증폭 할 때 두 분은 암에 기여할 수있다. 생식선 세포 eccDNAs의 연구는 생식 계열 돌연변이 비율을 측정하고, 가축, 예를 들어, 정자의 품질을 평가하는데 사용될 수있다. 따라서, 원형 서열이 유전자 저작권법과 관련된 질환의 새로운 이해 유전 적 변이는 카피 수 변화의 형태로 발생하는 속도에 대한 통찰력을 수득하고 유도 할 가능성이있다수 변동 38-40.

이 세포의 큰 인구에 단일 DNA 분자의 변화를 확인이 필요하기 때문에 초기 또는 과도 염색체 증폭을 검출하는 것은 어렵다. 염색체 복사 번호 변형 (CNVs)은 일반적으로 변화 1, 2를 생성 메커니즘의 증거로 만 최종 CNV 구조를 떠나, 그들의 설립 후 잘 검출된다. 검출 및 유전자 재 배열에서 진행중인 프로세스를 규명 할 수 맥락막 신생 혈관 형성의 초기 단계에서 염색체 외 원형 DNA (eccDNA)를 복구. 이전의 eccDNA 새로이 발견 전자 현미경 3 중기 염색체 4, 2 차원 전기 영동 5 김사 염색 하였다. 이러한 방법은 원형 DNA의 서열에 대해 거의 또는 전혀 정보를 제공합니다. 이러한 남부는 현장 hybridizatio에서 PCR 8, 반대 6, 7, 또는 형광을 블로 팅으로 대상 기술N 9 특정 eccDNA 요소에 대한 증거를 제공합니다. 이러한 방법 중 어느 것도 셀 인구에있는 기존의 모든 eccDNA 유형의 순서를 제공하지 않습니다. 세포의 풀에서 발산 게놈은 게놈 서열 및 / 또는 타일 어레이 (10, 11)을 특징으로 할 수있다. 종래 DNA 정제 방법에 의해 결실 또는 증폭을 검출하는 것은 일반적으로 돌연변이 된 대립 유전자는 세포 집단 (12, 13)의 적어도 0.1 %를 나타내는 것을 필요로한다. Acentric eccDNAs 인해 자신의 중심절의 부족과 복제에서 DNA 합성의 가능성이없는 경우에 세포 배양에 더욱 과도 것으로 예상된다. 대부분은 아마도 eccDNAs 소량에 있고 그 서열이 게놈 유사 보낸 따라서, 다른 DNA 추출 방법 eccDNAs를 검출 할 필요가있다. 몇몇 원형 DNA 정제 기술은 염색체 DNA 원형의 구조적 차이를 이용한다. 예 고속 용 ultracentrifug염화 세슘 구배에 ATION 인간 헬라 암 세포주 14 350-3000 염기쌍 (BP) 큰 eccDNAs을 분리하는데 사용된다. 그러나, 고속의 침강 속도 (15) 및 eccDNA 수율 변경 닉 수퍼 코일을 원형 DNA 구조의 골격을 끊거나 할 수있다. 두타와 동료는 드 노보, 마우스 조직에서뿐만 아니라 닭의 문화와 인간의 세포 (16, 17)에서 원형 DNA의 게놈 규모 식별하는 방법을 개발했다. 그들의 방법은 플라스미드 정제 및 효소 반응 및 DNA의 추출 몇 차례 뒤에 자당 초 원심 분리에 의한 균질 조직에서 핵의 추출이다. 이들 프로토콜은 주로 200 ~ 400 염기쌍의 eccDNAs라는 microDNAs를 식별합니다. 두타와 동료는 사카로 마이 세스 세레 비지에서 microDNAs의 정화를 시도했지만이 효모 종 16 microDNA를 기록 할 수 없습니다. 우리는 새로운 방법을 개발했다원 - 서열라는 효모에서 eccDNA의 드 노보 검출. 이 방법은 전체 유전자를 수행하기에 충분히 큰 및 86 킬로 (킬로바이트) 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아 DNA)로 큰 원형의 DNA 분자에 대한 게놈 규모의 설문 조사를 할 수 있습니다. 서클-SEQ 방법은 진핵 효모 세포에 최적화 깊은 서열과 결합 잘 설립 원핵 플라스미드 정제 방법 (18, 19)에서 개발되었다. 서클-서열 접근, 1756 다른 eccDNAs, 모든보다 큰 1킬로바이트를 사용하여 10 S.에서 검출되었다 cerevisiae의 S288c 20를 집단. 크기 컷 - 오프는 전체 유전자를 수행하기에 충분히 큰했다 eccDNA에 초점을 선택되었다. 원 - 서열은 매우 민감; 그것은 전지 (20)의 수천에서 하나의 eccDNA를 발견했습니다. 현재 연구에서, 원형 서열이 분리 다른 S. 세 생물학적 복제에서 294 eccDNAs를 식별하는 데 사용 cerevisiae의 효모 균주, CEN.PK. 데이터 eccDNA 공통 유전자 eleme이라고 밝혀S.에서 NT cerevisiae의 변종.

<table><tbody><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD Difco</td><td>211677</td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>브릴리언트 III SYBR 그린 PCR 마스터 믹스&nbsp;</td><td>애질런트 테크놀로지</td>스 <td>600882</td><td>qPCR 분석용. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>포도당(D-glucose)</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.4</td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>디스럽터 비드, 0.5mm</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-BG05</td><td>형질세포막을 파괴하는 유리구슬. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr>에<td>티듐 브로마이드</td><td>Carl Roth</td><td>2218.2</td><td>DNA/RNA 검출을 위한 아가로스 겔 염색제.</td></tr><tr><td>GeneJet 플라스미드 miniprep kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0502</td><td>박테리아에서 추출한 플라스미드 정제. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NotI, FastDigest</td><td>Life Technologies -&nbsp; Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>FD0594</td><td>엔도뉴클레아제. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>플라스미드 미니 AX 키트&nbsp;</td><td>에이& A Biotechnology, Poland</td><td>010-50</td><td>Plasmid purifcation kit은 eccDNA를 정제하는 데 사용됩니다. &nbsp;</td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit</td><td>Epicentre, USA</td><td>E3105K</td><td>ATP-의존성 엑소뉴클레아제 키트. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>81845</td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>pUG6 플라스미드</td><td>EUROSCARF, 독일</td><td>P30114</td><td>마커 유전자 : loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP.</td></tr><tr><td>QIAGEN 게놈-팁 100/G&nbsp;</td><td>Qiagen, USA</td><td>13343</td><td>효모에서 게놈 DNA 정제. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>REPLI-g 미니 키트 프로토콜&nbsp;</td><td>Qiagen, 미국</td><td>150023</td><td>phi29 중합효소에 의한 eccDNA의 증폭.</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Difco</td><td>210929</td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme)</td><td>Nordic BioSite, Sweden</td><td>Z1004-3</td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td><염기서열 파일에 대한 strong>데이터 액세스</td><td>European Nucleotide Archive&nbsp;</td><td></td><td>Saccharomyces cerevisiae CEN의 EccDNA 데이터 세트. PK113-7D입니다. 연구 등록 번호 PRJEB9684. 2번째 식별 번호는 ERP010820입니다. 궤적 태그 접두사는 BN2032입니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae CEN. PK113-7D</td><td></td><td></td><td>유전자형 MATa MAL2-8c SUC2</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae 효모 삭제 라이브러리 풀</td><td>EUROSCARF, 독일</td><td></td><td>S288c BY4741 KanMX 모듈에 의해 disrubted 4400 실행 가능한 단일 유전자 결실 돌연변이 풀. 유전자형 MATa his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 met15&델타; 0 ura3&델타; 0 genexxx::KanMX.</em</td></tr><tr><td>>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 분광 광도계&nbsp;</td><td>NanoDrop 1000 분광광도계, DNA</td> 농도를 측정하는 Thermo Fisher<td></td><td>. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>형광 현미경 검사</td><td>법 Nikon Optronics Magnafire. 적색 여기 형광 필터, 663-738nm.</td><td></td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>로봇 라이브러리 구축 시스템</td><td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td><td></td><td>DNA 라이브러리 준비. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>염기서열분석 플랫폼</td><td>Illumina HiSeq 2000 플랫폼, Illumina Inc.</td><td></td><td>DNA 염기서열분석. 대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>초음파기</td><td>, Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes</td><td></td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Methods</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% YPD media&nbsp;</td><td></td><td></td><td>포도당 10g, 효모 추출물 10g, 박토 펩톤 20g을 혼합하고 총 부피 1000ml에 H2O를 첨가하고 오토클레이브</td></tr>를 사용합니다.<tr><td>게놈 DNA</td><td></td><td></td>에 대한 Circle-Seq 테스트 <td>게놈 DNA는 효모 결실 라이브러리(Euroscarf)의 풀에서 정제(Qiagen)되었습니다. DNA 농도는 nanodrop 및 30 &micro; g 게놈 DNA를 두 개의 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 주입했습니다. 마이크로 원심분리기 튜브 1개에 100나노그램 플라스미드(pUG6)를 보충했습니다. DNA 샘플은 프로토콜 단계 1.1-1.3 및 1.5-1.7을 생략하고 Circle-Seq에 의해 정제되었습니다. 용출된 DNA 농도는 나노드롭으로 측정하고 샘플 GD 및 GD+P의 전체 DNA 수율을 29시간 동안 엑소뉴클레아제로 처리했습니다. phi29 증폭 및 PCR 분석을 위해 10% 분획을 수집하고, 나머지 DNA는 72시간 엑소뉴클레아제 처리를 진행했습니다. 샘플은 ACT1 유전자를 염색체 마커로 사용하여 PCR에 의해 선형 DNA 함량을 분석했습니다. 엑소뉴클레아제로 처리된 각 샘플의 5% 분획을 phi29 DNA 중합효소에 의해 16시간 동안 증폭했습니다(Qiagen). 각 샘플에 DNA의 존재 여부는 동일한 양(7 &micro; l) 0.5 &micro의 우물에서; g/ml 에티듐-브로마이드 0.9% 아가로스 젤 실행 후 젤-전기영동.&nbsp;</td></tr><tr><td>매핑 소프트웨어</td><td>Bowtie2 aligner, John Hopkins University</td><td></td><td>Ultrafast short read alignment. 참조:: 29.</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드 염색</td><td></td><td></td><td>프로피듐 요오드 염색 DNA의 이미지는 동일한 노출 시간(5초)을 사용하여 RFP 채널(적색 여기 형광 필터, 663-738 nm)에서 100배 확대(100x/1.30 오일, 니콘)로 형광 현미경으로 캡처되었습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>워크플로우 생물정보학 시스템</td><td>은하계, 오픈 소스.</td><td></td><td>데이터 집약적인 생물 의학 연구를 위한 무료 웹 기반 플랫폼입니다. 참조: 27-28.</td></tr></tbody></table>

진핵 세포에서 염색체 외 원형 dna의 게놈 차원의 정화

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

<html> 염색체 외 원형 DNA를 (eccDNAs)는 사카로 마이 세스 세레 비지에 공통의 유전 적 요소뿐만 아니라 다른 진핵 생물에서보고됩니다. EccDNAs는 다세포 생물의 체세포들과 단세포 진핵 생물의 진화에 유전 적 변이에 기여한다. eccDNA을 검출하기위한 민감한 방법은 이러한 요소 게놈 안정성과 방법 환경 및 생물학적 요인 진핵 세포에서의 형성을 유도에 미치는 영향을 명확히 할 필요가있다. 이 동영상은 원 - 서열라는 민감한 eccDNA 정제 방법을 제시한다. 상기 방법은 원형의 DNA, 선형 염색체 DNA, eccDNA 롤링 써클 증폭 깊은 시퀀싱 매핑 잔여 제거 칼럼 정제를 포함한다. 광범위한 엑소 뉴 클레아 제 처리를 충분히 선형 염색체 DNA의 분해에 요구되었다. 하여 롤링 써클 증폭 공정오프라인 - 높이 :. 정상; &quot;10 10 세포의 세 S. cerevisiae의 CEN.PK 인구의 원-SEQ 방법&gt; 선형 DNA를 통해 원형 DNA에 대한 풍부한 φ (29) 중합 효소 유효성 검사는 1 킬로보다 큰 크기의 eccDNA 프로파일 수백 검출 . ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, S288c 및 CEN.PK는 DNA의 회람이 유전자좌에서 균주 사이에 보존되는 것을 알 수 모두에서 원형 DNA에 HXT7 유전자. 합에서의 반복 된 결과, 서클-SEQ 방법은 광범위한있다 진핵 생물뿐만 아니라 특정 eccDNA 유형을 검출 eccDNA위한 게놈 규모 스크리닝 적용.

서클-SEQ 방법, 세 S.의 유효성을 검사하려면 세포 10 세대에 YPD에서 개별적으로 재배 된 후 1 × 10 10 세포의 cerevisiae의 CEN.PK 인구가 상영되었다. 이전 20 (데이터 미도시) 한 바와 같이 염색체 DNA 선형 제거는 ACT1 qPCR의 신호의 유무에 의해 확인 하였다. 정제 및 농축 eccDNA가 6800 만까지 서열화 된 읽기 (141 뉴클레오티드 단일 엔드 읽기)과 CEN.PK113-7D 참조 게놈 (버전 2012년 6월 19일)에 매핑. C1, C2와 C4라는 3 개의 시료에서 추정 eccDNAs의 녹음이 읽고 더 이상 1킬로바이트 이상 연속으로 매핑 게놈 영역에 할당되었다. 10,000 몬테카를로 시뮬레이션에 기초하여, 연속하여 매핑 된 각 영역의 중요성 1킬로바이트 추정 된 것보다 긴 판독한다. 이 79, 159, 56 지역은 가능성이 eccDNA 시퀀스 (p &lt;0.1, 데이터 집합 1)로 주석되었다에서. 녹음 contiguo의 수미국&gt; 1킬로바이트 샘플이 상기 (도 2) 서열 되었다면 더욱 eccDNA 요소가 기록되어있는 것이 시사 시퀀스 깊이의 함수로서 증가 읽는다. 예상 된 바와 같이, 원형 서열 방법은 다수의 염색체 XII의 2μ 플라스미드를 비롯한 공지 원형 DNA 요​​소 미토콘드리아 DNA, 리보솜 RNA 유전자의 수로부터 판독 추출한 샘플로 스파이크 된 3 개의 내부 제어 플라스미드는 pBR322, pUC19를하고 pUG72 단지 열 정화 (그림 3) 전. 동영상은 연속의 예는 염색체 IV에 HXT7 _ARS432_ HXT6 궤적에 매핑 된 것을 읽 보여줍니다. 이전에는 [HXT6 / 7 원]를 열 S288c 인구 (1 × 10 10 세포와 각)과 원형 DNA 구조에서 원 - 서열에 의해 발견 된이 역 PCR 분석 (20)에 의해 확인되었다. 에서 [HXT6 / 7 CIrcle] 또한 세 CEN.PK 인구 (그림 4A)의 각각 기록했다. 또한, CEN.PK의 복제 샘플 중 일반 eccDNA 유전자의 대부분은 S288c 데이터 세트 (그림 4B)에서 eccDNA 유전자를 중첩. 원형 DNA 정제, 30 μg의 게놈 DNA를 가진 두 개의 샘플 각각에 대한 원-SEQ 프로토콜의 특이성을 테스트하려면 시험 하였다. 하나의 샘플은 원 - 서열 프로토콜에 의해 정제 하였다 두 샘플에서 100 ng의 플라스미드 DNA와 eccDNA 보충했다. 컬럼 분리 한 후, DNA 수율은 플라스미드 (GD)과 플라스미드와 샘플 1.60 % (480 NG) (GD + P)없이 샘플 1.27 % (380 NG를)였다. 엑소 뉴 클레아 제 처리의 효율성. 29 시간 및 ACT1 대해 PCR을 사용하여 72 시간 후에 선형 DNA 함량에 대해 시험 된 어떠한 샘플 (데이타 미기재) ACT1 증폭되지 함유 하였다. 각각의 엑소 뉴 클레아 제 처리 된 샘플의 일부를 추가로했다ø29에 의해 mplified 효소 및 효소 반응의 생성물은 요오드화 프로피 듐 염색 (도 5A-F) 및 아가 로스 겔 전기 영동 (도 5G)로 분석 하였다. 엑소 뉴 클레아 제 처리 후 샘플을 최소한 프로피 듐 요오드 염색 (도 5A-B)를 나타냈다. ø29 - 만 게놈 DNA를 증폭 샘플 컨트롤 샘플 (그림 5E)와 유사한 스레드 같은 구조 (그림 5C)를 밝혔다. ø29 - 추가 플라스미드를했다 증폭 된 샘플은 플라스미드 제어 (그림 5 층) 닮은 초점 (그림 5D)를 밝혔다. 이미지는 ø29 폴리머 선형 DNA를 통해 원형 DNA에 대한 풍부한 것으로 나타났다. 대부분의 선형 염색체 DNA는 29 시간의 엑소 뉴 클레아 제 처리 (그림 5A-B, G) 후 샘플에서 제거되었습니다. 그러나 광범위한 엑소 뉴 클레아의 100 개 이상의 시간 동안 처리 및 사용하여 100 개 이상의 단위이었다<html> 증폭 된 샘플 여전히 72 시간의 엑소 뉴 클레아 제 처리 (그림 5C-D) 후 스레드 같은 구조의 배경을 보여 주었다 - ø29 같이, 모든 염색체 선형 DNA를 제거 할 필요가 있었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> . 컬럼 크로마토 그래피의 용출액 분획 선형 염색체 DNA 잔존 3) 소화 4) 증폭 1) 세포 배양, 2) 정제 eccDNA의 농축 : 서클-SEQ 방법 그림 1. 개요 프로토콜은 5 단계를 가진다 ø29 DNA 중합 효소, 그리고 고농축 eccDNA 5) 시퀀싱 및 매핑에 의해 DNA는 S.을 읽고 cerevisiae의 참조 게놈. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 연속 시퀀스 깊이의 함수로&gt; 1킬로바이트을 읽습니다. EccDNA 1 × 10 10 세포 (매핑 읽기의 수백만) 순서 깊이의 함수로 증가에서. 도시 : 반수체 CEN.PK S.에서 생물학적 삼중 10 10 세포 분열에 의해 분리 cerevisiae의 인구 (C1, C2, C4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> 알려진 원형 DNA 요소의 그림 3. 감지. (AB)이 CEN.PK 생물의 플라스미드 백분율로 읽기 범위의 플롯을 (밀도를 읽기) 분산 형은 C1, C2와 C4를 복제합니다. 했다 매핑 (A)는 내생 효모 플라스미드를 읽 2μ을; [rDNA의 원(염색체 XII에서 리보솜 RNA 유전자); 및 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아 DNA). (B) 플라스미드는 고유 제어 매핑 읽는다. 제어 플라스미드 칼럼 정제 전에 샘플로 스파이크 하였다. 셀 당 플라스미드 비율이었다 : 나 pBR322 (더하기 기호) 1 : 1, pUC19를 (원) 1시 50분 및 pUG72 (삼각형) 1 : 2500. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> CEN.PK와 S288c 그림 4. 일반 eccDNA 요소입니다. (A) 벤 다이어그램 (476) 사이에 중첩 표시 세 CEN.PK 샘플 (C1, C2, C4)에 294 eccDNA 요​​소에 유전자. 16 공통 중복 eccDNA 유전자 / 플라스미드 (모든 유전자 이름이 데이터 집합 1에) 주석이 있습니다. S1-S2, R1-R4 : 10 S288c 샘플들로부터 추정 eccDNAs에 기록 된 모든 유전자에 비해 (B) 세 CEN.PK 샘플 (C1, C2, C4)에서 추정 eccDNAs에 기록 된 모든 유전자의 벤 다이어그램,, Z1-Z4는 (참고 20 참조). 유전자 / 플라스미드 및 2 변형 배경과 중 3 인 이상 실험 설정의 최소 중복 추정 eccDNA 지역 13 생물학적 복제 (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3)가 표시됩니다. C 샘플, CEN.PK; R과 Z 샘플, S288c BY4741; S 샘플, S288c M3750. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> 도 엑소 뉴 클레아 후 DNA 시료 5. 시각화 및 ø이 치료 구. DNA의 (AF) 요오드화 프로피 듐 염색. 스케일 바, 10 μm의. (A, C 및 E) 게놈 DNA와 시료 (GD); (B와 D) GD 플러스 플라스미드 (GD + P)와 샘플. ( <str<html> 29 시간의 엑소 뉴 클레아 제 처리 후&gt; AB) (EXO 29 시간) 옹; ø29 중합 효소 증폭 한 다음 72 시간의 엑소 뉴 클레아 제 처리 후 (CD) (EXO 72 시간 + ø29). (E) E 후 게놈 DNA 제어 : ø29 폴리머 증폭; (F) 플라스미드 제어 (5.5 KB) 후 29 중합 효소 증폭; (G의 ø) 아가로 오스 겔 eletrophoresis. L, 1킬로바이트 마커; 왼쪽부터 P, EXO 29 시간 후 플라스미드 제어 (5.5 킬로바이트) GD, EXO 29 시간 후 (A에서와 같이 샘플); GD + P, EXO 29 시간 후 (B로 샘플); GD와 GD + P, EXO 후 29 시간 + ø29; GD와 GD + P, EXO 후 72 시간 + ø29 (CD에서와 같이 샘플). 표 S1보기 추가 자세한 내용은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> ASET 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; CEN.PK.에서 데이터 집합 1. 잠재적 인 DNA의 회람 영역 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 시퀀스 데이터는 제시된 348 영역에 대해 분석한다. 열 AD, eccDNA 매핑입니다. 추정 eccDNA이 확인되었다되는, 샘플 A (왼쪽에서 첫 번째 열); B, 염색체; CD는 시작과 끝은 추정 eccDNAs의 좌표. EH, eccDNA 내용. E, 자율적 지역 (ARS) 시퀀스를 복제; F,이 지역의 전체 유전자; G, 지역에 포함 된 유전자의 일부; H 유전자를 BLASTN은-확인했다. IO, EccDNA 범위 및 p- 값. I, BP의 고유 주석 순서에 긴 영역; J, 모든 수 읽기 맵핑; K는, 모든 매핑의 범위는 매핑 만 읽고 (FPKM)에서 킬로바이트 당 조각으로 읽 몬테카를로 시뮬레이션에서 우연히 발생에 비해 추정 eccDNA에 대한 L, p 값이; 유엔의 M, 수iquely 읽어 맵핑; 아니; K와 L은 고유하게 매핑 사용으로하면 (UFPKM) 읽습니다. 의 매핑을위한 매개 변수 읽고 20 설명 된대로 몬테 카를로 시뮬레이션이었다.

이 논문은 염색체 외 원형 DNA(eccDNA)를 정제하기 위한 Circle-Seq라는 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법에는 컬럼 정제, 남아 있는 선형 염색체 DNA 제거, 롤링 서클 증폭 및 고처리량 염기서열분석이 포함됩니다. Circle-Seq는 진핵생물 eccDNA의 게놈 규모 스크리닝 및 게놈 불안정성 및 복제 수 변이 연구에 적용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

진핵 세포로부터의 게놈 전 범위 염색체 외 환형 DNA 정제. 안녕하세요, 저는 Rasmus입니다. 여기에서 환형 DNA 정제를 위한 방법의 전체 개요를 제시하겠습니다.첫 번째 부분에서는 효모 세포를 배양하고 수확합니다. 그런 다음 원형 DNA를 세 단계에 걸쳐 정제하고 증폭합니다. 먼저, DNA 원형을 정제하고 농축하는 컬럼 분리법을 수행합니다.그 후, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 처리로 남아 있는 모든 선형 DNA를 소화하고, 마지막으로 phi-29 폴리머라아제를 사용하여 DNA 원형을 증폭합니다. 본 프로토콜의 다섯 번째 부분에서는 DNA 원형의 서열을 분석하고 읽기 데이터를 Saccharomyces cerevisiae 참조 게놈에 매핑합니다. 영상 마지막에는 몇 가지 대표적인 결과물을 보여드리겠습니다.향후 연구 전망과 이 방법의 장점에 대해 논의하겠습니다. 첫 번째 단계는 세포 수확입니다. 스타터 배양액은 교반하며 30°C에서 최대 밀도까지 배양하며, 이는 약 200 million cells/mL이며 24~48시간 후에 도달합니다.배양된 배양물을 Falcon 튜브로 옮기고 3분간 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거합니다. 형성된 큰 펠렛을 TE 버퍼에서 볼텍싱한 후 원심분리로 다시 펠렛화합니다.두 번째 단계인 컬럼 정제입니다. 이 단계에서는 박테리아 게놈 DNA로부터 고순도의 플라스미드를 얻을 수 있는 상용 컬럼 정제 키트를 사용합니다. 효모에 이 키트를 사용하기 전에는 세포벽을 먼저 파쇄해야 합니다.이 과정은 세척된 세포 펠릿을 키트에 포함된 L-1 버퍼로 재부유시켜 수행합니다. 세포 현탁액을 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 전체 부피의 3분의 1에 해당하는 유리 비드를 추가합니다. 샘플을 최대 속도로 10분 동안 볼텍싱한 후, 2,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 제거합니다.상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 방법에서는 상층액에 고도로 희석된 플라스미드를 세 가지 서로 다른 비율로 첨가합니다. 사이클에 고도로 희석된 플라스미드를 포함할 것을 제안합니다.이는 내부 참조 가이드로 활용될 수 있습니다. 이를 통해 DNA 정제 및 증폭 과정을 품질 검사할 수 있으며, 또한 이러한 스파이크인 플라스미드를 사용하여 세포당 비원형 DNA의 양을 반정량적으로 추정할 수 있습니다. 다른 원형 DNA의 서열 해상도에 영향을 줄 수 있으므로, 매우 희석된 플라스미드만 첨가해야 합니다.스파이크된 플라스미드가 포함된 세포 현탁액을 키트의 L-2 용액으로 처리하고 키트 프로토콜을 따릅니다. 컬럼에 로딩한 후, 컬럼을 두 번 세척하여 단백질, 지질 및 염색체 DNA를 제거합니다. 용출 분획에서 외염색체 원형 DNA가 고도로 농축됩니다.세 번째 단계인 선형 DNA 소화입니다. 이 단계에서는 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 사용하여 남아 있는 선형 DNA를 소화합니다. ATP 의존성 엑소뉴클레아제는 원형 DNA는 소화하지 않고 선형 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA만을 특이적으로 표적합니다.선형 DNA에 대한 엑소뉴클레아제의 특이성은 DNase 처리 29시간 후 젤 전기영동을 통해 확인되었습니다. 결과는 유전체 DNA는 분해된 반면, 플라스미드 DNA는 빨간색 화살표로 표시된 바와 같이 그대로 남아 있음을 보여줍니다. 효모는 최대 1,500 kilobases 길이에 이르는 16개의 염색체를 가지고 있습니다.따라서 exonuclease 소화를 용이하게 하기 위해, 희귀 절단 endonuclease를 사용하여 접근 가능한 DNA 말단의 수를 늘립니다. NotI 기반 제한 효소를 사용하는 경우, 표시된 바와 같이 각 염색체는 최대 7번 절단됩니다. 컬럼 정제된 DNA를 가열 블록에서 37 °C로 overnight 처리하여 NotI로 반응시킵니다.NotI를 열 불활성화시킨 후, 절단된 DNA를 제조사의 프로토콜에 따라 37°C에서 엑소뉴클레아제로 처리합니다. 엑소뉴클레아제 처리 후, 효소를 70°C에서 30분 동안 열 불활성화시킵니다. ATP와 엑소뉴클레아제를 추가하여 모든 선형 염색체 DNA를 소화하는 데 수일이 걸릴 수 있습니다. 모든 선형 DNA가 완전히 소화되었는지 확인하기 위해 ACTI와 같은 내부 참조 유전자를 사용하여 PCR 또는 qPCR 방법으로 시료를 분석합니다.네 번째 단계, DNA 증폭입니다. 이 단계에서는 phi-29 중합효소를 사용하여 원형 DNA를 농축 및 증폭합니다. 반응은 random hexamer oligonucleotide와 phi-29를 사용하여 30 °C에서 진행됩니다.이 중합효소는 높은 정확도와 교정 활성을 가지고 있어, 편향되지 않은 DNA 증폭을 보장합니다. 각 중합효소는 롤링 서클 복제(rolling circle replication)를 통해 최대 100 kilobases의 DNA를 합성할 수 있습니다. 또한, 이 중합효소는 매우 높은 프로세서성을 가지고 있어 DNA를 최대 10⁹배까지 증폭할 수 있습니다.다섯 번째 단계인 시퀀싱입니다. 고처리량 차세대 시퀀싱 플랫폼 프로토콜에 따라, DNA를 평균 300 base pair 크기로 초음파 처리한 후 141 nucleotide single end reads로 시퀀싱합니다. 시퀀싱 리드는 Galaxy 무료 데이터베이스를 사용하여 Saccharomyces cerevisiae 참조 게놈에 매핑합니다.시퀀싱 데이터는 Galaxy에 업로드되며, 부분 리드의 매핑이 가능한 숏 리드 얼라이너인 Bowtie2를 사용하여 리드를 매핑합니다. 6부, 대표 결과입니다. 시퀀싱 및 Saccharomyces cerevisiae 참조 유전체 매핑 후, Galaxy 소프트웨어 내의 유전체 브라우저에서 리드를 시각화할 수 있습니다.원형 기원의 DNA는 예를 들어, 화면에 표시된 바와 같이 1 kb 이상의 일관된 리드(coherent reads)를 포함하는 영역으로 계산될 수 있습니다. 1 kb 이상의 범위를 갖는 일관된 리드가 포함된 4번 염색체 상의 영역 예로는 헥소스 운반체(hexose transporter) 유전자 6번과 7번이 있는 영역이 있습니다. 효모 세포 집단에 이 방법을 사용할 때, 매핑된 리드들이 이 유전자좌에서 빈번하게 발견되며, 리드 커버리지는 파라로그(paralog) 헥소스 운반체 유전자 사이에 DNA 원형이 형성되었음을 명확하게 시사합니다.헥소스 운반체(hexose transporter) 유전자 간의 높은 서열 상동성으로 인해, 우리는 부적절한 상동 재조합이 이 DNA의 원형화(circularization)를 유발한다고 제안합니다. 원형 DNA 돌연변이 모델은 DNA 복구 과정이 불완전하게 진행될 때 발생합니다. 예를 들어, 반복 서열 요소에서 이중 가닥 절단이 발생하면 동일한 염색분체 상의 상동 서열이 상동 재조합을 통한 DNA 복구의 템플릿으로 사용될 수 있습니다.절제, 가닥 침투, DNA 합성 및 모든 접합물의 해소가 이루어진 후, 게놈으로부터 DNA 원형 고리가 형성되어 염색체 상의 DNA 결실이 발생할 수 있습니다. 엑소뉴클레아제(exonuclease)와 phi-29 폴리머라제(polymerase)로 DNA를 처리한 효과는 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색을 통해 시각화할 수 있습니다. 게놈 DNA의 염색 대조군은 왼쪽 이미지와 같이 나타나며, 플라스미드 DNA는 오른쪽 이미지와 같이 나타납니다.400 nanograms의 게놈 DNA를 29시간 동안 exonuclease로 처리한 후, 왼쪽 이미지에 나타난 바와 같이 DNA의 대부분이 분해되었습니다. 이 결과는 오른쪽 겔 이미지의 겔 전기영동을 통해 확인되었습니다. 72시간의 exonuclease 처리 후 phi-29 polymerase를 이용해 DNA 합성을 진행하면, 여전히 수백만 개의 DNA 복제본을 식별할 수 있습니다.마찬가지로, 400 nanograms의 genomic DNA와 추가로 100 nanograms의 plasmid DNA를 29시간 동안 exonuclease로 처리한 후, genomic DNA의 대부분이 분해되었습니다. 하지만 겔 이미지에서 확인되듯이 plasmid DNA는 분해되지 않았습니다. 72시간 동안 exonuclease 처리를 한 샘플을 phi-29 polymerase로 처리한 후, 증폭된 DNA의 대부분이 염색된 plasmid 형태로 나타났습니다.우리는 먼저 원형 DNA에 대해 유전자를 스크리닝했으며, 수백 가지의 서로 다른 유형의 DNA 샘플이 발견되어 매우 놀랐습니다. 네, 효모 집단에서 DNA 원형이 얼마나 흔한지 발견하고 정말 놀랐으며, 우리는 이 방법이 많은 유형의 연구에 활용될 수 있다고 믿습니다. 분명히, 그중 하나는 인체 조직을 살펴보는 것이 될 것입니다.우리는 유전자가 비원형 요소와 효모, 그리고 심지어 종양 세포에서도 증폭될 수 있다는 것을 알고 있습니다. 일반적으로 체세포를 살펴보고 그곳에서 어떤 유형의 원형 DNA를 발견할 수 있는지, 그리고 우리가 이러한 원형화 현상에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 조사하는 것이 흥미로울 것이라고 생각합니다. 노화 세포의 경우 나이가 들면서 원형 DNA가 축적되며, 원형 DNA에서 더 많은 유전자가 발견될 것으로 예상합니다.또한, DNA 원형화의 분자적 기전을 살펴보고자 하며, 이를 위해 상동 재조합 및 비상동 재조합에 결함이 있는 돌연변이 효모를 관찰하는 것이 적절한 방법입니다. 이러한 돌연변이체들을 연구함으로써 DNA 원형화 프로필이 돌연변이의 유형에 따라 다를 것으로 예상하며, 효모 연구를 통해 DNA 원형화에 대해 훨씬 더 많은 것을 배울 수 있기를 기대합니다. 따라서 다른 방법들과 비교했을 때, 이 방법은 훨씬 더 민감하며, 실제로 약 10,000개의 세포 중 하나에서 DNA 원형을 찾아낼 수 있을 것입니다.광범위하게 수행된 임상 시험 연구를 통해 제가 알고 있는 바로는, 돌연변이 대립유전자가 검출되려면 일반적으로 전체 집단의 1%에서 10% 정도의 비율에 도달해야 합니다. 맞습니다. 그리고 이 기술을 사용하면, DNA 원들이 형성되었다는 사전 지식이 없어도 됩니다. 다른 기술들과는 달리 DNA 원들이 어느 정도 결합되어 있어야 하며, 그 후에야 시퀀싱이나 염색체 염색을 통한 증폭으로 쉽게 검출할 수 있다는 점과 대조적입니다.네, 그래서 결국 가장 큰 장점은 민감도이며, 이 방법을 통해 많은 흥미로운 연구들을 수행할 수 있기를 기대합니다.

genome-wide-purification-extrachromosomal-circular-dna-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Qiagen Miniprep 키트를 사용하여 세균의 플라스미드 식민지에서 DNA를 정화

우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

여기에 설명된 방법은 장기 판독 게놈 염기서열 분석에 사용하기 위해 절대 생물영양 진균 병원균인 흰가루병에서 게놈 DNA를 추출, 정제 및 품질 관리하는 방법입니다.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

이 프로토콜은 신진 효모인 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 네이티브 염색질 맥락에서 관심 있는 단일 복제 유전자 자리를 정제하기 위해 부위 특이적 재조합을 기반으로 하는 유전자좌 특이적 염색질 분리 방법을 제시합니다.

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

우리는 유전체 내에서 유전체 내 유전자 복제 수와 위치를 시각적으로 감지하는 DNA-FISH 중기 확산 프로토콜을 보고합니다. 이 접근법은 특히 염색체 외 DNA와 균질하게 염색된 영역을 포함하는 암세포주에서 증폭 상태의 단일 세포 해소를 가능하게 합니다.

DNA-FISH 중기는 인간 암 세포주에서 균질하게 염색된 영역과 염색체 외 DNA를 구분하기 위해 확장됩니다

배우세요 진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA를 게놈 차원으로 정화하고 증폭하는 Circle-Seq 방법을. Saccharomyces cerevisiae를 사용하여 고감도로 eccDNA를 검출하고 유전체 안정성 연구에 활용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

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