고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

이 절차의 전반적인 목표는 인간 제대 정맥 내피 세포를 배양하고 살아있는 세포 타임 랩스 이미징을 사용하여 세포골격 역학 및 세포 이동을 분석하는 것입니다. 이 비디오에 설명된 방법은 세포, 분자 및 기계생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 서로 다른 ECM의 참여에 의해 세포 모양과 운동성이 어떻게 조절되는지 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

샘플 준비 단계를 수행하기 어렵기 때문에 시각적 시연이 중요합니다. 이를 위해서는 공정 전반에 걸쳐 적시에 세포를 정밀하게 처리해야 합니다. 이 방법은 혈관 신생 중 내피 세포 운동성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 거의 모든 부착 세포 모델 시스템의 현미경 조사에도 적용할 수 있습니다.

집게를 사용하여 100% 에탄올 저장 용기에서 커버슬립을 집어 분젠 버너 화염에 통과시켜 살균합니다. 그런 다음 35mm 페트리 접시에 넣으십시오. 각 샘플에 대해 하나의 커버슬립을 준비합니다.

1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 10마이크로리터의 1밀리리터 피브로넥틴 원액과 990마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 그런 다음 250마이크로리터의 용액을 각 커버슬립에 피펫으로 넣습니다. 용액을 골고루 펴서 표면을 덮습니다.

커버슬립을 섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 사용하기 전에 각 커버슬립을 PBS 2ml로 세 번 헹굽니다. 혈구계를 사용하여 배양된 HUVEC의 수를 측정하고 비이동 실험의 경우 커버슬립당 100, 000개의 세포를 포함하거나 이동 실험의 경우 커버슬립당 500, 000개의 세포를 포함하는 부피를 마이크로 원심분리기 튜브로 이동합니다.

세포를 1, 400 번 G로 4 분 동안 회전시켜 펠릿으로 만듭니다. 스핀 후 테스트할 각 조건에 대해 100마이크로리터의 전기천공법 완충액에 최대 100만 개의 세포를 재현탁시키고 1마이크로그램의 cDNA와 결합합니다. 세포를 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다.

HUVEC 전기천공법(electroporation)을 위해 지정된 프로그램을 사용하여 세포와 DNA 혼합물을 transfection합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 완전한 내피 기저 배지를 추가하여 형질주입된 세포를 구합니다. 그런 다음 적절한 세포 부피를 피브로넥틴으로 코팅된 커버슬립에 플레이트합니다.

cDNA 구조체가 발현될 시간을 허용하기 위해 섭씨 37도에서 3-4시간 동안 세포를 배양합니다. 이미징을 준비하기 위해 2.5cm x 0.65cm 크기의 양면 테이프 스트립 2개를 깨끗한 유리 슬라이드의 상단과 하단 가장자리를 따라 수평으로 고정합니다. 챔버를 밀봉하기 위해 테이프와 슬라이드 가장자리 사이에 약간의 공간을 허용하는 것이 중요합니다.

커버슬립의 두 가장자리가 테이프에 놓이도록 커버슬립 셀 쪽이 아래로 향하게 장착합니다. 집게를 사용하여 부드럽게 눌러 커버 슬립을 고정합니다. 마이크로피펫을 사용하여 커버슬립과 슬라이드 사이에 40마이크로리터의 이미징 매체를 추가합니다.

커버슬립과 슬라이드 사이의 공간이 이미징 매체로 완전히 채워졌는지 확인하십시오. 필요한 경우 종이 닦음으로 여분의 매체를 닦아냅니다. 따뜻한 VALAP으로 모든 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.

유리 커버 슬립을 부드럽게 눌러 누출 여부를 확인하십시오. 장착되고 밀봉된 커버슬립을 섭씨 37도로 예열된 현미경 스테이지에 놓습니다. 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 타임 랩스 이미지 시퀀스, 청색 형광 단백질 이미지 및 DIC 이미지를 캡처합니다.

함께 제공된 문서에 설명된 대로 미세소관 역학 및 공동 국소화를 분석합니다. 세포 이동 분석을 수행하려면 전기천공법(electroporation) 단계 후 80마이크로리터의 완전한 내피 기저 배지를 추가하여 형질주입된 세포를 구합니다. 그런 다음 전체 80마이크로리터 샘플을 건조된 피브로넥틴으로 코팅된 커버슬립 중앙에 한 방울 떨어뜨려 피펫으로 만듭니다.

방울을 퍼뜨리지 마십시오. 80마이크로리터 방울이 커버슬립과 접촉했을 때 분리되는 것을 방지하기 위해 커버슬립을 건조하는 것이 필요합니다. 이 접근 방식을 사용하면 HUVEC가 커버슬립의 작은 영역 내에 집중될 수 있으므로 세포의 합류 단층의 빠른 형성을 촉진

섭씨 37도에서 3-4시간 동안 커버슬립을 배양하여 세포가 합류 단층으로 부착될 시간을 허용합니다. 그런 다음 완전한 내피 기저 배지에서 슬라이드를 두 번 헹구어 부착되지 않은 세포를 제거합니다. HUVEC 단층부에 감긴 가장자리를 만들려면 집게를 사용하여 커버슬립을 제자리에 부드럽게 잡고 면도날을 셀 단층의 중앙을 가로질러 단단히 드래그합니다.

세포가 섭씨 37도의 인큐베이터에서 3시간 동안 회복될 때까지 기다립니다. 그런 다음 이전과 같이 이미징을 위해 커버슬립을 조립하고 장착합니다. 10X 0.45 numerical aperture phase objective와 0.52 numerical aperture long working distance condenser를 사용하여 12시간 동안 10분 간격으로 위상차 이미지를 획득할 수 있습니다.

이미지 수집 소프트웨어 프로그램의 ND 수집 패널을 사용합니다. 마지막으로, 함께 제공된 문서에 설명된 대로 HUVEC 분기 및 마이그레이션을 정량화합니다. 미세소관 말단 결합 단백질인 mApple-labeled-EB3를 발현하기 위해 HUVEC를 transfection하고 타임 랩스 이미지를 캡처했습니다.

EB3의 원시 이미지는 왼쪽에 표시됩니다. plusTipTracker 소프트웨어로 추적되는 파란색 EB3 혜성은 오른쪽에 표시됩니다. 각 프레임 내에서 감지된 혜성은 다음과 같이 EB3 트랙과 시각적 EB3 트랙 오버레이를 생성하기 위해 프레임 간 위치 변화를 기반으로 연결되었습니다.

느리고 수명이 짧은 미세소관 성장은 빨간색, 느리고 수명이 긴 미세소관 성장은 녹색, 빠르고 수명이 짧은 미세소관 성장은 노란색, 빠르고 수명이 긴 미세소관 성장은 파란색으로 표시됩니다. 내피 세포 분지를 분석하기 위해 개별 HUVEC의 DIC 및 형광 이미지를 60배 배율로 캡처했습니다. 경계는 형광 이미지에서 세포 가장자리 주위에 손으로 그어졌습니다.

그런 다음 가지 원점은 가지를 가로 질러 직선을 그리고 가지의 양쪽에서 가장 큰 곡률 각도를 통해 정의되었습니다. 너비보다 길고 길이가 최소 10미크론인 가지를 세고 가지 원점에서 가지의 원위 끝까지의 길이를 측정했습니다. 내피 세포 상처 가장자리 이동을 평가하기 위해 HUVEC을 고밀도로 배양하고 이 비디오에 설명된 대로 상처 후 살아있는 세포 타임 랩스 이미징을 수행했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 상처 가장자리 내피 세포는 상처 부위로 방향으로 이동했습니다. 이 이동은 이동 속도, 지속성 및 거리를 추적하기 위한 신탁 마커로 nucleolus를 사용하여 분석되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 형상 및 세포골격 역학 이미징 실험 또는 상처 가장자리 세포 이동 연구를 위해 HUVEC을 배양, transfection 및 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차에 따라 폴리아크릴아미드 또는 콜라겐 접합과 같은 다른 방법을 수행하여 변형된 ECM의 세포 관여와 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.