진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

진핵 세포로부터의 게놈 전 범위 염색체 외 환형 DNA 정제. 안녕하세요, 저는 Rasmus입니다. 여기에서 환형 DNA 정제를 위한 방법의 전체 개요를 제시하겠습니다.

첫 번째 부분에서는 효모 세포를 배양하고 수확합니다. 그런 다음 원형 DNA를 세 단계에 걸쳐 정제하고 증폭합니다. 먼저, DNA 원형을 정제하고 농축하는 컬럼 분리법을 수행합니다.

그 후, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 처리로 남아 있는 모든 선형 DNA를 소화하고, 마지막으로 phi-29 폴리머라아제를 사용하여 DNA 원형을 증폭합니다. 본 프로토콜의 다섯 번째 부분에서는 DNA 원형의 서열을 분석하고 읽기 데이터를 Saccharomyces cerevisiae 참조 게놈에 매핑합니다. 영상 마지막에는 몇 가지 대표적인 결과물을 보여드리겠습니다.

향후 연구 전망과 이 방법의 장점에 대해 논의하겠습니다. 첫 번째 단계는 세포 수확입니다. 스타터 배양액은 교반하며 30°C에서 최대 밀도까지 배양하며, 이는 약 200 million cells/mL이며 24~48시간 후에 도달합니다.

배양된 배양물을 Falcon 튜브로 옮기고 3분간 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거합니다. 형성된 큰 펠렛을 TE 버퍼에서 볼텍싱한 후 원심분리로 다시 펠렛화합니다.

두 번째 단계인 컬럼 정제입니다. 이 단계에서는 박테리아 게놈 DNA로부터 고순도의 플라스미드를 얻을 수 있는 상용 컬럼 정제 키트를 사용합니다. 효모에 이 키트를 사용하기 전에는 세포벽을 먼저 파쇄해야 합니다.

이 과정은 세척된 세포 펠릿을 키트에 포함된 L-1 버퍼로 재부유시켜 수행합니다. 세포 현탁액을 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 전체 부피의 3분의 1에 해당하는 유리 비드를 추가합니다. 샘플을 최대 속도로 10분 동안 볼텍싱한 후, 2,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 제거합니다.

상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 방법에서는 상층액에 고도로 희석된 플라스미드를 세 가지 서로 다른 비율로 첨가합니다. 사이클에 고도로 희석된 플라스미드를 포함할 것을 제안합니다.

이는 내부 참조 가이드로 활용될 수 있습니다. 이를 통해 DNA 정제 및 증폭 과정을 품질 검사할 수 있으며, 또한 이러한 스파이크인 플라스미드를 사용하여 세포당 비원형 DNA의 양을 반정량적으로 추정할 수 있습니다. 다른 원형 DNA의 서열 해상도에 영향을 줄 수 있으므로, 매우 희석된 플라스미드만 첨가해야 합니다.

스파이크된 플라스미드가 포함된 세포 현탁액을 키트의 L-2 용액으로 처리하고 키트 프로토콜을 따릅니다. 컬럼에 로딩한 후, 컬럼을 두 번 세척하여 단백질, 지질 및 염색체 DNA를 제거합니다. 용출 분획에서 외염색체 원형 DNA가 고도로 농축됩니다.

세 번째 단계인 선형 DNA 소화입니다. 이 단계에서는 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 사용하여 남아 있는 선형 DNA를 소화합니다. ATP 의존성 엑소뉴클레아제는 원형 DNA는 소화하지 않고 선형 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA만을 특이적으로 표적합니다.

선형 DNA에 대한 엑소뉴클레아제의 특이성은 DNase 처리 29시간 후 젤 전기영동을 통해 확인되었습니다. 결과는 유전체 DNA는 분해된 반면, 플라스미드 DNA는 빨간색 화살표로 표시된 바와 같이 그대로 남아 있음을 보여줍니다. 효모는 최대 1,500 kilobases 길이에 이르는 16개의 염색체를 가지고 있습니다.

따라서 exonuclease 소화를 용이하게 하기 위해, 희귀 절단 endonuclease를 사용하여 접근 가능한 DNA 말단의 수를 늘립니다. NotI 기반 제한 효소를 사용하는 경우, 표시된 바와 같이 각 염색체는 최대 7번 절단됩니다. 컬럼 정제된 DNA를 가열 블록에서 37 °C로 overnight 처리하여 NotI로 반응시킵니다.

NotI를 열 불활성화시킨 후, 절단된 DNA를 제조사의 프로토콜에 따라 37°C에서 엑소뉴클레아제로 처리합니다. 엑소뉴클레아제 처리 후, 효소를 70°C에서 30분 동안 열 불활성화시킵니다. ATP와 엑소뉴클레아제를 추가하여 모든 선형 염색체 DNA를 소화하는 데 수일이 걸릴 수 있습니다. 모든 선형 DNA가 완전히 소화되었는지 확인하기 위해 ACTI와 같은 내부 참조 유전자를 사용하여 PCR 또는 qPCR 방법으로 시료를 분석합니다.

네 번째 단계, DNA 증폭입니다. 이 단계에서는 phi-29 중합효소를 사용하여 원형 DNA를 농축 및 증폭합니다. 반응은 random hexamer oligonucleotide와 phi-29를 사용하여 30 °C에서 진행됩니다.

이 중합효소는 높은 정확도와 교정 활성을 가지고 있어, 편향되지 않은 DNA 증폭을 보장합니다. 각 중합효소는 롤링 서클 복제(rolling circle replication)를 통해 최대 100 kilobases의 DNA를 합성할 수 있습니다. 또한, 이 중합효소는 매우 높은 프로세서성을 가지고 있어 DNA를 최대 10⁹배까지 증폭할 수 있습니다.

다섯 번째 단계인 시퀀싱입니다. 고처리량 차세대 시퀀싱 플랫폼 프로토콜에 따라, DNA를 평균 300 base pair 크기로 초음파 처리한 후 141 nucleotide single end reads로 시퀀싱합니다. 시퀀싱 리드는 Galaxy 무료 데이터베이스를 사용하여 Saccharomyces cerevisiae 참조 게놈에 매핑합니다.

시퀀싱 데이터는 Galaxy에 업로드되며, 부분 리드의 매핑이 가능한 숏 리드 얼라이너인 Bowtie2를 사용하여 리드를 매핑합니다. 6부, 대표 결과입니다. 시퀀싱 및 Saccharomyces cerevisiae 참조 유전체 매핑 후, Galaxy 소프트웨어 내의 유전체 브라우저에서 리드를 시각화할 수 있습니다.

원형 기원의 DNA는 예를 들어, 화면에 표시된 바와 같이 1 kb 이상의 일관된 리드(coherent reads)를 포함하는 영역으로 계산될 수 있습니다. 1 kb 이상의 범위를 갖는 일관된 리드가 포함된 4번 염색체 상의 영역 예로는 헥소스 운반체(hexose transporter) 유전자 6번과 7번이 있는 영역이 있습니다. 효모 세포 집단에 이 방법을 사용할 때, 매핑된 리드들이 이 유전자좌에서 빈번하게 발견되며, 리드 커버리지는 파라로그(paralog) 헥소스 운반체 유전자 사이에 DNA 원형이 형성되었음을 명확하게 시사합니다.

헥소스 운반체(hexose transporter) 유전자 간의 높은 서열 상동성으로 인해, 우리는 부적절한 상동 재조합이 이 DNA의 원형화(circularization)를 유발한다고 제안합니다. 원형 DNA 돌연변이 모델은 DNA 복구 과정이 불완전하게 진행될 때 발생합니다. 예를 들어, 반복 서열 요소에서 이중 가닥 절단이 발생하면 동일한 염색분체 상의 상동 서열이 상동 재조합을 통한 DNA 복구의 템플릿으로 사용될 수 있습니다.

절제, 가닥 침투, DNA 합성 및 모든 접합물의 해소가 이루어진 후, 게놈으로부터 DNA 원형 고리가 형성되어 염색체 상의 DNA 결실이 발생할 수 있습니다. 엑소뉴클레아제(exonuclease)와 phi-29 폴리머라제(polymerase)로 DNA를 처리한 효과는 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색을 통해 시각화할 수 있습니다. 게놈 DNA의 염색 대조군은 왼쪽 이미지와 같이 나타나며, 플라스미드 DNA는 오른쪽 이미지와 같이 나타납니다.

400 nanograms의 게놈 DNA를 29시간 동안 exonuclease로 처리한 후, 왼쪽 이미지에 나타난 바와 같이 DNA의 대부분이 분해되었습니다. 이 결과는 오른쪽 겔 이미지의 겔 전기영동을 통해 확인되었습니다. 72시간의 exonuclease 처리 후 phi-29 polymerase를 이용해 DNA 합성을 진행하면, 여전히 수백만 개의 DNA 복제본을 식별할 수 있습니다.

마찬가지로, 400 nanograms의 genomic DNA와 추가로 100 nanograms의 plasmid DNA를 29시간 동안 exonuclease로 처리한 후, genomic DNA의 대부분이 분해되었습니다. 하지만 겔 이미지에서 확인되듯이 plasmid DNA는 분해되지 않았습니다. 72시간 동안 exonuclease 처리를 한 샘플을 phi-29 polymerase로 처리한 후, 증폭된 DNA의 대부분이 염색된 plasmid 형태로 나타났습니다.

우리는 먼저 원형 DNA에 대해 유전자를 스크리닝했으며, 수백 가지의 서로 다른 유형의 DNA 샘플이 발견되어 매우 놀랐습니다. 네, 효모 집단에서 DNA 원형이 얼마나 흔한지 발견하고 정말 놀랐으며, 우리는 이 방법이 많은 유형의 연구에 활용될 수 있다고 믿습니다. 분명히, 그중 하나는 인체 조직을 살펴보는 것이 될 것입니다.

우리는 유전자가 비원형 요소와 효모, 그리고 심지어 종양 세포에서도 증폭될 수 있다는 것을 알고 있습니다. 일반적으로 체세포를 살펴보고 그곳에서 어떤 유형의 원형 DNA를 발견할 수 있는지, 그리고 우리가 이러한 원형화 현상에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 조사하는 것이 흥미로울 것이라고 생각합니다. 노화 세포의 경우 나이가 들면서 원형 DNA가 축적되며, 원형 DNA에서 더 많은 유전자가 발견될 것으로 예상합니다.

또한, DNA 원형화의 분자적 기전을 살펴보고자 하며, 이를 위해 상동 재조합 및 비상동 재조합에 결함이 있는 돌연변이 효모를 관찰하는 것이 적절한 방법입니다. 이러한 돌연변이체들을 연구함으로써 DNA 원형화 프로필이 돌연변이의 유형에 따라 다를 것으로 예상하며, 효모 연구를 통해 DNA 원형화에 대해 훨씬 더 많은 것을 배울 수 있기를 기대합니다. 따라서 다른 방법들과 비교했을 때, 이 방법은 훨씬 더 민감하며, 실제로 약 10,000개의 세포 중 하나에서 DNA 원형을 찾아낼 수 있을 것입니다.

광범위하게 수행된 임상 시험 연구를 통해 제가 알고 있는 바로는, 돌연변이 대립유전자가 검출되려면 일반적으로 전체 집단의 1%에서 10% 정도의 비율에 도달해야 합니다. 맞습니다. 그리고 이 기술을 사용하면, DNA 원들이 형성되었다는 사전 지식이 없어도 됩니다. 다른 기술들과는 달리 DNA 원들이 어느 정도 결합되어 있어야 하며, 그 후에야 시퀀싱이나 염색체 염색을 통한 증폭으로 쉽게 검출할 수 있다는 점과 대조적입니다.

네, 그래서 결국 가장 큰 장점은 민감도이며, 이 방법을 통해 많은 흥미로운 연구들을 수행할 수 있기를 기대합니다.