Name: Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 학습하세요 IVFM을 이용한 조혈모세포 골수이식 역학 연구 방법을. 유전자 동물모델과 실시간 영상으로 세포 정착 과정을 관찰하고 골수 미세환경에서의 재생 메커니즘을 규명합니다.

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이미지는 닥터 켄 던 감독 하는 인디애나 대학에서 생물학 현미경에 대 한 인디애나 센터에서 실시 되었다. Stereotaxic 장치 설계 및 마크 Soonpaa, 웰 스 소아 연구 센터에 의해 만들어진 프로토 타입 이다. 이 작품은 NIH/R01DK097837-09 (NC)에 의해 지원 되었다, NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN 연구 재단 (NC)와 CTSI 공동 프로젝트 IUSM/노 틀 담 (NC).

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 대학의과의 인증 수행 했다. 확인 작업을 수행 하는 국가의 동물 실험에 법안을 준수 합니다.
1. Mx1CreRBPJ-/- 받는 사람 마우스의 준비
<ol><li>Mx1-Cre+ RBPJlox/lox 쥐10 Mx1-Cre를 얻을 마우스를 크로스 RBPJlox/lox 쥐12 양수와 Mx1-Cre 부정적인 RBPJlox/lox littermates 컨트롤로 사용 하. PCR10유전자 형을 확인 합니다.</li>
	<li>6-8 주를 사용 하 여-오래 된 Mx1Cre+/RBPJlox/lox 및 Mx1Cre-/RBPJlox/lox 마우스 polyI:C 유도 수행 하려면.</li>
	<li>
PolyI:C 200 µ g i.p. Cre+ 및 Cre- 마우스에 주사. 한 polyI:C 주사 3 일 첫 주 동안 매일 제공 합니다. 한 polyI:C 주사 두 번째 주, 이전 주입 (총에서 4 개의 주사) 후 7 일 제공 합니다.
	<ol>
<li>RBPJKO를 사용 하 여 (Mx1Cre 유도+/RBPJlox/lox)와 RBPJWT (유도 Mx1Cre-/RBPJlox/lox) 받는 마지막 polyI:C 주입 후 3 주 사람으로 쥐. 참고: 그것은 주입 후 3 주 pI: pC에 의해 유도 된 마우스를 사용 하 여 권장. PolyI:C에 의해 발생 하는 IFNα 응답 BM, HSC의 immunophenotypic 확장 결과에 큰 변화를 유도 하 고 주변 혈액16,17에 성숙한 창시자의 출력을 감소. 조 혈 하위 집합의 표현은 정규화 된 3 주 후 주입 및 쥐 염증의 혼란 효과 없이 이용 될 수 있다. 이 유도 프로토콜은 RBPJ에 대 한 최적화 되었습니다. 유도 프로토콜 구문, 따라 달라질 수 있습니다 다른 유전자를 삭제 하 고 삭제를 확인 합니다. 우리는 총 4 개의 polyI:C 주사 후 RT-PCR에 의해 loxP 사이트 사이 RBPJ 영역의 ~ 100% 삭제 확인.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 리스 EGFP 기증자의 골 수 세포 이식에 대 한 준비
<ol><li>한 리스 EGFP 마우스 (이산화탄소 뒤에 자 궁 경부 전위)를 안락사 1 또는 2에 이식 하기 전에 h.</li>
	<li>70% 에탄올과 동물 몸 표면 스프레이.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 두 다리 발목 주위에 피부 절 개 하 고 수술 집게로 당겨 떨어져 피부와 함께 깨끗 한 근육 조직을 노출 하는 모피.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 가능한 많은 근육 다리에서 제거. 한가 위를 사용 하 여 (무릎과 발목 관절)에서 뼈를 잘라 하 고 화관에서 tibias 거 즈 스폰지를 사용 하 여 모든 나머지 근육 조직의 청소. (2 개의 화관과 두 tibias) 뼈 포함 된 DMEM 10 %6 잘 플레이트에 배치 FBS.</li>
	<li>10 mL 감기 2 mM EDTA PBS와 피펫으로 박격포에 뼈 골 셀을 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀을가지고 크 러시. 또는, 1 mL 주사기 각 측에서 2 mM EDTA PBS 3 시간 뼈를 플러시.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 관으로 70 µ m 필터를 사용 하 여 골 수 세포를 필터링 합니다. 2-3 mL PBS의 필터를 씻어. 460 x g에서 10 분 아래로 셀 회전, resuspend 10 ml 신선한 DMEM의 셀 10 %FBS.</li>
	<li>hemocytometer에 골 셀을 1.5 x 107 셀/mL IMDM에 없이 혈 청 농도 조정 합니다. 200 µ L의 양으로 동물 당 3 x 106 셀을 사용 합니다. 총 BM의 약 1/3 세포는 골수성 GFP + 셀. 주입에 대 한 준비까지 얼음에 셀을 둡니다. 105 셀 x 0.5를 사용 하 여 GFP 식을 FACS9에 의해 결정.</li>
</ol>3. RBPJKO 쥐로 리스 GFP 셀 골 수 이식
<ol><li>받는 사람 마우스 원형에 제 지. 감마 방사선의 치명적인 복용량을 가진 쥐를 비추는 (1200 Rad) Cs 137 irradiator에. 분할 복용 프로토콜을 사용 하 여: 저녁에 900 래 드 300 래 드 뒤 다음날 아침 (16 h 떨어져).</li>
	<li>치명적 방사능된 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 마우스 이식 방사선의 두 번째 투여 후 5-6 h. BM 주사 셀 리스 EGFP 쥐 꼬리 정 맥 주입 (수확 제 2에 있는 셀에 대 한 세부 정보 참조) 동물 을 통해 당 3 x 106 세포의 농도에서에서 수확.</li>
	<li>다른 시간 지점에서 IVFM에 의해 이식된 생쥐의 독립적인 동료 이미지: 24 h, 그리고 2, 4, 6, 설명 대로 아래 주 (4 & 5 vivo에서 이미징 절차에 대 한 섹션 참조).</li>
</ol>4. 수술 준비 Intravital 이미징
<ol><li>수술 기구를 소독. 두 집게 (한 직선, 각도 하나), 좋은 좋은 위과 바늘의 한 쌍의 한 쌍. 모든 공급 절차에 필요한 요원 영역을 준비 합니다.</li>
	<li>마우스에 게 케 타 민 칵테일 마 취의 IP 주사 (Xylazine 2.5-5 m g/k g + acepromazine 1.0-2.5 m g/k g + 케 타 민 90-100 mg/kg) 26-28 G 바늘 주사기를 사용 하 여.  동물은 매 15 분 절차 동안 모니터링 될 것 이다 하 고 마 취 원래 복용량의 ¼에 필요에 따라 보완 될 것입니다.</li>
	<li>적절 한 열 소스 (37 ° C가 열 패드가 열 패드와 직접적인 접촉에서 보호 동물)에 마우스를 놓고 시각적으로 호흡 속도 모니터링 합니다.</li>
	<li>발가락을 사용 하 여 반사 꼬집어 응답을 확인 합니다. 동물 인지 확인 완전히 마 취 수술 절차를 시작 하기 전에.</li>
	<li>26-28를 사용 하 여 주고 쥐 형광 혈관 마커 (Dextran, 20 mg/mL 해결책의 100 μ)의 꼬리 정 맥 주입 바늘 주사기 게이지.</li>
	<li>두 눈에 수 의사 눈 연 고를 적용 합니다. 클립을 작은 전기 면도기와 동물의 머리의 등 쪽 표면. 제 모 크림을 제거 하 여 다음 식 염 수로 씻어 5 분 사용 거 즈 스폰지에 크림을 적용 합니다. 70% 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 두 피를 준비.</li>
	<li>기본 등 두개골 표면 노출로 두 피에 작은 중간 피부 절 개 (10-20 m m)을 잘 집게와가 위를 사용 합니다. 5-0 수술 실크를 사용 하 여 피부 절 개를 만드는 영상에 대 한 calvarium를 노출 하는 플랩의 각 측면에 두 개의 숙박 봉합 배치.</li>
	<li>그들의 뒤에 쥐를 놓고 현미경 기름을 가득 유리 하단 접시에 노출 된 두 피를 잠수함. Mutiphoton 룸 이미징에 동물을 전송 합니다.</li>
	<li>동물에 현미경 단계 목표 위에 유리 접시에 위치 하는 calvarium와 놓고는 37 다음 커버° C가 열 패드 (동물 열와 직접적인 접촉에서 보호 되어야 합니다).</li>
</ol>5. Vivo에서 마우스 Calvarium의 고해상도 영상
<ol><li>Multiphoton 이미징에 대 한 수정 하는 거꾸로 confocal 시스템을 사용 하 여 ( 자료 표참조). 다음 제조업체의 지침 조정 830에 2 광자 레이저 nm, 20 장소 X W, 나 0.95 렌즈 현미경 코 조각에 레이저 빔 정렬 확인. 참고: 똑바로 현미경 시스템은 가장 일반적으로 이러한 연구에 대 한 사용 하지만 거꾸로 multiphoton 시스템 또한 활용 될 수 있습니다. 본이 연구에서는 사용자 지정 설계 된 atraumatic stereotaxic 장치 사용 되었다. 똑바로 현미경 시스템에 대 한 몇 가지 상용 stereotaxic 장치 있지만 마우스 두개골 확보 겨냥 하는 거꾸로 한 현미경 시스템에 대 한 아무 상업적으로 이용 가능한 stereotaxic 장치가입니다. 사용자 지정 stereotaxic 장치에 대 안으로, 두개골 위의 안정성에 대 한 다양 한 테이프 또는 접착제 방법을 활용 하 고 목표 위치에 보안 수 있습니다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. "수집 설정"에서 패널 한 방향 스캐닝 모드 선택 됩니다 확인 합니다. 4 μ/픽셀, 512 x 512 픽셀 프레임 속도 스캔 속도를 설정 하 고 1.5로 확대. 20 X W 나 0.95 목표는 nosepiece에서 렌즈에 맞게 사용할 수 있는 렌즈의 목록에서 선택 합니다.</li>
	<li>"이미지 수집" 제어판에서 "염료" 목록에 액세스 하 고 "두 광자"를 선택 합니다. "빛 경로 & 염료" 창 열고 레이저 단위 2에서에서 확인란을 선택 하 여 DM690-980 여기 DM. 2 P 레이저 셔터 열기를 선택 합니다. "현미경 컨트롤러" 창에서 RDM690 미러를 선택 합니다.</li>
	<li>"피 램프"를 선택, B/G 피 필터 큐브를 선택 하 고 목표 혈관 흐름을 사용 하 여 참조로 중앙 정 맥 (a)와 (b) (그림 2A) 관상 봉합의 분기 calvarium 골 틈새를 시각화 하는 표본에 집중.</li>
	<li>
비 descanned 모드를 사용 하 여 이미지를 수집 합니다. 3 외부 감지기 선택: PMT detector1 콜라겐의 SHG 신호 수집 하 (방출 필터-430/100 nm), GaAsP detector2 수집 GFP 신호 (방출 필터-525/50) 및 GaAsP detector3 TRITC-dextran의 신호를 수집 하 (방출 필터-605/90 nm).
	<ol>
<li>스캔 속도 4μs/phototoxicity를 최소화 하기 위해 아무 평균 픽셀에서 이미지를 수행 합니다. 최소한의 채도와 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하도록 조정 일정 레이저 파워 및 검출기 이득에서 이미지를 수집 합니다.</li>
		<li>Calvarium 골 수의 6 지역에서 조직 (60 x 1 μ m Z-스택)의 깊이 통해 섹션의 시리즈를 수집 합니다. 1 μ m의 단계 크기 설정을 사용 하 여, 확대/축소 1.5 및 512 x 512 픽셀 프레임 크기 (423 µ m x 423 µ m). 참고: 전체 한 마우스를 이미지 하는 데 필요한 총 시간 1-1.5 h입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 정량 분석
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 전용된 3D/4d 이미지 정량 및 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 정량 및 3D 개조를 수행 ( 자료 표참조). Z-스택 최대 강렬 투 상 (MIP), 활용 하는 차원에서 알파 혼합 또는 그림자 투영 볼륨 렌더링 알고리즘을 대화식으로 시각화.</li>
	<li>사용 하 여 GFP 셀 세그먼트는 "자리 개체 세그먼트화 모듈". 스택 산술 처리 (채널 빼기) 거짓 긍정적인 수 GFP 셀 (녹색 및 빨강 채널에서 강한 형광을 표시 하는 뼈 세포의 신호 제거)를 제거 하기 위해 적용 됩니다.</li>
	<li>맥 관 구조와 뼈 표면 표면 세그먼트화 모듈을 사용 하 여의 세분화를 수행 합니다. 필요한 경우, "표면에 반점의 거리" 라고 하는 X-긴장 알고리즘을 적용 하 여 위의 표면에 세포의 거리를 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 Intravital 형광 현미경 검사 법에 의해 최적화 engraftment 조 혈 모 세포의 활동을 연구 하는 실험 설계를 설명 합니다. 이 연구에서는 골수성 조상 세포 WT BM 또는 노치 신호 결함이 있는 BM의 확장 했다 추적 뼈 calvarium에서 다음 리스 GFP 긍정적인 골수성 세포 BMT 후 받는 사람 RBPJWT 또는 RBPJKO로. 이 접근은 주소 비슷한 질문에 예를 들면 적용 될 수 있는 모델로 제안: 나) 확장과 다른 계보의 세포의 BM 틈새에서 지역화와 같은 결정을 림프, erythroid 또는 megakaryocytic 세포 기증자 세포로 사용 하 여 조 혈 모 세포 계보 특정 발기인 GFP 또는 토마토-레드; 운전을 들고 ii)를 받는 사람으로 다른 특정 코 또는 유전자 변형 쥐를 사용 하 여 다른 마이크로 환경 결정을 평가 합니다.
Calvarium 뼈에서 이미징이 프로토콜의 강도 BM 지역, 중앙 정 맥 그리고 관상 봉합의 분기점을 선...

Intravital multiphoton 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 강력한 이미징 기술을 고해상도, 실시간 이미징 조직 깊이의 최대 허용 하는 조직에 따라 1 mm. 마우스 calvarium에 적용 하면, 그것은 60-100 μ m11을 비-침략 적 방법으로 BM 내의 조 혈 모 세포의 행동을 관찰을 허용. 이 방법은 여기 engraftment 정식 노치 신호 부족 BM의 RBPJ 녹아웃 쥐에 있는 정상적인 골수성 창시자의의 활동을 결정 하기 위해 사용 됩니다.
우리 그룹에서 최근 작품 그 결함이 정식 노치 신호 myeloproliferative 같은 질병12BM microenvironment 리드에서 설명 했다. 노치 신호 손실 RBPJ, 하류 신호, 재결합10유도 Mx1-Cre를 사용 하 여 정식 노치의 중요 한 녹음 방송 요인의 DNA 묶는 도메인의 조건부 삭제에 의해 얻은. 이 연구에서는 Mx1-Cre/RBPJlox/lox 마우스 모델 사용 되었다. RBPJ의 DNA 묶는 주제의 조건부 삭제에서 모든 노치 수용 체 신호 손실 발생 합니다. Mx1-Cre 모델, Cre 식 polyI:C 여러 기관의 stromal 구성 요소에서 뿐만 아니라 혈액 세포에서 타겟된 유전자 삭제의 유도에 결과의 관리에 따라 활성화 Mx1 발기인에 의해 구동 됩니다 포함 한 BM, 비장 및 간.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox ,lox/lox 마우스 Mx1-Cre-/RBPJ polyI:C (hereon 표시 된 RBPJKO와 RBPJWT, 각각)와 유도 방사능 치명적 이었고 정상, 야생 타입 조 혈 모 세포 이식. 이식 후 4 주부터 시작 해 서, RBPJKO 받는 사람 상당한 leukocytosis로 선행 개발. RBPJKO 마우스 골수성 창시자의 증가 비율에에서 제시는 BM 주 8에서 이식 후 고 나중 시간 지점에서 비록 4-6 주에 BM의 분석 그들의 골수성 세포 콘텐츠 제어 RBPJWT에 비해 눈에 띄는 차이 공개 하지 않았다 받는 사람. BM microenvironment myeloproliferative 표현 형의 개시에 직접적인 영향을 미쳤다 Mx1-Cre 다른 조 혈 기관, 표현 된다 사실 함께이 관찰, 질문을 발생 합니다.
BM 질병 개발의 중요 한 초기 사이트 였는 지 여부를 확인 하려면 마우스 calvarium의 IVFM와 BM 이식 (BMT), RBPJ 노크 아웃 모델 계보 추적 시스템 조합에 사용 되었다. 유전자 변형 마우스 특정 lysozyme 발기인 (리스-GFP)9 의 통제 EGFP 표현 BM BMT 후 이미징 동안 구상 될 수 있는 기증자 세포를 얻기 위해 사용 되었다. Lysozyme 식이 골수성 세포 특정 고 리스-GFP 성숙한 granulocyte13일반적인 골수성 조상 (CMP)에서 셀을 표시 합니다.
다른 시간 지점에서 BM의 IVFM는 리스 GFP 셀 BM의 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람에 게 마찬가지로 홈 하지만 확장 및 BM의 RBPJKO 받는 사람에서 빨리 engrafted 시연 했다. 이 차이 이전 시간 시점 (주 2) 극적인 되었고 시간이 지남에 따라 감소 (주 4 및 6). 그러나, 이러한 나중 시간 지점에서 동일한 받는 사람에 조 혈 구획의 평가 골수성 세포는 샌드위치에 순환 수에 꾸준히 증가 보였다 고 셀의 증가 출력을 나타내는 RBPJKO 마우스의 비장에 순환에 BM. 리스-GFP 셀 지역화는 BM에 이식된 생쥐의 6 주에의 분석 컨트롤에서 보다 RBPJKO microenvironment에 골수성 세포는 맥 관 구조에서 거주 했다 밝혔다.
샨 다, 이러한 특정 동물 모델 IVFM의 조합 RBPJKO BM microenvironment 골수성 세포의 engraftment 역학에서 통찰력 제공. 실험 설계 및 여기서 설명 하는 양적 접근 비슷한 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있는 패러다임으로 제시 된다. 예를 들어 모델, RAG1 GFP14 또는 Gata1 GFP15 마우스 추적 다른 셀 특정 계보를 사용 하 여 림프의 동작에 따라 수 또는 erythroid 창시자는 BM에 각각.

<table><tbody><tr><td>케타민 칵테일</td><td>IU 의과</td><td></td>대학 <td>케타민 90-100 mg/kg, 자일라진 2.5-5.0 mg/kg, 아세프로마진 1.0-2.5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC 덱스트란</td><td>Tdb 컨설팅</td><td>TD150-100mg</td><td>다른 색상의 덱스트란을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Andis 헤어 트리머</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4겹, 2 x 2</td></tr><tr><td>Nair 탈모 크림</td><td>상업 상점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0.9% 염화나트륨 폴리 병</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28g, 1/2cc</td></tr><tr><td>파인 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>스트레이트 펜셉, 각진 펜</td></tr>치 <tr><td>가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 실크 봉합사</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>기타 비흡수성 봉합사 사용 가능</td></tr><tr><td>WillCo- 유리 바닥 접시</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경 오일</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic 스테이지 인서트&nbsp;</td><td>IU 의과대학</td>은 <td>Olympus</td> FV1000 컨포칼 현미경 시스템을 맞춤 설계 <td></td></tr> 합니다<tr><td>.</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 대물렌즈&nbsp;</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 난방 패드</td><td>상업 상점</td><td></td><td>동물원 메드 파충류 난방 패드</td></tr><tr><td>Imaris 8.1 이미징 소프트웨어</td><td>비트 플레인</td><td></td><td>3/4 D 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

intravital 형광 현미경 검사 법 (ivfm)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 engraftment 역학을 공부 하

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

증거를 증가 일반 조 전문된 세포 벽 중요 한 조 혈 줄기 세포 (HSC) 기능1,2변조를 포함 하는 BM, 뚜렷한 microenvironmental 신호에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. 실제로, 조 혈 microenvironment의 더 상세한 그림은 이제 신흥에 endosteal와 내 피 틈새 형성 정상 HSC와 그들의 자손3,4,5의 규칙에 대 한 기능 단위 . 새로운 연구는 adipocytes, 유지 하 고 HSC 기능6,,78조절에 신경 세포, 혈관 주위 세포의 중요성을 계시 했다. 또한, 다른 계보, 즉 골수성과 림프 성 세포, 가정에서 세포 및 BM microenvironment 내의 특정 틈새에 있는 증거가 있다. 그러나, BM microenvironment 및 그것의 거주자의 완전 한 매핑 진행 중에서입니다.
계보 특정 형광 표식 또는 부족 BM 틈새의 특정 셀에 선택한 분자 유전자 조작 생쥐를 표현 하는 유전자 변형 마우스 긴장 지금 사용할 수 있습니다. 노크 아웃 및 혈통 추적 모델, 이식 방법, 함께에서 제공 기회 "틈새" 특정의 역할에 대 한 지식을 구체화를 세포 HSC, 같은 정의 된 조 혈 인구에 대 한 B-세포, T 세포, 골수성 세포와 erythroid 셀입니다. 이 전략은 calvarium의 2 광자 현미경의 사용을 병합 하 여 더 potentiated 될 수 있습니다. 제공 함으로써 고해상도 이미징 vivo에서 및 BM calvarium의 3 차원 렌더링, 우리가 지금 정확 하 게 위치 특정 조 혈 하위 집합은 BM에 가정과 평가 시간이 지남에 그들의 확장의 활동을 확인할 수 있습니다. 여기, 리스-GFP 유전자 변형 마우스 (골수성 세포 표시)9 , RBPJ (정식 노치 신호 부족 한) 녹아웃 쥐10 사용 됩니다 IVFM와 함께에서 노치 결함이 BM microenvironment 골수성 세포 engraftment 결정 하.

2 RBPJKO 및 2 RBPJWT 받는 사람의 동료 다른 시간 지점에서 개별 이미징 세션에 몇 군데 있었다: 24 h와 2, 4 및 6 주 (워크플로 그림 1A일러스트) BM 리스-GFP 세포의 이식 후.
각 마우스에서 이미지 (그림 2A,)중앙 정 맥 그리고 관상 봉합 (그림 2A, b)의 분기점에 관하여 그들의 위치에 의해 식별 된 BM calvarium의 6 표준 영역에서 인수 했다. 사출 Dextran 텍사스-레드의 이미징 이전 수 이러한 랜드마크의 식별 및 6 영역 (그림 2A)의 선택: 왼쪽 상단, 중간 및 오른쪽 (UL, UM, UR), 그리고 낮은, 중간 왼쪽과 오른쪽 (LL, LM, LR). 60...

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

이 절차의 전반적인 목표는 이식된 혈액 세포가 수혜자의 골수 틈새에 생착하는 것을 시각화하고 측정하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 이식 후 기증자 조혈 세포의 다른 골수 틈새에 대한 원점 복귀, 확장 및 국소화와 같은 세포 과정을 시각화할 수 있다는 것입니다. 조작된 동물 모델과 함께 사용되는 이 접근법은 조혈 세포 재생에 중요한 분자 경로를 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.조직학 또는 기타 이미징 기술과 달리 생체 내 현미경을 사용하면 세포 수준에서 실시간으로 살아있는 동물의 세포 간 상호 작용을 캡처할 수 있습니다. 우리는 골수 미세환경이 Notch 신호 손실로 인한 골수증식성 질환 발병의 초기 부위인지 여부를 결정하기 위해 이 방법을 사용하기로 결정했습니다. 이 기술을 처음 접하는 개인이 직면할 수 있는 과제에는 호흡 아티팩트 최소화, 머리의 최적 위치 및 안정화, 이미지 채도 방지 등이 포함됩니다.이식 1-2시간 전에 용해된 EGFP 마우스에 70% 에탄올을 분사합니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 발목 주위의 각 다리 피부를 절개하고 수술용 집게를 사용하여 피부와 털을 함께 제거하여 깨끗한 근육 조직을 노출시킵니다. 다리에서 가능한 한 많은 근육을 제거하십시오.그런 다음 무릎과 발목 관절의 뼈를 자르고 거즈 스펀지를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아 있는 근육 조직을 제거합니다. 세척된 뼈를 10% FBS가 보충된 DMEM이 함유된 6웰 플레이트로 헹굽니다. 그런 다음 4개의 뒷다리 뼈를 모두 PBS에 담긴 10ml의 차가운 EDTA로 절구에 옮기고 절구로 뼈를 으깨줍니다.골수 세포를 삼중화하여 단일 세포 현탁액을 얻고 70미크론 필터를 통해 슬러리를 15ml 원심분리 튜브로 변형시킵니다. 2-3밀리리터의 PBS로 필터를 헹굽니다. 그런 다음 세포를 원심분리하고 10ml의 새로운 DMEM과 10%FBS에 펠릿을 재현탁합니다.주사를 위해 세포 현탁액을 원심분리한 다음 세포의 농도를 혈청이 없는 IMDM에서 밀리리터당 7번째 세포까지 1.5배의 10으로 계산하고 조정합니다. 얼음 위에 세포를 놓습니다. 두 번째 방사선 투여 후 5-6시간 후에 여섯 번째 골수 세포에 10회씩 3회 주입하여 방사선을 투여받은 각 동물의 꼬리 정맥에 주입합니다.이식 후 적절한 시점을 추가합니다. 마취된 수혜자 마우스를 섭씨 37도의 가열 패드에 놓고 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다. 동물의 눈에 연고를 바르고 꼬리 정맥을 통해 적절한 형광 마커 100마이크로리터를 투여합니다.다음으로, 작은 전기 가위를 사용하여 동물 머리의 등 표면에서 털을 제거한 다음 제모 크림을 바릅니다. 5분 후, 거즈 스펀지로 크림을 제거하고 남은 용액을 식염수로 헹굽니다. 70% 에탄올을 적신 면봉으로 두피를 소독합니다.그런 다음 가는 집게와 가위를 사용하여 두피를 10-20mm 정도 절개하여 밑에 있는 등쪽 두개골 표면을 노출시킵니다. 5-0 수술용 실크를 사용하여 절개 부위의 양쪽에 두 개의 스테이 봉합사를 배치하여 플랩을 만들어 이미징을 위해 칼바륨을 노출시킵니다. 노출된 두개골에 기름 한 방울을 바릅니다.마우스를 누운 자세로 노출된 두피를 현미경 오일로 채워진 유리 바닥 접시에 담그십시오. 그런 다음 대물렌즈 위에 칼바륨이 있는 다광자 이미징 스테이지에 동물을 놓고 섭씨 37도의 가열 패드로 동물을 덮습니다. 다광자 이미지를 획득하는 동안 헤드가 올바른 위치에서 안정된 상태를 유지하는 것이 중요합니다.정위 장치를 사용하거나 적절하게 테이프로 마우스를 고정합니다. 다광자 이미징을 위해 변형된 도립 컨포칼 시스템을 사용하여 두 광자 레이저를 830나노미터로 조정합니다. 그런 다음 적절한 이미지 획득 소프트웨어를 엽니다.획득 설정 메뉴에서 단방향 스캐닝 모드가 선택되어 있는지 확인하고 스캔 속도를 픽셀당 4마이크로초, 프레임 속도를 512 x 512 픽셀, 줌을 1.5로 설정합니다. 0.95 목표에서 20X 와트를 선택합니다. 염료 목록 창을 열고 두 개의 광자를 선택합니다.그런 다음 현미경 컨트롤러 창에서 RDM690 미러를 선택합니다. 빛의 경로 및 주사위 창에서 레이저 장치 2 상자를 선택하여 두 광자 레이저 셔터가 열려 있는지 확인합니다. EPI 램프를 선택하고 B/G EPI 필터 큐브를 선택합니다.그런 다음 표본에 대물렌즈를 집중시켜 중심 정맥과 관상 동맥 봉합사의 분기점을 기준점으로 사용하여 칼바륨 골수 틈새의 혈관 흐름을 시각화합니다. 디스캔되지 않은 모드를 사용하여 3개의 외부 검출기를 선택하고 평균화 없이 픽셀당 4마이크로초의 스캔 속도로 표본을 이미지화하고 일정한 레이저 출력 및 검출기 게인으로 표본을 이미지화하여 최소한의 포화로 검출기의 전체 동적 범위를 활용할 수 있습니다. 조직의 깊이를 통해 일련의 절편을 수집한 후 적절한 전용 3-4D 이미지 정량 분석 및 시각화 소프트웨어를 엽니다.제조업체의 지침에 따라 적절한 3D 렌더링 알고리즘을 사용하여 Z 스택을 대화식으로 시각화합니다. 그런 다음 스폿 객체 분할 모듈을 사용하여 GFP 셀을 분할하고 스택 산술 처리를 적용하여 녹색 및 빨간색 채널에서 거짓 긍정 GFP 셀을 제거합니다. 마지막으로, surface segmentation 모듈을 사용하여 혈관 구조와 뼈 표면의 분할을 재구성하고, 필요에 따라 원위 표면까지의 세포의 거리를 계산하기 위해 Spot to Surface 알고리즘의 X 장력 거리를 적용합니다.여기서, 골수 칼바륨의 6개 표준 영역 각각에서 수집된 Z 스택은 3D 최대 강도 투영, 뼈 구성 요소를 포함한 3D 그림자 투영 및 3D 분할 이미지로 렌더링되어 세포의 정량화와 뼈 및 혈관으로부터의 거리를 측정할 수 있습니다. 이 실험에서 Notch-defective 골수 미세환경에서 골수성 세포의 in vivo 이미징은 donor lysed GFP 세포가 이식 후 24시간에 야생형 및 녹아웃 수혜자에서 유사한 귀환 효율을 갖는 반면 나중에 다른 생착을 나타내는 것으로 나타났습니다. 골수성 전구 세포 확장의 역학을 분석한 결과, 적응적으로 골수를 이식한 세포는 이식 후 2주가 지나면 녹아웃 수혜자에서 더 빠르게 그리고 더 많이 확장되는 것으로 나타났습니다.야생형 수혜자의 기증자 골수 세포는 나중에 확장되었지만 4주에 기증자 세포 및 녹아웃 수혜자보다 2배 더 많은 수를 보였는데, 이 시기에는 녹아웃 골수 내 기증자 세포가 빠르게 순환하기 때문에 감소합니다. 그리고 6주가 지나면 골수 칼바륨의 기증자 세포 수의 차이가 평준화됩니다. 또한, 골수 이식 후 6주에 녹아웃 및 야생형 칼바리아의 하단 중간 영역에 대한 3D 분할 분석은 용해된 GFP 세포가 두 유형의 수용 동물에서 뼈에서 동일한 거리에 국한되어 있음을 나타내지만, 흥미롭게도 녹아웃 마우스의 혈관 구조에서 더 멀리 떨어져 있습니다.일단 숙달되면 생체 내 골수 이미징은 적절하게 수행될 경우 마우스 한 마리당 1시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하는 동안에는 생쥐당 칼바륨 골수의 여러 부위를 샘플링하고 실험당 최소 3개의 마우스를 분석하여 인트라 및 인터 샘플 변동을 해결하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 골수 미세환경에 대한 특정 혈액 하위 집단의 생착 역학을 결정하기 위해 골수 이식과 생체 내 이미징을 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입 

생체 내 현미경 검사를 통해 조직 재생 및 종양 발달과 같은 동적 생물학적 과정을 연구할 수 있습니다. 매우 역동적인 조직인 calvarial bone marrow는 조혈과 혈관 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 생체 적합성 3D 프린팅 머리 고정 임플란트를 사용하면 반복적인 종방향 이미징이 가능하여 조직 역학 및 종양 미세환경에 대한 이해가 향상됩니다.

Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow(갈바리골수에서 혈관 역학의 생체 내 종단 영상)

학습하세요 IVFM을 이용한 조혈모세포 골수이식 역학 연구 방법을. 유전자 동물모델과 실시간 영상으로 세포 정착 과정을 관찰하고 골수 미세환경에서의 재생 메커니즘을 규명합니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

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