폐수 처리 프로세스의 효능의 평가를위한 화학 및 생체 독성 방법의 배터리를 사용하면 에스트로겐 효능을 제거하는 방법

분석 화학과 in vitro 및 in vivo 방법을 포함하여 여기서 설명하는 일련의 테스트의 전반적인 목표는 에스트로겐성 오염 물질을 제거하기 위한 신흥 및 새로운 폐수 처리 기술의 효능을 결정하는 것입니다. 이러한 방법들은 예를 들어 폐수의 에스트로겐 활성도를 측정하며 가장 효과적인 폐수 처리 공정을 선택할 때와 같이 환경 공학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 활성 화합물의 매우 낮은 농도에 민감하여 수생 생물을 보호하기 위한 최적의 기술을 입증할 수 있다는 점입니다.

시연을 맡은 연구진은 박사후 연구원 Chris Green 박사, 대학원생 Angela Pinzon, 연구원 Alice Baynes 박사, 그리고 선임 연구 기술원 Nicola Beresford입니다. SPE 과정에서는 시료 오염을 방지하기 위해 청결과 정돈에 각별한 주의가 필요합니다. 모든 튜브, 탭 및 프리트를 메탄올로 사전 세척하십시오.

시료를 분석하기 전에 전달 라인을 추출 매니폴드에 연결하고, 전체 시스템을 탈이온수로 헹굽니다. 시료를 분석하려면 먼저 일회용 밸브 라이너를 부착한 다음, styrene divinylbenzene SPE 카트리지를 부착하십시오. 다음으로, 각 리저버에 ethyl acetate 5 mL를 피펫으로 분주하여 카트리지를 컨디셔닝합니다.

이 단계에서 SPE가 밀폐되었는지 확인하십시오. 그런 다음, 진공 펌프를 켜서 유속을 10 millimeters per minute로 설정하십시오. 카트리지가 마르기 전에 methanol 5 milliliters를 로딩하고, 이어서 water 5 milliliters를 로딩하십시오.

SPE 카트리지가 마르지 않게 하는 것이 매우 중요합니다. 물이 대부분 빠져나간 후, 펌프 전원을 끄고 각 카트리지 저장조에 물을 보충하십시오. 그런 다음, 카트리지 저장조와 유리 샘플 병 사이에 1/8 inch PTFE 튜브를 연결하십시오.

이제 진공 유속을 10 mL/min 미만으로 전환하고, 샘플 전체가 카트리지를 통과하도록 합니다. 다음으로, 카트리지 내부 물질의 색이 변할 때까지 SPE 카트리지를 완전히 건조시킵니다. 이때 진공 또는 가스 흐름을 사용하십시오.

이제 깨끗하고 건조된 10 milliliter 유리 수집 바이알을 랙에 장착하여 추출 매니폴드 내부에 배치합니다. 각 라이너가 바이알 위에 위치해 있는지 확인하십시오. 샘플 저장조에 4 milliliter씩 두 번, 총 8 milliliter의 dichloromethane을 채우고 진공 펌프를 켠 다음, 액체가 SPE를 통과하여 수집 바이알로 들어가게 합니다.

그 다음, 농축기를 사용하여 모든 수집 바이알의 부피를 1 mL로 줄입니다. 각 시료를 오토샘플러 바이알로 옮긴 후, 질소 건조 장치를 사용하여 100 µL까지 추가로 농축합니다. 프로세스의 다음 단계는 GPC를 사용하여 고분자 간섭 물질을 제거하는 것입니다.

먼저, 용출된 시료 추출액 95 µL를 GPC가 장착된 HPLC에 주입합니다. 농축기와 질소 건조 장치를 사용하여 GPC 추출액을 200 µL까지 농축한 후, hexane으로 2 mL까지 채웁니다. 다음으로, 일회용 밸브 라이너, amino purple 카트리지 및 카트리지 리저버를 SPE 매니폴드에 부착하고, 10 mL 유리 수집 바이알을 통과시킵니다.

이제 각 카트리지에 2 mL의 hexane을 넣어 컨디셔닝한 후 용매를 버립니다. 다음으로, GPC 시료 추출물을 리저버에 넣고 흡입하여 통과시킵니다. 추출물 수집액은 따로 보관하고, 세척액을 수집하기 위해 랙의 바이알을 교체합니다.

다음으로, 30% (v/v) ethyl acetate 및 hexane 2 mL를 카트리지에 통과시킵니다. 그 후, ethyl acetate 및 hexane 2 mL를 추가로 넣고, 세척액 수집물을 폐기한 뒤 10 mL 수집 바이알을 랙에 다시 놓습니다. 이제, 50% (v/v) ethyl acetate 및 acetone 2 mL를 리저버에 넣고, 2 mL/min 미만의 낮은 유속으로 펌프를 가동합니다.

액체가 모두 통과한 후, 저장조에 50% ethyl acetate 2 mL를 추가로 넣습니다. 이제 농축기를 사용하여 추출물의 부피를 1 mL로 줄입니다. 그 다음, 샘플을 더 작은 유리 바이알로 옮기고, 질소 농축 장치를 사용하여 추출물을 거의 완전히 증발시킵니다. methanol 100 µL를 첨가하고 샘플을 잘 섞은 후, 0.3 mL 인서트가 포함된 오토샘플러 바이알로 옮깁니다.

그 다음, 추출물에 대해 LC-MS/MS 분석을 수행합니다. 분석 시작 전날, 신선한 성장 배지를 준비하고 사용된 HER 균주의 tenax dock를 접종합니다. 다음 날, 테스트 화학 물질 또는 유출수 추출물의 100 µL 연속 희석액과 에탄올 내의 E2 표준 곡선을 작성하여 분석을 준비합니다.

이제, 라벨이 부착된 멸균 96-웰 플레이트에 10 µL씩 분주합니다. 그런 다음, 에탄올을 증발시키기 위해 플레이트의 덮개를 열어둡니다. 다음으로, CPRG 용액 0.5 mL가 포함된 성장 배지 50 mL를 준비합니다.

24시간 동안 배양한 효모 배양액의 탁도를 620 nanometers에서 측정하여 세포 밀도를 추정합니다. 그 다음, 50 milliliters의 분석 배지에 효모 세포 4,000만 개를 첨가합니다. 접종된 분석 배지를 멸균된 트로프(trough)로 옮긴 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 배지 200 microliters를 분주합니다.

어세이 플레이트 뚜껑을 닫고 가장자리를 테이프로 밀봉한 후, 플레이트 쉐이커를 사용하여 2분 동안 플레이트를 세게 흔들어 줍니다. 그다음, 자연 환기가 되는 배양기에서 32 Celsius로 플레이트를 배양합니다. 3일간의 배양 후, 다시 한번 흔들어 준 다음 효모가 약 1시간 동안 가라앉도록 둡니다.

마지막으로, 540 및 620 nm에서 시료의 빛 흡광도를 측정합니다. 슬러지 공정을 활성화하는 일반적인 하수 처리장의 수질 시료를 음이온 전기분무 LCMS로 분석한 결과, ethinyl estradiol이 예측 무영향 수준(PNEC) 이상의 농도로 존재했습니다. 입상 활성탄(GAC)과 같은 고도 정수 처리를 통해 ethinyl estradiol 수준을 실질적으로 감소시킬 수 있었습니다.

정량을 위해 모든 폐수 추출물은 동위원소 표지 내부 표준 물질(빨간색 피크)을 사용하여 분석되었습니다. 효모 에스트로겐 스크리닝 분석은 표준 에스트라디올에 대해 명확하게 민감한 반응을 보였으나, 기본적으로 공시료(blank)인 에탄올에 대해서는 반응이 나타나지 않았습니다. 효모 스크리닝 세포는 활성 슬러지 공정 유출수에 대해 명확하게 반응한 반면, GAC 처리 유출수는 반응이 감소하였으나 여전히 공시료보다 생물학적 활성이 더 높았습니다.

이 새로운 폐수 처리 기술을 사용하면, 파란색으로 표시된 에탄올 에스트라디올 농도와 초록색으로 표시된 에스트로겐 활성 모두 과산화수소와 TAML의 복합 처리에 의해 유의하게 감소했습니다. 폐수 처리장은 에스트로겐성 물질로 인한 지표수 오염의 주요 원인입니다. 이러한 유출수를 개선하기 위한 새로운 수처리 공정 방식에는 에스트로겐 활성에 대한 심층적인 테스트가 필요합니다.

이 영상을 시청하고 나면, 수질 시료 내의 에스트로겐 활성을 측정하는 데 필요한 일련의 화학 및 생태독성 시험에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 시료와 추출물을 세심하게 취급하여 오염을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 플라스틱에는 에스트로겐 화합물이 포함되어 있으므로, 화학적 오염 여부를 확인하기 위한 음성 대조군과 추출 방법의 작동 여부 및 스파이크 처리된 에스트로겐의 회수율이 양호한지 확인하기 위한 양성 대조군을 반드시 포함해야 합니다.