대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

이 절차의 전반적인 목적은 단핵구의 가용성을 높이고, MCSF 유도 하에 인간 혈액 단핵구를 대식세포로 분화시키는 과정에서 얻어지는 세포 밀도의 편차를 최소화하는 것입니다. 이 방법은 인간 대식세포 생물학에 관한 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 공여자의 가용성에 대한 의존도를 낮추면서 인간 단핵구 유래 대식세포 배양물을 용이하게 얻을 수 있다는 점입니다.

또한, 원하는 대식세포 세포 밀도와 균질한 배양 상태를 일관되게 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 성분채집술을 통해 인간 기증자로부터 단핵구를 얻은 후, 단핵구의 연속 역류 원심 분리 용출법(continuous counterflow centrifugal elutriation)을 통해 단핵구를 농축합니다. 그 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

다음으로, 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 단핵구를 넣고 상온에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고, FBS와 Dimethyl Sulfoxide를 순차적으로 가하여 세포를 부드럽게 재현탁함으로써 최종 농도가 90% FBS, 10% Dimethyl Sulfoxide, 50 × 10⁶ cells/mL가 되도록 합니다. 이후 개별 cryofile에 세포 현탁액 1 mL를 넣습니다.

크라이오파일을 세포 냉동 컨테이너에 넣고, -80 °C 냉동고로 옮겨 24시간 동안 보관합니다. 24시간 후, 컨테이너를 장기 보관을 위해 액체 질소 크라이오파일 탱크로 옮깁니다. 이 단계에서는 세포가 담긴 크라이오파일을 37 °C 항온수조에 잠시 두어 해동합니다.

세포 현탁액이 약 70% 해동되면 즉시 항온수조에서 꺼내 실온으로 옮깁니다. 세포 현탁액이 완전히 해동되면, cryovial 내용물 1 mL를 37°C의 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL M-CSF, 25 ng/mL IL-10 및 10% FBS가 포함된 50 mL RPMI 1640 배지로 옮깁니다. 그런 다음, 단핵구 현탁액 25 mL를 두 개의 75 cm² 플라스틱 세포 배양 플라스크에 옮깁니다.

배양물을 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간이 지나기 전까지는 배지를 교체하지 마십시오. 그렇지 않으면 세포가 제대로 부착되지 않아 씻겨 나갈 수 있습니다. 48시간 후, 미리 데워둔 10 mL의 RPMI 1640 배지로 배양물을 세 번 헹굽니다.

느슨하게 부착된 세포가 떨어지지 않도록 배양액을 조심스럽게 제거합니다. 그 후, 완전 배지를 추가하고 세포를 1주일 동안 배양합니다. 단핵구가 효율적으로 분화 및 증식하여 단일층(confluent)을 형성할 때까지 2일마다 배지를 교체합니다.

이제 플라스크 내의 분화된 대식세포를 칼슘과 마그네슘이 없는 37 °C DPBS 10 mL로 세 번 헹굽니다. 이어서, 37 °C 0.25% Trypsin EDTA 용액 10 mL를 첨가합니다. 다음으로, 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 10분에서 15분 동안 넣어둡니다.

그 후, 대식세포의 약 90%가 둥글게 변하며 떨어져 나와야 합니다. 그런 다음, 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지 10 milliliters를 첨가하여 트립신화를 중단시킵니다. 필요한 경우, 셀 리프터를 사용하여 세포를 완전히 제거하십시오.

본 과정에서 때때로 많은 대식세포가 부착된 상태로 남아 있을 수 있습니다. 이러한 대식세포는 트립신 처리 후 셀 리프터(cell lifter)로 플라스크 표면을 긁어내어 제거할 수 있습니다. 그 후, 플라스크 내의 대식세포 세포 현탁액을 15 milliliter 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.

실온에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 그다음 대식세포를 1 mL의 완전 배지에 부드럽게 재현탁합니다. 세포 수를 바탕으로, 원하는 세포 파종 밀도를 맞추기 위해 완전 배지를 추가로 첨가합니다.

그 다음, 12-웰 플레이트의 웰당 1.5 mL의 배지를 사용하여 대식세포를 분주합니다. 웰당 1.5 mL의 배지에 1 × 10⁵ 개의 세포를 분주하면 보통 거의 합류(confluent)된 배양 상태가 됩니다. 분주 후, 대식세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 부착되도록 한 뒤 실험에 사용합니다.

이 그림은 MCSF로 유도된 대식세포 분화 과정 중 저배율에서 관찰한 동결 보존된 신선한 단핵구의 위상차 현미경 이미지입니다. 단핵구 이미지는 플라스크 배양 3일째와 7일째, 그리고 수확 후 12-well 배양 플레이트에 재도말한 지 하루가 지난 8일째에 촬영되었습니다. 여기에는 대식세포 생산에 사용된 신선한 단핵구와 동결 보존된 단핵구를 고배율에서 비교한 모습이 나타나 있습니다.

위상차 현미경으로 관찰했을 때 느슨하게 보이는 액포들은 거대음세포(macropinosomes)입니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 단핵구를 냉동 보존하고, 이후 MCSF를 사용하여 대식세포로 분화시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 그 후, 실험을 위해 대식세포를 원하는 세포 밀도로 배양할 수 있습니다.