Name: 사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 학습하세요 CARS 현미경 기술을 이용한 라벨 없이 화학적으로 선택적인 생세포 이미징 방법을 Ti:sapphire 및 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경에 구현하는 과정입니다. 이 기술은 신경과학 및 생물학 연구에 새로운 가능성을 열어줍니다.

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저자는 고속 오실로스코프를 대여해 준 Philippe Combette 박사(IES, UM, 프랑스 몽펠리에)에게 감사의 뜻을 전하며, 몽펠리에 RIO Imaging(MRI)의 재정적 지원에 감사를 표합니다. HR은 ANR이 일관된 라만 이미징 개발을 위해 France Bio Imaging(ANR-10-INSB-04-01) 및 France Life Imaging(ANR-11-INSB-0006) 인프라 네트워크를 승인한 것을 인정합니다. 이 연구는 주로 유럽연구위원회(European Research Council) 보조금(FP7-IDEAS-ERC 311610)과 NT에 대한 INSERM - AVENIR 보조금의 지원을 받았습니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

작품의 가장 어려운 부분은 레이저 빔의 시간 동기화된다. 그것은 빠른 오실로스코프와 결합 된 빠른 광 다이오드를 필요로하지만, 시간 만 거친 중복 처음에 수행 할 수 있습니다. 그 후 몇 cm의 추가적인 조정이 필요하다. 마지막으로, 선형 변환 스테이지 마이크로 미터에 의해 이동은 CARS 신호를 트리거하기 위해 지연 라인 길이의 최종 미세 조정을 행하는 허용한다. 변환 스테이지 마이크로 드라이브를 조정하여 관찰이 신호는, 약 20 마이크로 미터의 좁은 범위로 유지된다. 이는 펄스 폭의 절반 정도, 즉 140 FSEC의 빔의 피크 시프트에 대응한다. 차 신호에 필요한 두 빔의 공간적 중첩은 레이저 주사 현미경 시스템을위한 통상의 광 배향과 유사하다. 지연 라인의 구현은 실험의 기본 배경을 가진 생물 학자에 의해 몇 주 안에 달성 될 수있다물리학 자와 알 광학 또는 협력한다. 특별한주의 반사 손실을 최소화하기 위해 미러의 선택에 대해 수행되어야한다. 지연 라인을...

광학 현미경은 세포 내 해상도로 생물학적 시스템을 살고 동적 프로세스의 비파괴 시각화를위한 주요 기술이되었다. 형광 현미경으로 인해 높은 특이 도와 민감도 1 생균 현재 가장 많이 사용되는 영상의 대비이다. 형광 프로브의 큰 팔레트 (외인성 색소, 유전자 인코딩 단백질, 반도체 나노 입자를) 등장했습니다. 다양한 샘플 조명 형광 기반 기술은 3 차원 영상을 수행하고 2 photobleaching에되는이 기술의 주요 단점을 줄이기 위해 (예 촛점 또는 이광자 현미경 등) 번성하고있다. 분자 종의 대부분은 본질적으로 형광하지 않으며, 따라서 이러한 형광 인위적으로 몇 군데 샘플에 도입 할 필요가 있기 때문에 다른 제한은 형광 라벨의 요구 사항을 포함한다. 이 인공 조작은 작은 분자 특히 파괴적이거나 냄비를 유도 할 수있다ential 사진 독성. 이러한 이유는 생체 관측 형광 현미경하지가 적합합니다. 따라서, 형광성 분자의 사용없이 고감도 특정 분자 대조 광학 이미징 기술의 사용은 바이오 메디컬 사이언스에서 매우 바람직하다. 라벨이나 얼룩없이 여러 비선형 광학 이미징 기술은 두 번째 고조파 세대 (SHG) 3,4와 세 번째 고조파 세대 (THG) 5를 포함 등장했다. SHG 현미경은 미세 소관 또는 콜라겐 6으로 초분자 레벨에서 화상 구조 배치로 사용되어왔다. THG는 수성 매질 및 지질 (7) 사이의 인터페이스로서 광 이질성로부터 생성된다. THG는 이미지 수초 8,9로 증명되었다. 두 기술들은 이광자 형광 현미경상에서 구현 오직 하나의 레이저 빔을 필요로 할 수있다. 이들은 높은 전력 레이저 강도를 필요로하지만 (전형적으로 50생활 샘플에 해로운이며, 명확하게 이미지 특정 생물학적 구조에 필요한 화학적 특이성을 제공하지 않는 THG 9 1,180 ㎚), 50 mW의 - SHG (10), (25) 860 nm에서 mW의. 선택적 화학적 이미징 라만 산란에 기초한 분자 고유 진동 신호로부터 얻을 수있다. 광 빔 상관 닿으 광자 흡수 자나 분자에 의해 산란 될 수있다. 산란 된 광자의 대부분은 입사 광자 에너지와 같은, 즉, 주파수를 가질 것이다. 이 프로세스는 레일리 산란이라고한다. 그러나, 광자 소수 라만 산란이라 비탄성 산란 과정, 즉, 입사 광자의 주파수와 다른 주파수의 광 산란한다. 에너지의 차이는 분자 구조 및 환경에 따라 진동 모드의 여기로부터 기인한다. 따라서, 자발 라만 산란 잠십오 화학적으로 선택적 영상은 다른 분자는 특정 진동 주파수를 가지고있다. 그러나 그것 때문에 매우 약한 신호의 제한됩니다. 공 초점 라만 현미경이 개발 및 3D 공간 해상도를 제공하지만, 높은 평균 전력 및 긴 획득 시간 (11)을 필요로하고있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 레이저 기술의 최근 발전은 특히 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란의 비선형 광학 진동 현미경의 상승 (CARS) 11,12,13 수있다. CARS는 3 차 비선형 광학 과정이다. 주파수 ω의 P에 펌프광 구성된 세 개의 레이저 빔은 주파수 ω의 S에서 스톡스 광 및 프로브 빔 (주로 펌프 임) 시료에 집중되고 (주파수 ω AS =에서 반 스톡스 빔을 생성 2ω P - ω의 S) 14. 안티 - 스토크 스 신호를 크게 향상시킬 수있을 때, 주파수 차이(- ω S ω P) 펌프와 스톡스 라만 분자 진동 Ω의 R =로 조정되어 빔 사이. CARS 신호는 다수의 광자 상호 작용을 기반으로합니다. 따라서, 자발 라만 산란 강도보다 강한 간섭 신호의 순서를 생성한다. CARS 현미경은 제 실험적 던컨 등. (15)에 의해 입증되었다. Zumbusch 외는. 높은 개구 수의 대물 렌즈를 두 초점 근적외선 펨토초 레이저 빔을 이용하여 CARS의 위상 정합 조건을 허용하고 이광자 비 공진 배경 (16)을 회피하여, 그 기술을 향상시켰다. CARS 현미경 따라서 화학적으로 살아있는 세포 (19, 20)을로 (CH 신축 진동을 통해) 지질 같은 분자 (17, 18), 물 (OH 신축 진동을 통해), 단백질, DNA를 검출함으로써, 살아있는 세포와 조직 이미징을위한 강력한 도구로 떠오르고있다 또한 화학 물질 화합물을 중수 소화제약 (21) 및 화장품 응용 프로그램 (22)에 대한의. 비선형 현미경의 가장 큰 한계는 복잡성과 광원의 비용에서 기인한다. CARS 시스템은 짧은 펄스 기간과 시간적 및 공간적 동기화 펄스 트레인 두 파장 가변 레이저가 필요합니다. 초기 CARS 현미경은 두 개의 동기화 된 피코 초 티를 기반으로했다 : 사파이어 레이저 (20). 초 연속 광원 (23)을 생성하는 사파이어 레이저 : CARS 이미징은 단일 펨토초 TI의 얻었다. 최근에, 단일 펨토초 Ti로 이루어지는 레이저 소스 : 가변 광 파라 메트릭 발진기 (OPO)를 펌핑 사파이어 레이저는 CARS 현미경에 사용되어왔다. 이 셋업은 본질적으로 일시적으로 펌프와 전체 분자 진동 스펙트럼 (24)을 포함 스톡스 빔 사이의 주파수의 차이 빔을 동기화 허용한다. 또한, 레이저 주사 현미경 턴에 기초주로 두 광자 형광 (TPF)에 사용되는 키 FS 레이저와 OPO가 아닌 물리학에 대해 사용할 수 있습니다. 각 비선형 (NLO) 영상 기법은 특정 구조 나 분자에 민감하기 때문에 이러한 셋업의 전위가 크게 다른 비선형 광학 영상의 혼입에 의해 보충 투​​자를 필요로하지 않고 향상 될 수있다. 복합 NLO 촬상 따라서 복잡한 생물학적 시료 25 NLO 현미경의 전위 대문자. 이러한 기술의 결합은 지질 대사, 피부 암 개발 (26), 골격 근육 발달 (27), 동맥 경화성 병변 (28)에 특히 많은 생물 학적 질문의 조사를 허용했다. 또한 CARS과 레이저 빔 주사의 구현은 고속 촬상, 즉 생체 역학 과정을 연구하기위한 매력적인 도구의 기능을 제공한다. 이 연구의 목적은 t을 구현하는 각 단계를 보여주는 것입니다표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 그는 CARS 기술. 현미경은 FSEC 티를 기반으로 : 사파이어 레이저와 OPO : 생물 학자를위한 소프트웨어에 의해 동작합니다 (티 의해 펌핑 레이저 사파이어). 통합 시간에 두 개의 빔을 동기화하기 위해 상기 레이저 빔 경로 중 하나의 길이를 조정함으로써 수행 하였다. 우리는 실험 광학의 기본적인 배경을 필요로이 기술의 단계별 구현을 설명합니다. 우리는 또한 CARS는 쥐의 좌골 신경의 수초에서 얻은 영상 설명, 우리는이 영상은 표준 두 광자 형광 기술과 두 번째 고조파 세대로, 다른 비선형 광학 영상을 동시에 수행 할 수 있습니다 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>광검출기</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical parametric oscillator OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Examiner microscope LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Motorized</td><td>periscope Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beam combiner</td>, <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acousto-optic modulator</td>, <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO 전력 감쇠기</td>, <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광전자 증배관</td>, <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 소프트웨어</td>, <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandpass </td><td>필터 Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp; nm; 465 - 610&nbsp; nm</td></tr><tr><td>이색성 거울</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>컷오프 파장 760&nbsp; nm</td></tr><tr><td>실버 미러</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&람다;/10, 480 - 20,000&nbsp; nm, 수량 4</td></tr><tr><td>표준 마이크로미터가 있는 단축 변환 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>수량 1</td></tr><tr><td>알루미늄 브레드보드</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>수량 1</td></tr><tr><td>미러 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>수량 4</td></tr><tr><td>&Oslash용 미러 홀더; 1" 광학&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>수량 4</td></tr><tr><td>아이리스 다이어프램&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>수량 3</td></tr><tr><td>보호 상자</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>수량 1</td></tr><tr><td>광학 포스트</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>수량 8 (설정에 따라 길이)</td></tr><tr><td>661 - 690 nm 대역통과 필터</td><td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine&reg; 단일대역 대역통과 필터</td><td>수량 1</td></tr><tr><td>형광 비드</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; 형광 마이크로스피어 크기 키트</td><td></td></tr><tr><td>레이저 보기 카드</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>IR 레이저 보기 카드</td></tr><tr><td>레이저 안전 유리</td><td>Newport</td><td>LV-F22. P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>플루오로미엘린&트레이드; 레드 형광 미엘린 염색&nbsp;</td><td>써모피셔</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

사파이어와 opo 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (cars) 시스템의 구현

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

펨토초 티타늄 합성 레이저 스캐닝 현미경 : 레이저 라인을 복제하는 사파이어 레이저 및 광 파라 메트릭 발진 (OPO)은 생물학 가능하게되었다. 이 시스템은 기본적으로 멀티 채널 이광자 형광 현미경을 위해 설계된다. 그러나, 임의의 수정없이, 상기 제 2 고조파 발생 (SHG) 또는 3 고조파 발생 (THG) 보완 비선형 광학 현미경은 구성 분자 또는 수성 중간의 라벨없는 결상을 가능하게 세트해서 수행 될 수있다 지질 인터페이스. 이러한 기술은 생체의 관찰에 적합하지만, 화학적 특성으로 제한된다. 선택적 화학적 이미징 라만 산란에 기초한 고유 진동 신호로부터 얻을 수있다. 공 초점 라만 현미경은 3D 공간 해상도를 제공하지만, 높은 평균 전력 및 긴 획득 시간이 필요하다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 레이저 기술의 최근 발전은 (STABLE)을 허용했다비선형 광학 진동 현미경의 opment, 특히 코 히어 런트 반 스톡스 라만에 (CARS)을 산란. CARS 현미경 따라서 화학적으로 매핑 (OH 신축 진동을 통해) (CH 신축 진동을 통해) 지질, 물, 단백질이나 DNA에 의해 생물학적 라이브 세포 이미징을위한 강력한 도구로 떠오르고있다. 본 연구에서 우리는 표준 OPO 결합 광자 레이저 스캐닝 현미경에 CARS 기술의 구현을 설명한다. 이것은 레이저 빔의 경로 중 하나의 길이를 조정함으로써 2 개의 레이저 라인의 시간 동기에 근거한다. 우리는 기존 광자 시스템에서이 기법의 단계별 구현을 제시한다. 실험 광학의 기본 배경은 도움이되고 제시된 시스템은 고가의 추가 장비가 필요하지 않습니다. 우리는 또한 쥐의 좌골 신경의 수초에 얻은 이미징 CARS을 설명하고, 우리는이 영상이 같은 표준 t 다른 비선형 광학 이미징, 동시에 수행 할 수 있음을 보여WO 광자 형광 기법 및 제 고조파 발생.

<html> 표준의 Ti 펄스열 주파수 : 사파이어 레이저는 일반적으로 약 80 메가 헤르츠이다. 레이저 사파이어 다음 OPO은 상기 티타늄으로 펌핑되기 때문에, 동일한 주파수를 갖는다. 최소 200 MHz의 빠른 오실로스코프 따라서 필요합니다. 범위의 빠른 포토 다이오드 (600)에 1,100 내지도 필요합니다. 사파이어와 OPO 신호 1 / (2 × 80 × 106) = 6.2 나노초의 시프트 : TI의이 때 최대 시간적 변화가 발생합니다. 이는 1.9 m의 최대 빔 경로 변화에 대응하는 티 2는 OPO 레이저 광 (A)의 기록 펄스 열을 나타낸다 : 그리고. (지연 라인 (B)없이 사파이어 레이저 빔 및 상기 조정 가능 지연 라인으로 C를 ). 도 2a 및도 2c에 도시 된 바와 같이, 펄스 트레인 따라서 대략 구현 지연 라인...

분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

본 절차의 전체적인 목표는 CARS라고 불리는 보완적인 현미경 기술을 구현하는 것입니다. CARS는 펨토초 티타늄-사파이어 레이저와 광학 매개변수 발진기(optical parameter oscillator) 기반의 표준 다광자 레이저 스캐닝 현미경에서 라벨 프리(label-free) 방식의 화학적 선택적 라이프스타일 이미징을 가능하게 합니다. 이 방법은 지질 관련 질환, 피부 침투 메커니즘 또는 피부 질환의 이해와 같이 생물학 또는 신경과학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Ti:Sapphire 및 OPO 레이저 기반의 표준 레이저 스캐닝 현미경에 쉽게 구현할 수 있다는 점입니다.절차 시연은 연구원이며 실험실 영상 플랫폼 책임자인 Hassan Boukhaddaoui와 Vasyl Mytskaniuk이 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 제시된 대로 티타늄-사파이어 레이저와 OPO 레이저를 켭니다. 현미경 컴퓨터의 전원을 켭니다.현미경 구성 요소 스위치를 켭니다. 바탕 화면의 아이콘을 더블 클릭하여 소프트웨어를 실행하고 텍스트 프로토콜에 따라 설정합니다. 그런 다음, 차단 파장이 760 nanometers인 다이크로익 미러를 사이드 포트 슬라이더에 장착합니다.대물렌즈 노즈피스 상단의 무한 광학 공간에서 이를 찾으십시오. 제시된 결과를 재현하려면 PMT1 앞에 협대역 통과 필터와 리플렉터 큐브를 설정하여 670 nanometers의 CARS 신호만 기록하도록 하십시오. 그 다음, 수초의 형광 관찰을 위해 PMT3 앞에, SHG 관찰을 위해 PMT4 앞에 특정 협대역 필터를 배치하십시오.소프트웨어에서 임시 밴드 패스 필터를 사용하여 검출기의 신호를 설정하십시오. 획득(acquisition) 탭의 설정 관리자(setup manager) 메뉴에서 광경로(light path) 도구를 연 다음, 원하는 PMT를 활성화하고 채널 색상을 선택하십시오. 예를 들어, CARS에는 녹색을, SHG에는 마젠타색을 사용하십시오.동일한 티타늄 사파이어 레이저에서 출력된 두 빔은 OPO 빔이 생성될 때 지연이 발생하므로 현미경에 도달할 때 서로 동기화되지 않습니다. 지연 라인을 통합하여 레이저 빔 패드 중 하나의 길이를 조정함으로써 이를 다시 동기화하려면 다음 절차를 따르십시오. 빠른 포토다이오드와 빠른 오실로스코프가 필요합니다.먼저, BNC 케이블을 사용하여 오실로스코프의 입력 채널 CH1을 레이저 전기 BNC 출력 동기화 출력(sync out)에 연결합니다. 다음으로, 입력 채널 CH2를 포토다이오드에 연결합니다. 그런 다음, 트리거 메뉴를 누르고 메인 메뉴 버튼의 소스(source)를 선택한 후, CH1로 선택된 채널에 해당하는 사이드 메뉴 버튼을 눌러 CH1 채널을 트리거로 지정합니다.이제 광학 마운팅 포스트를 사용하여 10x 공기 현미경 대물렌즈의 초점 평면에 있는 포토다이오드에 위치시키고 고정하십시오. 채널 도구에서 티타늄-사파이어 레이저 파장을 830 nm로 설정하고, 전체 출력의 1% 미만인 낮은 출력으로 정의하십시오. 획득 모드 도구에서 스캔 영역을 한 점으로 줄여 포토다이오드에 가장 작은 빔이 조사되도록 하십시오.그런 다음 continuous 버튼을 클릭하여 레이저 스캔을 켭니다. 오실로스코프의 Autoset을 누르고 포토다이오드를 수동으로 이동시켜 오실로스코프 화면에 펄스 열이 나타나도록 합니다. run/stop 버튼을 눌러 화면을 정지시킵니다.다음으로, 티타늄-사파이어 레이저 스캔을 끕니다. 소프트웨어에서 Channels 도구를 클릭하고, 830 nanometer 레이저 선택을 해제한 다음 OPO 신호를 1107 nanometers 및 low power로 설정합니다. 그런 다음 OPO 레이저 스캔을 켜고, 오실로스코프에 OPO 레이저의 펄스 트레인을 기록한 후 OPO 레이저 스캔을 끕니다.이제 티타늄 사파이어 신호와 OPO 신호 사이의 시간적 편이를 비교하십시오. 거울의 위치를 설정하는 데 사용할 지연선의 길이를 계산하십시오. 계속하기 전에 보안경을 착용하고 손목에서 체인 팔찌나 시계를 제거하십시오.이제 보호 튜브를 제거하여 지연 라인이 설치될 레이저 티타늄-사파이어 라인을 개방합니다. 그다음 레이저 빔을 쉽게 관찰할 수 있도록 가시광선 영역의 파장(예: 저출력의 700 nanometers)을 선택하고 레이저 스캔을 켭니다. 이제 광학 마운팅 포스트를 사용하여 개방된 레이저 라인에 두 개의 아이리스 조리개를 설치합니다.하나의 조리개를 지연선(delay line) 출구에 배치하고, 다른 조리개를 페리스코프(periscope) 입구에 배치하십시오. 다음으로, 조리개 구경을 줄이고 레이저 빔 경로에 맞게 조리개 위치를 조정한 후 광학 테이블에 고정하십시오. 마지막으로, 세 번째 이동식 조리개의 수직 위치를 조정하십시오.크기 조절 조리개(size diaphragms)는 지연선(delay line)의 4개 거울을 순차적으로 배치하는 동안 레이저 빔의 위치를 확인하여 재정렬 절차의 대조군 역할을 수행합니다. 이제 지연선의 입구에 있는 컴팩트 키네마틱 거울 마운트에 거울 M1을 배치하고, 이동식 조리개를 사용하여 빔 높이를 유지하도록 위치와 방향을 조정하십시오. 그런 다음, 계산된 지연선 길이에 따라 거울 M2와 M3를 이동 스테이지 위에 90도 각도로 배치하고, 이동식 조리개를 사용하여 그 방향을 조정하십시오.지연선(delay line)의 출구이자 아이리스(iris) 바로 앞에 M4를 설치하고, 두 개의 고정 아이리스 다이아프램을 통과하는 레이저 빔 경로에 맞게 M4의 위치와 각도를 세밀하게 조정합니다. 이제 현미경 대물렌즈의 출력단에 레이저 관찰 카드를 배치하여 레이저 빔 프로파일을 확인합니다. 필요한 경우, 균일하고 밝은 원형 디스크가 관찰되도록 M4의 방향을 약간 조정합니다.마지막으로, 샘플 초점 평면의 레이저 빔 아래에 고속 포토다이오드를 다시 배치합니다. 그런 다음 오실로스코프에서 티타늄-사파이어 레이저 빔과 OPO 빔 사이의 시간적 편이를 관찰합니다. 필요한 경우, 전체 이동 스테이지를 움직여 지연 라인 길이를 변경함으로써 펄스를 동기화합니다.CARS 신호에 필요한 두 빔의 공간적 중첩은 현미경 슬라이드에 고정된 형광 폴리스티렌 비즈를 시각화하여 얻습니다. 20x 수침 렌즈를 사용하여 비즈에 초점을 맞춥니다. 이제 획득 탭의 채널 도구에서 트랙 1을 추가하거나 기존 트랙을 사용하십시오.티타늄-사파이어 레이저 빔의 파장을 830 nanometers로 선택하고 출력을 low power로 설정하십시오. Channels 창의 track one 상자에서 색상을 green으로 전환하고, light path 창에서 PMT3 또는 PMT4 상자를 선택하십시오. 다음으로, OPO 레이저 빔을 위해 track two를 추가하고 파장을 1107 nanometers로, 출력을 low power로 설정하십시오.Channels 창의 track two 상자와 light path 창의 PMT3 또는 PMT4 상자에서 색상을 빨간색으로 전환하십시오. 이제 최대 스캔 영역을 선택하고 두 트랙의 게인을 600으로 조정하십시오. 그런 다음 continuous를 클릭하여 두 빔의 스캔을 시료에 순차적으로 적용하십시오.2D 보기의 화면 영역에 있는 이미지를 관찰하십시오. 두 레이저의 출력을 높이십시오. 필요한 경우, 포커싱 드라이브를 약간 이동시켜 비드의 초점 평면을 찾으십시오.마지막으로, 크롭 영역을 조정하고 단일 비드 또는 인접한 비드 그룹을 확대합니다. 그다음, 페리스코프 컨트롤러를 사용하여 XY 평면에서 빔을 중첩시킵니다. 소프트웨어에서 Maintain 탭을 엽니다.시스템 옵션을 클릭하여 전동 페리스코프 도구 창을 표시합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 설명합니다. 두 레이저 빔의 이미지를 중첩시킨 후 동기화를 완료합니다.CARS를 활성화하기 위한 정밀한 시간 조절을 수행하려면, 올리브 오일 한 방울이 묻은 유리 슬라이드와 커버 슬립을 준비하십시오. 그다음 20x 수침 렌즈를 사용하여 커버 슬립의 가장자리에 초점을 맞춥니다. 이제 트랙 1에서 티타늄-사파이어 레이저 빔의 파장을 830 nanometrs로, OPO의 파장을 1107 nanometers로 설정하십시오.동시 스캔을 위해 트랙 1의 두 레이저를 모두 켜십시오. 우선 두 레이저 모두 낮은 출력으로 시작하십시오. 그다음, 광경로(light path) 창에서 PMT4 체크를 해제하고 PMT1을 선택하십시오.그 다음 최대 스캔 영역을 선택하고 continuous 버튼을 클릭하여 레이저 스캔을 켭니다. 게인(gain)을 600으로 조정하고, 필요한 경우 두 레이저의 출력을 높입니다. 이어서 디스플레이 뷰 옵션 제어 블록에서 디스플레이 강도를 조정합니다.그런 다음 신호가 현저히 강화될 때까지 지연선의 이동 스테이지를 천천히 움직입니다. 다음으로, 두 레이저의 출력을 모두 낮춥니다. 이제 두 레이저 중 하나를 번갈아 끄면서 해당 신호가 CARS 신호인지 확인합니다.신호 강도가 약해지거나 사라지면 CARS 신호를 얻은 것입니다. 최종 시스템은 비물리학자를 대상으로 하므로, 유해하고 보이지 않는 고피크 전력의 레이저 빔에 직접 노출되는 것을 방지하기 위해 지연 선로(delay line)의 광경로를 인클로저 박스와 튜브로 밀폐하십시오. 다만, 이동 스테이지 노브는 조작할 수 있도록 접근 가능하게 배치하십시오.수초(myelin)에 선택성을 가진 형광-미엘린 레드 염료를 사용하여 수초집을 관찰하였습니다. 830nm와 1095nm에서 동시에 조사하면 CARS 신호가 생성됩니다. 원형으로 표시된 부분은 횡단면에서 축삭을 둘러싸고 있는 수초집에 해당합니다.CARS 영상과 형광 영상을 중첩시켰을 때 동일한 구조가 확인되었습니다. CARS와 형광 표지의 세부 묘사 수준은 매우 유사합니다. 이는 잠재적으로 염료 사용의 필요성을 없앨 수 있습니다.이 시스템은 좌골 신경의 외표면에 있는 콜라겐 섬유로부터 제2고조파 신호를 동시에 생성할 수도 있습니다. CARS 신호 기록에는 670 nanometers의 협대역 통과 필터가 사용되므로, 550 nanometers의 신호를 기록하기 위해 다른 검출기가 사용됩니다. 섬유는 마젠타색의 거짓 색상으로 표시되어 있습니다.CARS 신호만으로도 수초가 명확하게 나타납니다. 두 신호를 동시에 시각화하면, 녹색으로 표시된 수초가 마젠타색의 콜라겐 섬유에 둘러싸여 있는 것을 확인할 수 있습니다. CARS 신호는 SHG 또는 THG 신호보다 더 적은 에너지를 필요로 합니다.CARS 신호는 830 nm에서 4 mW, 1095 nm에서 13 mW로 얻었으며, SHG 신호를 얻기 위해서는 1095 nm에서 50 mW가 필요했습니다. 이 영상을 시청한 후, 두 레이저 빔을 시간적으로 동기화하기 위해 레이저 빔 경로 중 하나를 단계별로 수정하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 지연선(delay line)의 구현은 실험 광학에 대한 기초 지식을 갖춘 생물학자가 수주 내에 수행하거나 물리학자와의 협업을 통해 달성할 수 있습니다.고출력의 보이지 않는 레이저 빔을 다루는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 따라서 절차 수행 중 보호 안경을 착용하고 레이저 빔 경로를 최종적으로 차폐하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세 단일 파장 짧은 펄스 레이저의 조합 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)과 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차)를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 신호의 차이점은 약한 래맨 scatterers의 이미징을함으로써 일관된 래맨 신호를 감지 않으면 어려운위한 향상된 감도를 제공합니다.

이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.

자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현

피부 내의 제약 화합물을 시각화하고 정량화하기 위한 일관된 라만 산란 영상화 방법론이 기재되어 있다. 이 논문은 피부 조직 제제 (인간 및 마우스) 및 국소 제형 적용, 시공간 농도 프로파일을 정량화하기위한 이미지 획득 및 국소 약물 전달을 평가하기위한 예비 약동학 분석에 대해 설명합니다.

코히어런트 라만 산란 이미징을 사용하여 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

무지개 유사 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징은 고도로 다중화 된 에피토프 기반 단백질 이미징을위한 새로운 플랫폼입니다. 여기에서는 항체 준비, 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리 및 epr-SRS 조직 이미징을 포함한 실용적인 가이드를 제시합니다.

라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징

이 기사에서는 스펙트럼 초점 모듈과 이중 출력 펄스 레이저의 통합을 제시하여 금 나노 입자와 암세포의 신속한 초분광 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 표준 레이저 스캐닝 현미경에서 다중 모드 비선형 광학 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.

다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

수초화를 시각화하는 것은 신경계를 연구하는 많은 연구자들에게 중요한 목표입니다. CAS는 미엘린과 같은 특수 구조를 조명하는 뇌와 같은 조직 내에서 지질을 기본적으로 이미지화할 수 있는 면역형광법과 호환되는 기술입니다.

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

학습하세요 CARS 현미경 기술을 이용한 라벨 없이 화학적으로 선택적인 생세포 이미징 방법을 Ti:sapphire 및 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경에 구현하는 과정입니다. 이 기술은 신경과학 및 생물학 연구에 새로운 가능성을 열어줍니다.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

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