Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

이 절차의 전반적인 목표는 이식된 혈액 세포가 수혜자의 골수 틈새에 생착하는 것을 시각화하고 측정하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 이식 후 기증자 조혈 세포의 다른 골수 틈새에 대한 원점 복귀, 확장 및 국소화와 같은 세포 과정을 시각화할 수 있다는 것입니다. 조작된 동물 모델과 함께 사용되는 이 접근법은 조혈 세포 재생에 중요한 분자 경로를 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.

조직학 또는 기타 이미징 기술과 달리 생체 내 현미경을 사용하면 세포 수준에서 실시간으로 살아있는 동물의 세포 간 상호 작용을 캡처할 수 있습니다. 우리는 골수 미세환경이 Notch 신호 손실로 인한 골수증식성 질환 발병의 초기 부위인지 여부를 결정하기 위해 이 방법을 사용하기로 결정했습니다. 이 기술을 처음 접하는 개인이 직면할 수 있는 과제에는 호흡 아티팩트 최소화, 머리의 최적 위치 및 안정화, 이미지 채도 방지 등이 포함됩니다.

이식 1-2시간 전에 용해된 EGFP 마우스에 70% 에탄올을 분사합니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 발목 주위의 각 다리 피부를 절개하고 수술용 집게를 사용하여 피부와 털을 함께 제거하여 깨끗한 근육 조직을 노출시킵니다. 다리에서 가능한 한 많은 근육을 제거하십시오.

그런 다음 무릎과 발목 관절의 뼈를 자르고 거즈 스펀지를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아 있는 근육 조직을 제거합니다. 세척된 뼈를 10% FBS가 보충된 DMEM이 함유된 6웰 플레이트로 헹굽니다. 그런 다음 4개의 뒷다리 뼈를 모두 PBS에 담긴 10ml의 차가운 EDTA로 절구에 옮기고 절구로 뼈를 으깨줍니다.

골수 세포를 삼중화하여 단일 세포 현탁액을 얻고 70미크론 필터를 통해 슬러리를 15ml 원심분리 튜브로 변형시킵니다. 2-3밀리리터의 PBS로 필터를 헹굽니다. 그런 다음 세포를 원심분리하고 10ml의 새로운 DMEM과 10%FBS에 펠릿을 재현탁합니다.

주사를 위해 세포 현탁액을 원심분리한 다음 세포의 농도를 혈청이 없는 IMDM에서 밀리리터당 7번째 세포까지 1.5배의 10으로 계산하고 조정합니다. 얼음 위에 세포를 놓습니다. 두 번째 방사선 투여 후 5-6시간 후에 여섯 번째 골수 세포에 10회씩 3회 주입하여 방사선을 투여받은 각 동물의 꼬리 정맥에 주입합니다.

이식 후 적절한 시점을 추가합니다. 마취된 수혜자 마우스를 섭씨 37도의 가열 패드에 놓고 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다. 동물의 눈에 연고를 바르고 꼬리 정맥을 통해 적절한 형광 마커 100마이크로리터를 투여합니다.

다음으로, 작은 전기 가위를 사용하여 동물 머리의 등 표면에서 털을 제거한 다음 제모 크림을 바릅니다. 5분 후, 거즈 스펀지로 크림을 제거하고 남은 용액을 식염수로 헹굽니다. 70% 에탄올을 적신 면봉으로 두피를 소독합니다.

그런 다음 가는 집게와 가위를 사용하여 두피를 10-20mm 정도 절개하여 밑에 있는 등쪽 두개골 표면을 노출시킵니다. 5-0 수술용 실크를 사용하여 절개 부위의 양쪽에 두 개의 스테이 봉합사를 배치하여 플랩을 만들어 이미징을 위해 칼바륨을 노출시킵니다. 노출된 두개골에 기름 한 방울을 바릅니다.

마우스를 누운 자세로 노출된 두피를 현미경 오일로 채워진 유리 바닥 접시에 담그십시오. 그런 다음 대물렌즈 위에 칼바륨이 있는 다광자 이미징 스테이지에 동물을 놓고 섭씨 37도의 가열 패드로 동물을 덮습니다. 다광자 이미지를 획득하는 동안 헤드가 올바른 위치에서 안정된 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

정위 장치를 사용하거나 적절하게 테이프로 마우스를 고정합니다. 다광자 이미징을 위해 변형된 도립 컨포칼 시스템을 사용하여 두 광자 레이저를 830나노미터로 조정합니다. 그런 다음 적절한 이미지 획득 소프트웨어를 엽니다.

획득 설정 메뉴에서 단방향 스캐닝 모드가 선택되어 있는지 확인하고 스캔 속도를 픽셀당 4마이크로초, 프레임 속도를 512 x 512 픽셀, 줌을 1.5로 설정합니다. 0.95 목표에서 20X 와트를 선택합니다. 염료 목록 창을 열고 두 개의 광자를 선택합니다.

그런 다음 현미경 컨트롤러 창에서 RDM690 미러를 선택합니다. 빛의 경로 및 주사위 창에서 레이저 장치 2 상자를 선택하여 두 광자 레이저 셔터가 열려 있는지 확인합니다. EPI 램프를 선택하고 B/G EPI 필터 큐브를 선택합니다.

그런 다음 표본에 대물렌즈를 집중시켜 중심 정맥과 관상 동맥 봉합사의 분기점을 기준점으로 사용하여 칼바륨 골수 틈새의 혈관 흐름을 시각화합니다. 디스캔되지 않은 모드를 사용하여 3개의 외부 검출기를 선택하고 평균화 없이 픽셀당 4마이크로초의 스캔 속도로 표본을 이미지화하고 일정한 레이저 출력 및 검출기 게인으로 표본을 이미지화하여 최소한의 포화로 검출기의 전체 동적 범위를 활용할 수 있습니다. 조직의 깊이를 통해 일련의 절편을 수집한 후 적절한 전용 3-4D 이미지 정량 분석 및 시각화 소프트웨어를 엽니다.

제조업체의 지침에 따라 적절한 3D 렌더링 알고리즘을 사용하여 Z 스택을 대화식으로 시각화합니다. 그런 다음 스폿 객체 분할 모듈을 사용하여 GFP 셀을 분할하고 스택 산술 처리를 적용하여 녹색 및 빨간색 채널에서 거짓 긍정 GFP 셀을 제거합니다. 마지막으로, surface segmentation 모듈을 사용하여 혈관 구조와 뼈 표면의 분할을 재구성하고, 필요에 따라 원위 표면까지의 세포의 거리를 계산하기 위해 Spot to Surface 알고리즘의 X 장력 거리를 적용합니다.

여기서, 골수 칼바륨의 6개 표준 영역 각각에서 수집된 Z 스택은 3D 최대 강도 투영, 뼈 구성 요소를 포함한 3D 그림자 투영 및 3D 분할 이미지로 렌더링되어 세포의 정량화와 뼈 및 혈관으로부터의 거리를 측정할 수 있습니다. 이 실험에서 Notch-defective 골수 미세환경에서 골수성 세포의 in vivo 이미징은 donor lysed GFP 세포가 이식 후 24시간에 야생형 및 녹아웃 수혜자에서 유사한 귀환 효율을 갖는 반면 나중에 다른 생착을 나타내는 것으로 나타났습니다. 골수성 전구 세포 확장의 역학을 분석한 결과, 적응적으로 골수를 이식한 세포는 이식 후 2주가 지나면 녹아웃 수혜자에서 더 빠르게 그리고 더 많이 확장되는 것으로 나타났습니다.

야생형 수혜자의 기증자 골수 세포는 나중에 확장되었지만 4주에 기증자 세포 및 녹아웃 수혜자보다 2배 더 많은 수를 보였는데, 이 시기에는 녹아웃 골수 내 기증자 세포가 빠르게 순환하기 때문에 감소합니다. 그리고 6주가 지나면 골수 칼바륨의 기증자 세포 수의 차이가 평준화됩니다. 또한, 골수 이식 후 6주에 녹아웃 및 야생형 칼바리아의 하단 중간 영역에 대한 3D 분할 분석은 용해된 GFP 세포가 두 유형의 수용 동물에서 뼈에서 동일한 거리에 국한되어 있음을 나타내지만, 흥미롭게도 녹아웃 마우스의 혈관 구조에서 더 멀리 떨어져 있습니다.

일단 숙달되면 생체 내 골수 이미징은 적절하게 수행될 경우 마우스 한 마리당 1시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하는 동안에는 생쥐당 칼바륨 골수의 여러 부위를 샘플링하고 실험당 최소 3개의 마우스를 분석하여 인트라 및 인터 샘플 변동을 해결하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 골수 미세환경에 대한 특정 혈액 하위 집단의 생착 역학을 결정하기 위해 골수 이식과 생체 내 이미징을 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.