Name: 대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 학습하세요 M-CSF로 인간 단핵구를 대식세포로 분화시키는 배양법을. 냉동보존과 대량 분화로 세포 가용성을 높이고 밀도 변이를 최소화하여 면역학 연구의 재현성을 향상시킵니다.

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미국 국립보건원(National Institutes of Health) 임상 센터 수혈 의학과(Department of Transfusion Medicine, Clinical Center, Clinical Center)에서 용출 단핵구를 제공했습니다. 이 연구는 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립심장폐혈액연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

백혈구 성분 채집은 보건 기관 검토위원회의 국립 연구소의 승인을 인간 대상의 연구 프로토콜에 따라 수행 하였다. 1. 분리 및 단핵구의 냉동 보존 <ol><li> 인간의 기증자의 백혈구 성분 채집하여 단핵 세포를 확보하고, 참고 문헌 7,8에 설명 된대로 단핵 세포의 연속 역류 원심 분리 세광에 의해 단핵구을 풍부. 제조자가 지정한 세광 버퍼 - (90 % 단핵구 약 80) 약 100 × 106 씻겨져 걸러진 세포를 얻습니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 300 XG에 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 원심 분리기 단핵구 실온에서 5 분간. </li><li> 최종 90 % FBS / 10 % 디메틸 술폭 시드 농도 50 × 106 세포 / ml를 달성하는 디메틸 술폭 시드 이어 FBS에서 세포를 재현 탁 조심스럽게 상층 액을 제거하고. </li><li> 세포 현탁액의 t의 각 ML을 추가개인 cryovial을 오. </li><li> 셀 냉동 컨테이너에 배치 크리오 바이알 (cryovial)로 전송하고 -80 ° C의 냉동고에 24 시간 동안의 장기 저장을 위해 액체 질소 cryovial 저장 탱크로 전환하기 전에. </li></ol> 대 식세포에 단핵구 2. 차별화 <ol><li> 빠르게 37 ℃의 수조에 전달하고, 세포 현탁액은 약 70 % 융해되었을 때 즉시 제거하여 세포를 해동 cryovial. </li><li> 즉시 실온에서 완전 해동시에 C가 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 2 mM L- 글루타민, 50 NG / ㎖ M-CSF, 25 ng의 / ㎖와 1640 가온 37 50 ㎖로 한 용액을 cryovial 내용을 전송 인터루킨 10 (IL-10) 및 10 % FBS (완전 배지). </li><li> 전송이 75cm이 플라스틱 세포 배양 플라스크 각각에 단구 현탁액 25 ㎖. </li><li> 48 시간 동안 5 % CO 95분의 2 %의 공기와 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 배양 물을 인큐베이션. </li><li> CU를 씻어RPMI 1640 배지를 부드럽게 느슨하게 붙어있는 세포를 빠지 않도록 배지를 제거하고 (37 ℃로 미리 가온) 10 mL로 3 회 ltures. </li><li> 세정 후, 단핵 세포가 분화 될 때까지 중간마다 이일을 변경, 신선한 완전 배지를 추가 합류가 충분히 증식. 이것은 문화의 약 1 주일이 필요합니다. </li></ol> 3. 수확 식세포는 실험을 시작합니다 <ol><li> 10 ㎖의 플라스크에 3 회 분화 된 대 식세포 린스 예열 37 ° C, 0.25 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 10 ㎖를 첨가하기 전에 2 + Mg를 칼슘 2 않고 37 ° C 둘 베코 인산염 완충 식염수를 예열. </li><li> 대 식세포의 약 90 %가 반올림과 분리해야하는 시간에 15 분 - 10 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크. 플라스크의 현미경 검사하여이를 확인합니다. </li><li> 10 % FBS를 포함 RMPI 1640 배지 10 ㎖의에 추가상단 트립신. </li><li> 5 분 동안 원심 분리기, 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 플라스크에서 300 XG를 대식 세포 현탁액을 전송하고, 상층 액을 버린다. </li><li> 부드럽게 완전 배지 1 ㎖에 재현 탁 식세포. </li><li> 10 ㎕의 트리 판 블루 용액으로 대식 세포 현탁액 10 μL를 혼합하고 혈구를 사용 대식 세포 수 및 생존율 (전형적으로&gt; 95 %)를 결정한다. </li><li> 셀 수에 기초하여 (일반적으로 약 15-18 × 105 식세포) 원하는 시딩 세포 밀도를 달성하기 위해 추가적인 완전 배지를 추가한다. 참고 : 12 웰 플레이트의 웰 당 1.5 ml의 배지에서 1 × 10 5 대 식세포를 거의 합류 문화를 생성합니다. </li><li> 접종 후, 세포 부착을 허용하기 위해 5 % CO 95분의 2 %의 공기와 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양 한 대 식세포. 그런 다음, 원하는 실험을 시작한다. </li></ol>

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</ol>

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정의 식세포 유형을 생성하는 대 식세포 생물학을 연구 할 때 조사자에 의해 얻어진 결과가 충돌의 일부를 명확하게 할 수있다. 다양한 배양 조건 및 분화 인자의 사용은 차 인간 대 식세포는 아주 다른 식세포 타입을 초래할 수 연구자에 의해 인식되지 않을 수있는 점을 생성한다. 예를 들어, 대 식세포는 때때로 어떤 혈청, 인간 혈청 형, FBS 만 M-CSF, 또는 M-CSF 또는 GM-CSF를 함유 FBS 보충 된 인간 혈청을 사용하지 않고, 인간 단핵 세포에서 생성된다. 이전에보고 우리가 관찰 한 바와 같이, 단핵구 3 가능한 남아 있지 않은 추가 분화 인자없이 FBS 혈청없이 또는 함께 일주일 동안 배양로. 전술 한 바와 같이, 단핵구는 단독으로 인간 혈청 배양 또는 FBS 플러스 GM-CSF로 분화 단핵구의 &quot;튀김 달걀&quot;형태 특성을 보여 식세포를 생성 M-CSF로 보충. 따라서, 인간 혈청 M-의 존재단핵 세포는 M-CSF로 분화되었다하더라도 더 긴 형태를 도시 CSF 형 식세포는 얻어...

배양된 대식세포에 대한 연구는 죽상경화성 플라크에서 발생하는 것과 같은 염증에서 이러한 세포의 기능을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 연구의 초점이 대식세포와 관련된 인간 질병에 맞춰져 있는 경우, 종 차이를 피하기 위해 인간이 아닌 대식세포보다는 1차 인간 대식세포를 연구하는 것이 유용합니다. 또한, 세포 형질전환의 영향은 대식세포 세포주보다는 1차 대식세포를 사용함으로써 피할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해, 인간의 혈액에서 분리된 단핵구와 구별된 대식세포는 1차 인간 대식세포를 얻는 수단으로 사용됩니다. 
조직 대식세포는 조직 내에 상주할 수도 있고, 조직으로 이동하여 대식세포로 분화하는 단핵구에서 유래할 수도 있습니다 1. 인간 단핵구 유래 대식세포의 두 가지 유형이 정의되었으며, 이는 형태뿐만 아니라 유전자 발현 및 세포 기능에서도 차이가 있습니다 2. 이 두 가지 유형은 M-CSF + 소태아혈청(FBS)이 존재할 때 대식세포로 분화된 단핵구와 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF) + FBS 2-6이 존재할 때 대식세포로 분화된 단핵구에서 얻을 수 있습니다. 우리의 경험(미발표 관찰)에 따르면, FBS가 아닌 인간 혈청을 사용하면 M-CSF 또는 GM-CSF가 분화 배지에 포함되는지 여부에 관계없이 GM-CSF 유형이 생성됩니다. M-CSF형 대식세포는 GM-CSF형 대식세포보다 길쭉한 경향이 있어 형태가 계란후라이와 비슷합니다. 연구자는 인간 M-CSF 및 GM-CSF 단핵구 유래 대식세포가 소위 M1 및 M2 마우스 골수 유래 대식세포와 동일하지 않다는 것을 인식해야 합니다 6.
인간 단핵구 유래 M-CSF 분화 대식세포를 사용한 연구에서, 우리는 실험을 시작하기 위한 단핵구의 가용성과 단핵구를 대식세포로 분화하는 동안 얻은 대식세포의 세포 밀도의 변화와 관련된 어려움을 경험했습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 당사는 단핵구를 사용이 필요할 때까지 동결하고, 단핵구를 대식세포로 대량으로 분화한 다음 배양 플라스크에서 제거하고 원하는 세포 밀도로 도말하여 실험에 이르기까지 보다 균일한 배양액을 얻는 다음과 같은 프로토콜을 개발했습니다.

<table><tbody><tr><td>Cellbind 12-well 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, T-75 플라스크, 조직 배양 처리</td><td>Greiner Bio-One North America</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배양 배지</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>37°C로 예열; C</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ 및 Mg2+&nbsp; 없이 DPBS를 375418</td><td>코닝 cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 개선 밝은 광 혈구계</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>CoolCell LX 세포 동결 </td><td>컨테이너 BioCision</td><td>BCS-405</td><td>다른 냉동 컨테이너도 이 단계에 적합해야 합니다</td></tr>. <tr><td>액체 질소 저장 시스템, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>모든 액체 질소 탱크가 적절해야 합니다.</td></tr></tbody></table>

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 실험을 시작하기 위해 신선 또는 냉동 단핵구를 M-CSF로 플라스크에서 1주일 동안 배양하여 대식세포로의 분화를 유도합니다. 그런 다음 대식세포를 수확하여 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다. 실험을 위한 대식세포 배양을 시작하기 위해 정의된 수의 단핵구가 아닌 정의된 수의 대식세포를 사용하면 원하는 세포 밀도를 보다 일관되게 달성할 수 있는 대식세포 배양을 얻을 수 있습니다. 동결 보존된 단핵구를 사용하면 공여자 가용성에 대한 의존도가 줄어들고 보다 균일한 대식세포 배양이 생성됩니다.

트리 판 블루 (9) 염색으로 결정 신선 또는 냉동 보존 단핵 세포의 생존 도표 1. 95 % 이상이고 그림 2는 낮은과 높은 배율에서 비교, 각각 식세포에 신선하고 냉동 보관 (즉, 냉동) 단핵구의 분화의 진행. 냉동 보관 단핵구 확산하지만 반올림 남아 있지 않습니다 단핵 세포를 분화의 모집단을 보여와 신선한 비교합니다. 상 - 루슨트의 공포는 두 조건에서 단핵구 유래 대 식세포에서 발생한다. 이전 10, 11 설명 된대로이 액포는 M-CSF 형 식세포의 macropinosomes 특성을 나타냅니다. 그들은 단핵 세포에서 분화 된의 플라스크에서 자신의 수확 후 Cryopreserving 대 식세포는 (성공 식세포 ...

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

이 절차의 전반적인 목적은 단핵구의 가용성을 높이고, MCSF 유도 하에 인간 혈액 단핵구를 대식세포로 분화시키는 과정에서 얻어지는 세포 밀도의 편차를 최소화하는 것입니다. 이 방법은 인간 대식세포 생물학에 관한 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 공여자의 가용성에 대한 의존도를 낮추면서 인간 단핵구 유래 대식세포 배양물을 용이하게 얻을 수 있다는 점입니다.또한, 원하는 대식세포 세포 밀도와 균질한 배양 상태를 일관되게 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 성분채집술을 통해 인간 기증자로부터 단핵구를 얻은 후, 단핵구의 연속 역류 원심 분리 용출법(continuous counterflow centrifugal elutriation)을 통해 단핵구를 농축합니다. 그 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.다음으로, 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 단핵구를 넣고 상온에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고, FBS와 Dimethyl Sulfoxide를 순차적으로 가하여 세포를 부드럽게 재현탁함으로써 최종 농도가 90% FBS, 10% Dimethyl Sulfoxide, 50 × 10⁶ cells/mL가 되도록 합니다. 이후 개별 cryofile에 세포 현탁액 1 mL를 넣습니다.크라이오파일을 세포 냉동 컨테이너에 넣고, -80 °C 냉동고로 옮겨 24시간 동안 보관합니다. 24시간 후, 컨테이너를 장기 보관을 위해 액체 질소 크라이오파일 탱크로 옮깁니다. 이 단계에서는 세포가 담긴 크라이오파일을 37 °C 항온수조에 잠시 두어 해동합니다.세포 현탁액이 약 70% 해동되면 즉시 항온수조에서 꺼내 실온으로 옮깁니다. 세포 현탁액이 완전히 해동되면, cryovial 내용물 1 mL를 37°C의 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL M-CSF, 25 ng/mL IL-10 및 10% FBS가 포함된 50 mL RPMI 1640 배지로 옮깁니다. 그런 다음, 단핵구 현탁액 25 mL를 두 개의 75 cm² 플라스틱 세포 배양 플라스크에 옮깁니다.배양물을 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간이 지나기 전까지는 배지를 교체하지 마십시오. 그렇지 않으면 세포가 제대로 부착되지 않아 씻겨 나갈 수 있습니다. 48시간 후, 미리 데워둔 10 mL의 RPMI 1640 배지로 배양물을 세 번 헹굽니다.느슨하게 부착된 세포가 떨어지지 않도록 배

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 일차 단핵구를 대식세포로 프라이밍하는 방법을 보여줍니다. 1차 인간 단핵구는 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 사용하여 M1-like 전염증성 표현형으로 분리 및 분화할 수 있으며, 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 M2-like 항염증성 표현형으로 분화할 수 있습니다.

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

이 비디오에서는 말초 혈액 유래 단핵구를 M1 또는 M2 대식세포로 분화 및 분극을 유도하는 절차를 보여줍니다. 과립구-대식세포 집락자극인자, 지질다당류, 인터페론-감마를 이용한 배양은 전염증성 M1 대식세포를 생성하고, 대식세포 집락자극인자와 인터루킨-4를 사용한 배양은 항염증성 M2 대식세포 생산을 유도합니다.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 배양된 골수 세포는 대식세포와 수지상 세포(DC)를 포함하는 이종 배양을 생성합니다. 이 방법은 MHCII 및 히알루로난(HA) 결합을 사용하여 GM-CSF 배양의 DC와 대식세포를 구별하는 방법을 강조합니다. 이 문화권의 대식세포는 폐포 대식세포와 많은 유사점을 가지고 있습니다.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

학습하세요 M-CSF로 인간 단핵구를 대식세포로 분화시키는 배양법을. 냉동보존과 대량 분화로 세포 가용성을 높이고 밀도 변이를 최소화하여 면역학 연구의 재현성을 향상시킵니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

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