간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

본 방법론의 전반적인 목표는 서로 다른 단핵구 하위 집단에서의 포도당 흡수 및 포도당 운반체의 발현을 측정하는 것입니다. 이 방법은 질병 결과에서 면역 세포 대사의 중요성은 무엇인가와 같이 면역학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 분석 속도가 빠르고 수행하기 쉬우며, 반응성 물질이 필요하지 않고 적은 양의 혈액만으로도 가능하다는 점입니다.

시트르산 ACD-B 항응고 튜브에 혈액 샘플을 채취한 후 1시간 이내에 샘플을 생물안전작업대(biological safety cabinet)에 넣습니다. 다음으로, 각 샘플에서 100 µL의 혈액을 개별 폴리프로필렌 튜브에 넣고, 얼음 위에서 2 mL의 1X 용해 용액(lysing solution)을 처리하며 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 15분 후 세포를 원심 분리하고, 세척 완충액(wash buffer)으로 두 번 더 원심 분리합니다.

두 번째 세척 후, 피펫을 사용하여 상층액을 최대한 조심스럽게 제거하고, 얼음 위에서 100 µL의 세척 완충액으로 펠렛을 재현탁합니다. 특정 단핵구 하위 집단을 식별하기 위해, 세포 100 µL당 5 µL의 적절한 항체로 얼음 위 암소에서 30분 동안 세포를 염색합니다. 배양이 끝나면 세척액으로 샘플을 두 번 세척하고, PBS에 포함된 0.5% formaldehyde 200 µL로 세포를 고정합니다.

그 후, 4색 검출이 가능한 유세포 분석기로 24시간 이내에 세포를 분석합니다. 단핵구 하위 집단의 포도당 섭취량을 평가하려면, 각 샘플의 혈액 90 µL를 개별 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 관심 있는 형광 포도당 유사체 10 µL를 혈액에 추가합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 혼합한 뒤, 샘플을 알루미늄 호일로 덮습니다.

그 다음, 세포를 37 °C에서 15~30분 동안 배양한 후, 즉시 얼음에 옮깁니다. 이어서 튜브에 FACS lysing solution 4 mL를 첨가하고 세포를 원심 분리합니다. 그 후, 세척 완충액(wash buffer)을 사용하여 두 번째 원심 분리를 수행합니다.

상층액을 따라내고, 4°C의 암실에서 30분 동안 관심 있는 적절한 항체로 세포를 염색합니다. 그다음, 4 mL의 ice-cold 세척 버퍼로 샘플을 세척하고, 펠렛을 200~300 µL의 ice-cold PBS에 재부유시킨 후 10분 이내에 튜브를 분석합니다. 유세포 분석의 경우, 먼저 염색하지 않은 샘플과 개별적으로 염색된 대조군 샘플을 사용하여 보정(compensation)을 설정합니다.

다음으로, 적절한 단일 세포 분석 소프트웨어에서 첫 번째 샘플을 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter) 도표로 열고, 그림과 같이 단핵구를 게이팅합니다. 그런 다음, 게이팅된 단핵구 집단을 더블 클릭하고 CD3 음성 집단을 게이팅합니다. 이제 CD3 음성 집단을 더블 클릭하고, x축에는 CD14 염색 결과가, y축에는 CD16 염색 결과가 표시되도록 설정합니다.

다음으로, 특정 단핵구 하위 집단에서 포도당 섭취 또는 포도당 수송체의 발현을 측정하기 위해 적절한 히스토그램을 생성합니다. 그 후, 정의된 세포 집단이 존재하는 경우, 대조군 FITC igG 샘플을 사용하여 게이트를 설정하고 각 샘플 내 CD14 양성 단핵구의 총 백분율을 결정합니다. 여기에서는 세포 산란도를 통한 단핵구 분리와 CD3 음성 집단 내 게이팅을 통한 T 세포 제외라는 초기 게이팅 전략이 제시되어 있습니다.

그 후 단핵구를 CD14 발현 단독으로, 또는 CD16과 조합하여 게이팅함으로써 전체 단핵구 또는 단핵구 하위 집단을 식별합니다. CD14 양성 Glut-1 포도당 수송체 양성 단핵구의 뚜렷한 집단이 관찰될 수 있으며, 이는 특히 HIV 양성 개인으로부터 얻은 순환 백혈구에서 가장 두드러지게 나타납니다. CD14 양성 Glut-1 양성 세포는 HIV 비감염자의 특정 단핵구 서브셋 내에서도 관찰될 수 있으나, 이러한 집단은 HIV 양성 환자에서 더 명확하게 나타납니다.

포도당 수송체 발현 데이터에서 예상한 바와 같이, 포도당 유사체인 2-NBDG 또한 HIV 양성 환자 유래 세포에서 더 많은 양으로 흡수됩니다. 이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 1시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안에는 모든 구역의 빛 노출을 제한하는 것이 중요합니다.

포도당 유사체 흡수 이후, 세포 표면 항체로 염색하여 관심 있는 특정 면역 세포군을 식별할 수 있습니다. 이 방법이 개발된 후, HIV가 면역 세포 대사에 미치는 영향을 결정하는 데 사용할 수 있으며, 면역학, 바이러스학, 암 연구와 같은 다른 분야의 연구자들에 의해서도 탐구될 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 면역 세포에서 포도당 수송체 1과 포도당 흡수를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

감염성 물질을 다룰 때는 표준 안전 절차를 준수해야 함을 잊지 마십시오.