Name: Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri l'imaging time-lapse ad alta risoluzione e l'analisi automatizzata della dinamica dei microtubuli in cellule endoteliali venose ombelicali umane (HUVEC). Questo metodo permette di studiare la motilità cellulare e il comportamento del citoscheletro in vivo.

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Un ringraziamento particolare al Dr. Chiara M. Waterman per tutoraggio e le discussioni, Michelle Baird e Mike Davidson per fornire molti dei costrutti cDNA fluorescenti utilizzati in questi studi, e Kathryn Applegate e Gaudenz Danuser per lo sviluppo di software per l&#39;analisi plusTipTracker MT. Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da una sovvenzione di KAM dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) e il National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Utilizzando HUVECs nella morfologia e migrazione esperimenti. live-cell imaging di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato all&#39;interno HUVECs richiede condizioni di coltura delle cellule appropriate e riproducibili, al fine di misurare e valutare i cambiamenti nella crescita MT e HUVEC morfologia, tali da poter poi essere assegnati a uno spunto di segnalazione ECM. HUVECs rappresentano un ottimo modello per studiare la forma delle cellule e la motilità. Essi sono altamente suscettibili di trasfezione con cDNA fluorescenza marcata, essi mostrano morfologie drammatiche in risposta ad entrambi i segnali di segnalazione solubili e fisiche, e mantengono la capacità di organizzarsi in tubi vascolari quando fornito appropriate condizioni di coltura delle cellule 65-70. colture cellulari primarie, come HUVECs, richiedono attenta gestione e il monitoraggio del numero di passaggio di cellule al fine di garantire le cellule sono in buona salute e che si comporteranno normalmente durante la sperimentazione. Ad esempio, quando condurre esperimenti che indagano sul cytoskeleton e / o morfologia delle cellule, HUVECs non devono essere utilizzati per gli esperimenti oltre il decimo passaggio coltura cellulare, come HUVECs tipicamente iniziano a visualizzare morfologie non uniformi in tutto il passaggio dodici a quindici. densità delle cellule è anche un regolatore di salute critiche HUVEC e la proliferazione. HUVEC indagini ramificazione (vedi protocollo 10,1-10,4, sopra) utilizzano colture relativamente bassa densità cellulare in modo da fornire le cellule spazio fisico di interagire con l&#39;ECM ed estendere sporgenze ramificate. Al contrario, negli studi di migrazione ferita-edge (vedi protocollo 10,5-10,8), HUVECs sono cultura in un monostrato prima di ferimento. Come tale, HUVECs ferita-bordo mostrano una morfologia relativamente non-ramificato, estendere leader sporgenze bordo, ed esibire interazioni cellula-cellula con i loro vicini immediati quando migrano nella ferita. Avvertimenti e vantaggi di monitoraggio MT Dynamics in Living HUVECs. Spinning microscopia disco è un ottimo approccio perverificare ipotesi sperimentali che richiedono chiarezza di immagine confocale ad alta risoluzione temporale. Con il modulo telecamera e laser caso, questo approccio la microscopia è sensibile alle basse emissioni e di fluorescenza può aiutare a ridurre photobleaching rispetto ad altri tipi di microscopia a fluorescenza. È importante sottolineare che questo approccio è anche adatto per moderata a imaging ad alta risoluzione temporale come è richiesto per generare misurazioni complete della dinamica di crescita MT utilizzando l&#39;approccio di etichettatura EB3, in una varietà di tipi cellulari. Mentre la metodologia EB3 di etichettatura crescente MT plus-estremità presenta evidenti vantaggi rispetto ad altri metodi di etichettatura fluorescente MT, ha anche degli svantaggi unici. Ad esempio, vi è una percentuale della matrice MT che non cresce attivamente in un dato momento, comprendente sia la popolazione di MTS smontaggio e la popolazione di stabili, MTS non dinamici 71-74. EB3 non etichettare queste due popolazioni di MTS equindi il contributo di queste due popolazioni non sarebbe incluso nell&#39;analisi dei dati sperimentali. metodologie alternative per la valutazione l&#39;intero array MT si sono concentrati sulla espressione di tubulina fluorescenza marcata, che incorpora in tutte le popolazioni di MTS e consente l&#39;identificazione di crescere, restringimento e stabile MTS. Tuttavia, a causa della relativamente alta densità della matrice MT vicino al centro della cella e adiacente al microtubulo organizzare centrale (MTOC), etichettare l&#39;intero array MT crea uno svantaggio per eseguire l&#39;analisi di immagine di estremità MT che non sono vicino alla cella periferia 75-77. Gli esperimenti che utilizzano due colori di co-etichettatura di MTS con tubulina fluorescenti e EB3 fluorescente in cellule vive hanno rivelato, qualitativamente, che la stragrande maggioranza di MTS tubulina marcato sono anche EB3 marcato 78. Inoltre, non vi è stato un metodo efficiente di inseguimento automatico di MTS etichettati con tubulina fluorescente. Ciò significa che i dati Raccoltezione e le misure di dinamica MT in cellule che esprimono tubulina fluorescenti richiedono monitoraggio mano di singoli MT, un processo che è soggetto a errori e noioso. Di conseguenza, l&#39;analisi automatizzata computazionale di Eb3 marcato MTS è diventato il metodo preferito per la misura dinamica MT quanto può essere applicato a MT dinamica esperimenti in numerosi tipi di cellule e all&#39;interno di una varietà di regimi sperimentali 35,79. Collegamento MT dinamiche di crescita di HUVEC Morfologia e migrazione. Dal punto di vista di un investigatore del citoscheletro, un adattamento estremamente utile del plusTipTracker automatizzato di analisi di monitoraggio è la capacità di misurare e valutare entrambe le alterazioni cellulari e regionali interi nelle dinamiche di crescita MT. Il requisito per una cella di diventare polarizzata è un pre-requisito essenziale per la migrazione delle cellule direzionale. Come tale, stecche di segnalazione polarizzati sono da tempo noti come fattori di guida fondamentali per la migrazione delle cellule direzionale 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Ad esempio, molecole di segnalazione solubili, come il VEGF induce polimerizzazione e la crescita MT verso lo spunto VEGF in tipi di cellule endoteliali 2,82-87. Inoltre, in risposta alle interazioni fisiche con l&#39;ECM (per esempio, il rispetto e la dimensionalità mechanosensing), HUVECs modulano le loro dinamiche MT dal livello locale regolando Maps per promuovere la crescita MT all&#39;interno allungamento sporgenze ramificati, e questo serve a guidare la migrazione HUVEC nella direzione della spunto 5,31,88. Così, la polarizzazione in risposta a segnali di segnalazione extracellulari mette in evidenza la necessità di una valutazione sperimentale delle variazioni localizzate nelle dinamiche del citoscheletro. live-cell imaging simultaneo della dinamica MT crescita (utilizzando l&#39;approccio EB3) e la migrazione delle cellule HUVEC è estremamente difficile da eseguire a causa MT crescono su una scala temporale di secondi, mentre le variazioni nella morfologia cellulare e la migrazione direzionale si verificano su una scala temporale di ore. Eppure entrambi i processi sono intimamente linked. Inoltre, continua, rapida imaging EB3 fluorescenza marcata sulla seconda scala temporale conduce photobleaching del segnale EB3. Tentativi di superare questo problema conducendo breve serie di immagini di EB3 (serie acquisizione 1-2 min) ogni 30 minuti hanno avuto successo, ma potrebbe essere realizzato solo in un piccolo numero di cellule endoteliali che aveva l&#39;espressione ottimale di EB3 e che non visualizzava negativo effetti alle illuminazione laser ripetuto 5. Un approccio alternativo che permette di interpretazioni di come le dinamiche di crescita MT contribuiscono ai cambiamenti nella morfologia cellulare e la migrazione è la Regione plusTipTracker di interesse (ROI) strumento 35 (vedi protocollo 6.6). Questa metodologia permette di tutta la crescita delle cellule MT tracce per essere suddivisa in regioni definite dall&#39;utente, da cui le tracce di crescita MT possono essere estratti e analizzati. Ad esempio, i confronti di &quot;ramificata&quot; contro &quot;non ramificati&quot; regioni della cellula hanno rivelato che MT crescono più sumile e più persistente all&#39;interno delle regioni ramificati rispetto alla non-ramificato periferia cellulare 5. In polarizzata ferita-edge HUVECs, confronti dei principali bordo e finali dinamiche di crescita bordo MT rivelato che MCAK indotta MT smontaggio è inibita in particolare all&#39;interno del bordo d&#39;attacco, ma non il bordo d&#39;uscita. la valutazione regionale di iniziali e finali dinamiche di crescita bordo MT in HUVECs esprimono Rac1 e / o mutanti di fosforilazione di MCAK inoltre rivelato che l&#39;attivazione Rac1-indotta di Aurora-A-chinasi specifica e localmente inibisce l&#39;attività MCAK all&#39;interno del bordo d&#39;attacco di guidare HUVEC polarizzazione e la migrazione direzionale 31. Pertanto, la combinazione di automatizzato di monitoraggio delle dinamiche di crescita MT e la valutazione regionale della dinamica di crescita MT all&#39;interno delle sporgenze ramificati e / o il bordo della ferita-edge HUVECs ci ha permesso di collegare dinamiche di crescita MT a HUVEC morfologia e la migrazione. I protocolli descritti sono designed per fornire una metodologia di solito, semplice e altamente ripetibile per la cultura HUVEC e indagine sperimentale. Tuttavia, molti dei dettagli del protocollo sono complesse e richiedono tempo, che, a sua volta, fornisce possibilità di errori o difficoltà nella conduzione della metodologia sperimentale. Mentre si è cercato di affrontare i problemi potenziali in tutto il protocollo, qui viene fornito ulteriori, la risoluzione dei problemi dettagliata dei potenziali problemi che sono meno comuni o in altro modo abbreviato come note all&#39;interno dei protocolli di metodologia. Relativi a lamelle di rivestimento con i substrati di poliacrilammide (protocollo 2.2), un problema comune che si pone è la natura complessa di attivare vetrino, accoppiando poliacrilammide al vetro, attivando poliacrilammide, e quindi l&#39;accoppiamento ECM alla poliacrilammide. Uno particolarmente difficile e potenzialmente problematico passo è la coltura HUVECs sul gel fibronectina / poliacrilammide in seguito all&#39;esposizione del Polyacoprioggetto crylamide rivestite a 2 mm solfo-SANPAH (step 2.2.2.6, sopra). E &#39;fondamentale per il successo della coltura HUVECs su questi substrati che solfo-SANPAH essere completamente rimosso dal sistema sperimentale seguente ECM coniugazione. Questo può essere meglio raggiunto mediante lavaggio con DDH 2 O e incubando i coprioggetti in DDH 2 O su un agitatore durante la notte. Se le cellule in coltura sulle ECM poliacrilammide non sopravvivono, o se la vitalità è inferiore al previsto, è aumentata e ha ripetuto il lavaggio di solfo-SANPAH dopo coniugazione di fibronectina (passo 2.2.2.9) si raccomanda di potenzialmente alleviare questo problema. Correlate al protocollo 3 (cDNA trasfezione e cultura HUVEC su un vetrino), una grande influenza per il successo della procedura di elettroporazione è la gestione delle HUVEC sia durante tripsinizzazione delle cellule per rimuoverli dal recipiente di plastica, e dopo la conclusione di l&#39;elettroporazione (passi 3.3-3.4, sopra). E &#39;fondamentale per la curapienamente monitorare il HUVECs mentre in tripsina, e non superare il tempo necessario per le celle a &quot;round-up&quot; sulla superficie del pallone (tipicamente 1-2 min). tempo eccessivo in tripsina è una delle principali cause di HUVEC morte, che non è in genere realizzato fino a quando le cellule sono placcati su vetrini fibronectina rivestite (punto 3.4) e quindi non riescono a collegare al substrato. Altrettanto importante, HUVECs (e la maggior parte dei tipi di cellule primarie) non se la passano bene quando sospeso per lunghi tempi nel buffer elettroporazione. Durante gli esperimenti larga scala, per esempio, in cui l&#39;utente ha cinque o più condizioni che richiedono elettroporazione, è meglio mantenere le cellule pellet in singoli tubi (1 tubo per trasfezione) e mescolarli, one-at-a-time , nel buffer elettroporazione immediatamente prima elettroporazione. Questo approccio riduce al minimo il tempo di incubazione in tampone elettroporazione e massimizzare la sopravvivenza HUVEC. Inoltre, il salvataggio immediato in terreni di coltura completo è anche critical dopo l&#39;elettroporazione. ritardi di salvataggio di un minuto o più dopo l&#39;elettroporazione può provocare vicino alla morte completa HUVEC e, quindi, dovrebbe essere evitato. Correlate assay migrazione cellulare (protocollo 9), la tecnica di coltura HUVECs ad altissima densità dipende da una modifica critica (descritto nel passaggio 9.2) della metodologia coltura cellulare tradizionale HUVEC (descritto nel protocollo 3) che richiede essiccazione della rivestito fibronectina coprioggetto al fine di consentire la cultura HUVEC in un&#39;area molto piccola del coprioggetto. Spesso, se il vetrino non è completamente asciugato o se la prima rivestimento del vetrino con fibronectina (i punti 2.1 o 2.2) non era efficiente, le cellule multimediali contenenti che è posto sul vetrino perderà la sua tensione superficiale ed espandere la bordi del vetrino, riducendo la densità delle cellule sul vetrino. Un metodo per risolvere questo potenziale problema è quello di aspirare il contenuto del vetrino e poiposizionare il coprioggetto (ancora nel suo piatto 35 mm) nella parte posteriore del cabinet biosicurezza per 5-10 min. Questo adattamento può aiutare a permettere il flusso d&#39;aria all&#39;interno dell&#39;armadio per assistere essiccazione del piatto. Se qualsiasi liquido visibile rimane sul vetrino dopo l&#39;asciugatura all&#39;aria, aspirare le macchie di liquido e di nuovo lasciare asciugare all&#39;aria per 5-10 minuti supplementari nell&#39;armadio biosicurezza. È importante notare che non vi è alcun modo per evitare completamente questo potenziale problema, ma non diventa un problema minore con pratica ripetuta del protocollo. E &#39;anche una raccomandazione guasti che quando si prepara lamelle per il saggio migrazione cellulare (o qualsiasi test, in generale), per preparare coprioggetto supplementari e hanno HUVECs supplementari ready-to-go in caso di problemi lungo la strada. Con queste considerazioni la risoluzione dei problemi in mente, è anche importante sottolineare l&#39;utilità dei protocolli discussi e le loro implicazioni in futuro la ricerca biologia cellulare. L&#39;applicabilità alla polyacrapproccio ylamide è ampia, e comprende non solo gli studi bidimensionali di impegno cellula-ECM (sopra descritta), ma anche le indagini tridimensionali 5. Questa applicazione è fondamentale per aumentare la nostra comprensione di come HUVECs regolano la forma delle cellule e la migrazione in ambienti fisiologici e dovrebbe fornire gli investigatori una conoscenza di base di come i cambiamenti morfologici sono coordinati con i cambiamenti del citoscheletro. Mentre i protocolli descritti qui si concentrano su misure della dinamica di crescita MT, la maggior parte dei protocolli può e deve essere adattato a misurare qualsiasi numero di altri aspetti microscopicamente misurabili di interazioni cellula-ECM. Per quanto riguarda la dinamica MT, ci sono numerose mappe, di cui almeno 14 famiglie di kinesins 89, ciascuno con un ruolo potenziale nel contribuire alla HUVEC polarità e la migrazione diretta, e ognuno dei quali può essere studiati utilizzando i protocolli presentati. Future indagini dovrebbe unLSO essere mirati al coinvolgimento cellula-ECM in normale contro gli stati malati. protocolli HUVEC qui presentati sono applicabili alle indagini delle normali processi omeostatici vascolari, nonché di stati patologici, tra cui le malattie cardiache, la retinopatia, la crescita del tumore e metastasi, per citarne alcuni. Coniugando visibilmente trasparenti ECM e poliacrilammide substrati di conformità suscettibili di studi microscopici permetterà cellula-ECM studi impegno tale che l&#39;angiogenesi vascolare endoteliale può essere monitorato con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questi tipi di approcci sperimentali hanno già cominciato a rivelare importanti differenze di forma delle cellule endoteliali, la polarità, la migrazione e gli effetti delle proteine ​​che regolano questi processi 5,31,90. Gli sforzi futuri devono mirare ad identificare come la combinazione di conformità ECM e dimensionalità mechanosensing può servire a livello locale proteine ​​di controllo che prendono di mira e regolano la dinamica del citoscheletro.

L&#39;angiogenesi è innescata da segnali extracellulari di segnalazione che promuovono le cellule endoteliali (ECS) di polarizzare, migrare con la specificità direzionale, e formare nuovi vasi nei tessuti che richiedono apporto di sangue. fattori che contribuiscono pensato di guidare angiogenesi sono segnali dalla matrice extracellulare (ECM). In risposta a stimoli fisici, EC estendere nuove filiali con specificità direzionale per guidare movimento direzionale nella formazione del 1,2 rete vascolare. L&#39;architettura della morfologia CE e la ramificazione è definita dal regolamento localizzata del citoscheletro microtubuli (MT) in un modo che è coordinata con la regolazione del acto-miosina contrattilità 3. Al fine di rami CE per formare, miosina-II deve essere localmente downregulated, con conseguente sporgenze membrana localizzate 4. Allo stesso tempo e nella stessa posizione all&#39;interno della cellula, dinamiche di crescita MT diventano modificati con conseguente crescita lenta e persistente MT promuovere ramo Elongazione e stabilità 5. Questo regolamento del citoscheletro coordinata permette EC di polarizzare la loro morfologia per facilitare la migrazione direzionale. Lo sviluppo di una morfologia cellulare polarizzata richiede il montaggio polarizzata MT 6. In migrazione delle cellule epiteliali, MT crescono lentamente e persistentemente specificamente al bordo anteriore della cella 7-9; mentre nei neuroni, l&#39;apertura e l&#39;allungamento degli assoni o dendriti richiede che MT non solo sono presenti, ma che sono dinamicamente sottoposti ai processi di montaggio e smontaggio 10-15. In questo modo, il controllo localizzata di dinamiche di crescita MT determina l&#39;architettura della cellula e permette una rapida rimodellamento della morfologia cellulare ECS navigare attraverso il loro ECM. dinamiche di crescita MT sono regolati da famiglie di proteine ​​motrici molecolari e proteine ​​non motori, chiamati microtubuli proteine ​​associate o microtubuli proteine ​​interagenti (d&#39;ora in poi refeRred come MAP). Le mappe possono essere localmente attivato o inattivato, in genere attraverso la segnalazione cascate avviate a livello di interfaccia cellula-ECM 16,17. Una volta attiva la funzione, mappe legandosi al MT e alterare la cinetica della MT montaggio e smontaggio; funzionante in tal modo di regolare a livello locale dinamiche MT al fine di promuovere la forma delle cellule e la polarità 18-20. Mitotico Centromere Associated Kinesin (MCAK) è un Kinesin-13 MAP famiglia che si lega a fini MT e coppie idrolisi dell&#39;ATP per MT smontaggio 21-23. Questo ruolo funzionale MCAK si caratterizza per essere critici ai mitotico mandrino 24-28, così come durante l&#39;interfase 29,30. All&#39;interno interphase EC, MCAK mediata smontaggio MT è regolata da localizzato Aurora-A fosforilazione indotta MCAK in risposta a ferita-bordo di attivazione indotta della piccola GTPasi Rac1. Il risultato di questa cascata di segnalazione è l&#39;inibizione della MCAK all&#39;avanguardia di EC, con conseguente crescita MT polarizzata verso leading bordo e MCAK indotta MT smontaggio a bordo di uscita della migrazione EC 31. metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita MT sono tipicamente utilizzati monitoraggio mano di uno tubulina fluorescenza marcata o, più recentemente, fluorescenza marcata MT Fine binding protein 1 o 3 (EB1 o EB3, rispettivamente). L&#39;approccio tubulina fluorescente ha il vantaggio di etichettatura dell&#39;intero array MT. Tuttavia, poiché la maggior parte dei tipi di cellule mitotiche mantenere un allineamento radiale di MTS durante l&#39;interfase 8,32,33, MTs vicino centrosoma sono molto denso, e come risultato, il monitoraggio della crescita MT e smontaggio con la tubulina fluorescente è generalmente limitata alla periferica regioni della cellula. A causa di queste limitazioni, l&#39;utilizzo delle proteine ​​EB fluorescenza marcata (EB1 o Eb3) è stato l&#39;approccio più comune per misurare la dinamica MT. Perché EBs etichetta solo le crescenti più-end di MTS, appaiono come piccole (1-3 micron), fluorescenza brillante venirets, fornendo così un marcatore facilmente distinguibile di MT polimerizzazione con sfondo molto limitata fluorescenza di 34-37. Mentre il fatto che EBs etichetta solo un sottoinsieme della matrice MT rappresenta un importante forza dell&#39;approccio EB, evidenzia anche una limitazione importante, che MTs non-maturazione non sono etichettati dall&#39;approccio EB3. Tuttavia, la capacità di misurare e monitorare le comete Eb3 nel corso del tempo e di visualizzare la crescita MT nelle regioni sub-cellulari rendono questo approccio ideale per applicazioni che richiedono la valutazione regionale di organizzazione MT. Un altro limite critico delle metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita mt è stata molto grandi insiemi di dati e il tempo necessario per l&#39;analisi dei dati. Questa limitazione deriva dalla necessità di monitoraggio mano di centinaia di comete EB ad elevata risoluzione temporale. Inoltre, queste misurazioni devono essere fatte in un numero statisticamente significativo di cellule e anche effettuato sotto una varietà di controllo e experimecondizioni ntale. Recentemente, questi vincoli sono state superate attraverso tecniche di analisi computazionale specificamente dirette a comete monitoraggio Eb3 usando la microscopia time-lapse in cellule viventi 35. Se usato in modo appropriato, questo approccio computazionale serve sia per limitare il potenziale di errore umano associato mano-tracking, oltre a fornire un metodo ad elevata capacità di misurare MT polimerizzazione. Analisi computazionale della dinamica MT che utilizzano il pacchetto software MatLab-based, plusTipTracker, consente la misurazione della crescita MT di monitoraggio comete Eb3 fluorescenza marcata 5,31,35,38. Inoltre, il software plusTipTracker permette per i calcoli di eventi catastrofali MT (aka smontaggio) basati sulla scomparsa di comete Eb3 all&#39;interno di un brano MT in crescita, e consente l&#39;analisi sub-cellulare (aka regionale) di dinamiche di crescita MT nelle regioni definite dall&#39;utente di interesse . Per i nostri studi, la dinamica di crescita MT sono stati confrontati all&#39;internoregioni ramificati rispetto a regioni non ramificati, o entro leader contro bordi d&#39;uscita delle celle. Uscita dati da software plusTipTracker può anche essere usato per generare codice colore overlay binario per le singole celle e regioni sub-cellulari. Qui si descrive la metodologia utilizzata per studiare il ruolo di MCAK nella modulazione dinamiche di crescita MT e il contributo di questo MT depolymerase alla regolazione della CE ramificazione morfologia e la migrazione direzionale. Il nostro approccio utilizzato una linea primaria cellule umane, cellule endoteliali ombelicale Vena umana (HUVEC), che sono facilmente colto e altamente suscettibili di elettroporazione indotta, trasfezione transiente di plasmide cDNA. Abbiamo poi utilizzato ad alta risoluzione, time-lapse microscopia a fluorescenza di HUVECs trasfettate con MT Fine binding protein 3 (EB3) e Mitotic centromero Associated Kinesin (MCAK) cDNA SPECIFICI costruisce per valutare gli effetti sulle dinamiche MT transfettate HUVECs. analisi delle immagini computazionale PlusTipTracker a base di EB3MT -labeled più estremi è stato quello di misurare la velocità di crescita MT e vite di crescita MT in time-lapse immagini, per misurare e confrontare gli effetti delle manipolazioni sperimentali su dinamiche di crescita MT. Questa metodologia consente lo studio della dinamica MT e l&#39;identificazione di come regolazione localizzata della dinamica MT nelle regioni subcellulari contribuisce ai processi angiogenici di CE ramificazione e migrazione. Queste tecniche sono applicabili alle indagini di qualsiasi mappa che può essere fluorescente ed espressi in cellule vive.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inibitore I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione 2% Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-amminopropiltrimetilossisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm modulo combinatore laser MLC400 ad alta potenza</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; microsfere di immunoprecipitazione IgG di topo</td><td>Reagenti TrueBlot; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; perle di immunoprecipitazione IgG di coniglio</td><td>Reagenti TrueBlot; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, filtro di emissione DAPI-ET</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Filtro di emissione</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Filtro di emissione</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Filtro di emissione</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700 / 75m</td><td></td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica bovina V</td><td>RPI Prodotti</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera per dispositivo ad accoppiamento di carica raffreddato Clara</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 asino anti-coniglio</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 capra anti-ratto</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Fornitura & Fattori di crescita (contenuti mostrati di seguito)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estratto di cervello bovino 2,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina (10.000 UI Pen/ml, 10.000 &#181; g Streptococco/ml)&nbsp; 10,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Otturatore elettronico</td><td>Strumento Sutter</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Inibitore della proteasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP capra anti-topo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP capra anti-coniglio</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrana</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesio solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tavolino motorizzato</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-tubulina (DM1A)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>3873S</td> Smalto per unghie <td></td></tr><tr><td>Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Scienze 72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contiene il tampone di elettroporazione</td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 UI Pen/ml, 10.000 &#181; g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Tubi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti&ndash; pT288&ndash; Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Ratto anti&ndash; &alfa;-tubulina</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Disco rotante&nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

ad alta risoluzione time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli dynamics in living ombelicale umano cellule endoteliali vena

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Il processo fisiologico attraverso il quale si forma una nuova vascolarizzazione da una vascolarizzazione esistente richiede eventi di segnalazione specifici che innescano cambiamenti morfologici all'interno delle singole cellule endoteliali (CE). Questi processi sono fondamentali per il mantenimento omeostatico, come la guarigione delle ferite, e sono anche cruciali nel promuovere la crescita e le metastasi del tumore. La morfologia EC è definita dall'organizzazione del citoscheletro, un sistema strettamente regolato di dinamica dell'actina e dei microtubuli (MT) che è noto per controllare la ramificazione EC, la polarità e la migrazione direzionale, componenti essenziali dell'angiogenesi. Per studiare la dinamica della MT, abbiamo utilizzato la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione abbinata all'analisi computazionale dell'immagine dei plus-end MT marcati in fluorescenza per studiare le dinamiche di crescita della MT e la regolazione della morfologia delle ramificazioni EC e della migrazione direzionale. L'imaging time-lapse di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) viventi è stato eseguito dopo trasfezione con la proteina 3 legante l'estremità MT (EB3) marcata in fluorescenza e costrutti di cDNA specifici per la chinesina associata al centromero mitotico (MCAK) per valutare gli effetti sulla dinamica MT. Il software PlusTipTracker è stato utilizzato per tracciare le estremità positive MT marcate EB3 al fine di misurare la velocità di crescita MT e la durata della crescita MT in immagini time-lapse. Questa metodologia consente lo studio della dinamica della MT e l'identificazione di come la regolazione localizzata della dinamica della MT all'interno delle regioni subcellulari contribuisca ai processi angiogenici di ramificazione e migrazione delle EC.

cultura HUVEC per microscopia live-cell Live-cell imaging di HUVEC esprimono proteine ​​fluorescenti richiede che HUVEC sono mantenuti in un ambiente che è adatto per la normale crescita cellulare e la manutenzione, nonché espressione della proteina normale e funzione. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per preparare una tamponata e sistema chiuso che mantiene ottimizzato caratteristiche ottiche per la raccolta di immagini time-lapse di cellule vive. Sottili strisce di nastro biadesivo sono posti su un vetrino (Figura 1A) e poi il vetrino contenente la coltura HUVECs è invertita sopra del nastro in modo tale che le cellule siano rivolti vetrino (Figura 1B). In questo modo, il nastro fornisce un piccolo spazio tra le due superfici di vetro, e crea uno spazio in cui le cellule possono essere bagnati in appositi mezzi di coltura cellulare (Figura 1C; vedi protocollo 4, sopra). iona passo finale, il vetrino di vetro è sigillato al vetrino con una vaselina: paraffina: lanolina (1: 1: 1 miscela, VALAP; Figura 1D) per stabilire un sistema chiuso. Questo approccio coltura cellulare è stato utilizzato sia per imaging breve sequenza temporale di comete Eb3 e per la sequenza di tempo maggiore ramificazione e esperimenti di migrazione. Inoltre, la consistenza simile alla cera di VALAP consente una facile rimozione dal vetrino e coprioggetto alla fine di un sistema di imaging sperimentare tale che approcci supplementari inclusi fissazione e immunolabelling (vedi protocollo 8), può essere effettuata sullo stesso vetrino e campione cellulare che è stato visualizzato utilizzando l&#39;approccio live-cell imaging. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Figura 1:. Metodologia della cultura HUVEC per il live-cell immagini microscopiche (A) Tagliare 2 pezzi di nastro biadesivo in 0,65 cm x 2.50 cm strisce rettangolari e garantire un pezzo di nastro biadesivo orizzontalmente lungo il bordo superiore della diapositiva e l&#39;altro pezzo, lungo il bordo inferiore della diapositiva. È importante consentire una piccola quantità di spazio tra il nastro e il bordo scivolo per sigillare la camera come descritto in (D). (B) Utilizzando pinze rimuovere il vetrino contenente HUVECs e invertono il vetrino (lato della cella verso il basso) sulla parte superiore dei pezzi di nastro. (C) Usando una micropipetta, aggiungere 40 ml di mezzi di imaging (terreno completo basale endoteliale addizionato con 25 mM HEPES) tra il vetrino e il vetrino. Assicurarsi che lo spazio tra il vetrino e slitta è completamente riempito con i media di imaging e di evitare bolle. Utilizzare un aspiratore lungo il bordo del vetrino per rimuovere l&#39;eccesso supporto, se necessario. (D) Usare VALAP caldo (1: 1: 1 di vaselina: lanolina: paraffina) per sigillare intorno ai bordi del vetrino. Verificare la presenza di perdite di supporti di imagings spingendo intorno delicatamente sul vetrino. Utilizzare ulteriore VALAP per rimediare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> automatizzato di monitoraggio di EB3 fluorescenza marcata consente un&#39;analisi completa di tutto il cellulare e dinamiche di crescita MT regionali. La raccolta di immagini microscopiche chiare, distinte, e molto tempo e spazio risolta della proteina EB3 è essenziale per l&#39;analisi dei movimenti Eb3 all&#39;interno della cellula. HUVEC espressione di EB3 fluorescenza marcata varia ampiamente da cellula a cellula e l&#39;intensità di fluorescenza aumenta tipicamente all&#39;interno della stessa cella durante un periodo di ore. Pertanto, è importante considerare e monitorare questi cambiamenti nel profilo di espressione per identificare potenziali effetti di aumento di espressione EB sulle dinamiche di crescita MT. Questo è meglio raggiunto attraverso la valutazione a scala di grigi a fluorescenza intesitàprofili y per ogni cella ripreso e quindi limitando l&#39;analisi dei dati di quelle cellule che presentano un intervallo definito di profili di espressione in scala di grigi. Valutazione iniziale di set di dati profilo di espressione è critica e deve essere confrontato con MT dati dinamiche di crescita che si ottiene dal software plusTipTracker per ogni cella. profili di espressione possono essere rilevate in velocità di crescita MT e MT durata crescita per ogni cella all&#39;interno di un gruppo sperimentale, per determinare l&#39;intervallo desiderato di espressione scala di grigi e per identificare potenziali valori anomali. La figura 2 evidenzia una HUVEC coltivate su un substrato di fibronectina (vedi protocollo 2.1, sopra) e che esprimono nei pressi di livelli ottimali di EB3 Mapple marcato. Comete Eb3 fluorescenti sono mostrati in una serie temporale-lapse di immagini su un periodo di 12 sec (Figura 2A). Analisi delle comete Eb3 utilizzando il software plusTipTracker comporta un automatico, fotogramma per fotogramma EB3 cometa detection (punti verdi e gialli, Figura 2b). Le comete rilevati all&#39;interno di ciascun frame vengono quindi collegati, dipende dalla loro cambiamento di posizione da fotogramma a fotogramma, per generare tracce Eb3 e una sovrapposizione pista EB3 visivo (Figura 2C-F). sovrapposizioni pista sono codificati a colori e le distinzioni di colori possono essere determinati da parametri inseriti dall&#39;utente. Comunemente, queste distinzioni utilizzano la media globale della velocità di crescita MT e MT crescita durata 5,31 e quindi suddividere i dati in quattro gruppi: lenta e di breve durata (rosso), lento e longevi (giallo), veloce e breve vissuto (verde), e la crescita MT veloce e di lunga durata (blu; Figura 2G). monitoraggio PlusTipTracker-mediata di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato consente inoltre Regioni definite dall&#39;utente di interesse (ROI). PlusTipTracker estrae i dati della traccia crescita MT all&#39;interno della ROI definito dall&#39;utente (Figura 2A, B e F), consentendo in tal modo per il confronto di MT crescita dynamics all&#39;interno di diverse regioni della stessa cella. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Figura 2: rilevamento cometa EB3, il monitoraggio, e l&#39;uscita dei dati plusTipTracker (A) filmato time-lapse di un HUVEC esprimere Mapple EB3.. pannello di sinistra mostra una vista cellula intera e la maschera cellula intera (linea bianca) demarking i bordi delle celle. Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra mostrano time-lapse immagini in scala di grigi prime di comete Eb3 in cornici per immagini successive (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) la rilevazione plusTipTracker delle comete Eb3 dalle immagini mostrate in (A). pannello di sinistra mostra una vista di cella intera comete rilevati (punti gialli). Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra evidenziano cinque comete Eb3 rilevati (frecce rosse) e ripercorrono quei cinque comete nel periodo di imaging 12 sec. verde<html> puntini rappresentano rilevati comete Eb3 che non esistevano (o non sono stati rilevati) nel precedente intervallo di tempo. (C) di proiezione massima intensità di 61 frame (2 min film) delle comete Eb3 mostrati in (A). (D) plusTipTracker MT traccia overlay degli stessi 61 fotogrammi (2 min film) indicati in (C). (E) Zoom di proiezione massima intensità (box rosso in C). (F) Zoom di plusTipTracker MT traccia overlay di proiezione massima intensità (box rosso in D). Leggenda per le sovrapposizioni di pista mostrate in (D) e (F) (G) con codice colore. Designazione come lento, veloce, di breve durata o di lunga durata si basa sul valore medio per tutte le tracce di crescita misurati in un gruppo di dieci Mapple-Eb3 HUVECs che esprimono. Per facilitare la visualizzazione, sovrapposizioni di pista a (D) e (F) sono generati utilizzando intensità dei pixel invertiti dell&#39;immagine cellule mostrato in (A). Barre di scala = 20 micron./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. HUVEC ramificazione e modelli di migrazione sono sensibili al meccano-fisiche segnali dalla ECM. HUVECs sono ben noti a rispondere a vari tipi di segnali di segnalazione e, in tal modo, a subire alterazioni morfologiche che dettano una risposta cellulare adeguata al particolare spunto di segnalazione (s) 36,40-42. HUVECs coltivati ​​su substrati di vetro rivestito fibronectina (Figura 3a), o su rigide ECM poliacrilammide 2 dimensioni (55 kPa) tipicamente visualizzare un giro o morfologia allungata con poche sporgenze ramificate distinti (Figura 3B). Tuttavia, quando coltivate su molto morbidi ECM poliacrilammide 2-dimensionali (0,7 kPa), HUVECs visualizzare una morfologia molto ramificata che è noto per il risultato di conformità indotta verso il bassoregolazione della miosina-II contrattilità 4,5,31 (Figura 3C). Così, HUVECs regolano la loro morfologia cellulare attraverso ECM mechanosensing, e questo si realizza attraverso la modulazione localizzata di dinamiche MT e acto-miosina contrattilità. Poiché HUVECs visualizzare un&#39;ampia varietà di attributi morfologici, al fine di misurare HUVEC ramificazione è importante definire prima cosa una sporgenza ramificato è, quindi per definire come una sporgenza ramificato sarà misurato oggettivamente. Una tecnica utilizza un approccio in quattro fasi con cui un limite di cella o &quot;maschera&quot; viene generato a mano tracciando i bordi della cella utilizzando un&#39;immagine di una cellula che esprime un marcatore fluorescente del volume per definire i bordi delle celle (Figura 3D). Dopo generazione maschera, origini filiali sono definiti localizzando grande angolo di curvatura tra la protrusione ramificato e il corpo cellulare. Una linea è disegnata per Demark &quot;origine ramo&quot; (linee angolate viola; Figura 3E). Numero Branch è misurata semplicemente contando il numero di sportelli, con un ramo di origine definita (Figura 3F). Lunghezza Branch è misurata come la distanza dall&#39;origine ramo punta ramo distale (Figura 3G). Per evitare l&#39;inserimento di piccole proiezioni lamellipodial da analisi dei dati, criterio che si aggiunge richiede che i rami devono essere più lunghi ( &quot;lunghezza ramo&quot;) che larghi (presso l &#39; &quot;origine ramo&quot;), e che i rami devono essere almeno dieci micron di lunghezza 5 , 31. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Figura 3: Analisi di HUVEC ramificazione morfologia (A - C) esempi di immagini DIC di HUVECs coltivati ​​su rivestito fibronectina ECM di vetro (A) rigide (55 kPa) ECM poliacrilammide (B) e soft (0,7kPa) ECM poliacrilammide (C). Ramificazione è drammaticamente aumentato negli HUVECs coltivati ​​su 0,7 kPa ECM poliacrilammide (C) rispetto ai più rigidi ECM (A, B). (D). DIC immagine microscopica (immagine a sinistra) di un HUVEC trasfettate che esprimono un Mapple-C1 cDNA costruire (un marcatore volume cellulare; immagine a destra). (E) Definire l&#39;origine ramo individuando il massimo angolo di curvatura (cioè la posizione in cui la membrana visualizza la massima curvatura; linee color porpora) su entrambi i lati del ramo e quindi collegare gli angoli con una linea retta (linee blu) . (F) individuare e selezionare sporgenze ramificati che si estendono&gt; 10 micron dal &quot;origine ramo&quot; (definito in E). Contare il numero di sporgenze ramificati per ottenere il &quot;numero della filiale&quot;. (G) Misurare la distanza dal centro del &quot;origine ramo&quot; al most punto distale del ramo con lo strumento linea nella annotazioni e misurazioni applicazione di NIS elementi software per ottenere la &quot;lunghezza ramo.&quot; Barre di scala = 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Oltre al rispetto ECM sensing, HUVECs anche senso e rispondere all&#39;eliminazione dei contatti cellulari adiacenti indotta da zero ferimento. Nel saggio di migrazione, HUVECs coltivate in monostrato sono sottoposti ad una ferita zero e caratteristiche di migrazione sono misurati (vedi protocollo 9, sopra). Dopo l&#39;induzione della ferita grattando il monostrato, HUVECs ferita-bordo polarizzano sviluppando un bordo anteriore sporgente che si estende nella ferita (Figura 4A, t = 0 ore). Nel corso di un corso di tempo di 10-12 ore, polarizzati HUVECs ferita-edge migrano nella zona della ferita e riempire ilferita, stabilendo un nuovo monostrato confluente (Figura 4A, t = 11 ore). Come con HUVEC ramificazione, attuale evidenza suggerisce che la polarizzazione e la migrazione è critico dipende dalla coordinata riorganizzazione del citoscheletro di actina e MT 43-49. Questo risultato è ottenuto, in parte, attraverso l&#39;inibizione localizzata di MCAK indotta MT smontaggio all&#39;avanguardia, ma non al bordo posteriore della ferita bordo HUVECs 31. La sensibilità della dinamica MT per ferita indotta polarizzazione viene avviata dal Rac1 GTPasi, che si rivolge numerose proteine ​​regolatore a valle, tra cui Aurora-A-chinasi che fosforila e inibisce MCAK all&#39;avanguardia, e altre chinasi che sono in grado di inibire o attivando MAP localmente modulare la crescita MT e ritiro 18,31,36,48,50-53. Ampie prove sperimentali supporta la nozione che il coordinamento dei leader protrusione bordo di entrata e di uscita contrazione bordo è regolato attraverso cicli di attivazione di Rac1promuovere MT assemblaggio all&#39;avanguardia e l&#39;attivazione RhoA a acto-miosina contrattilità al bordo di uscita, in modo da guidare la motilità diretto 9,41,51,52,54-58. Ad oggi, non c&#39;è una metodologia stabilita per eseguire il monitoraggio automatico della migrazione cellulare. Questo è il risultato di difficoltà di analisi computazionalmente confini cellula-ECM che sono costantemente cambiando come cellule ferita punta polarizzano e migrano. Mentre molti programmi software sono in grado di tracciare cellule fluorescente 59-64, la popolazione di fluorescente HUVECs in esperimenti di migrazione ferita punta è circa il 30-40% della popolazione totale HUVEC, e quindi la maggior parte delle cellule ferita tagliente può essere visualizzati da contrasto di fase o l&#39;imaging DIC. Inoltre, è importante quando si misura la migrazione ferita bordo per valutare le cellule fluorescenti e non fluorescenti all&#39;interno della stessa ferita per individuare specificoeffetti di espressione crea sia all&#39;interno di gruppi di studio sperimentali e tra i gruppi di studio sperimentali. Attualmente, il metodo migliore per misurare la migrazione HUVEC è di utilizzare un approccio inseguimento mano in cui una cella ferita bordo è identificato e poi il nucleo e nucleolo sono identificati (Figura 4B). Il nucleolo viene usata come posizione determinante per il monitoraggio delle cellule causa della sua densità dispersione luce alta e relativamente piccole dimensioni. Queste due caratteristiche del nucleolo rendono più facile identificare e ridurre errori di misurazione limitando l&#39;area in cui l&#39;utente può inserire singole posizioni di traccia. tracce di migrazione HUVEC sono poi generati cliccando sul nucleolo in successive fotogrammi di immagini time-lapse. Infine, velocità di migrazione e distanza di migrazione all&#39;origine sono misurati ed analizzati per il controllo e gruppi di cellule sperimentali (Figura 4B). <img alt="Figura 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4: Analisi di HUVECs ferita-edge e il monitoraggio della migrazione immagini (A) 20X a contrasto di fase di un time-lapse serie di imaging 11 ore di zero ferita bordo HUVECs (alias &quot;Migration Assay&quot;).. La ferita e la direzione della migrazione sono indicati in pannello t = 0 hr. HUVEC sono presenti per attraversare la ferita bordo e avanzare nella ferita fino a formare un monostrato di cellule (t = 3,5 hr - t = 11 h). (B) Analisi del dosaggio migrazione dell&#39;imaging time lapse (come indicato in A) richiede innanzitutto l&#39;identificazione di un tracciabili HUVEC ferita bordo in base alla posizione delle cellule (cioè le cellule fisicamente ai margini della ferita) e profilo di espressione (i .e. , selezionare una cella bordo della ferita verde se l&#39;esperimento comporta espressione di GFP). Usando l&#39;immagine a contrasto di fase, identificare il nucleo e il nucleolo. Mano traccia nucleolo in time-lapse immagini successive utilizzando l&#39;unanotazioni e misurazioni applicazione nel software NIS elementi per determinare la velocità di migrazione e la distanza alla loro origine. Scala bar = 100 micron (A), 20 micron (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Protocolli per la coltura di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), la trasfezione transitoria di marcatori marcati in fluorescenza della crescita dei microtubuli, l'imaging di cellule vive e l'analisi automatizzata delle dinamiche di crescita dei microtubuli interfasici.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare cellule endoteliali provenienti dalla vena ombelicale umana e analizzare la dinamica del citoscheletro e la migrazione cellulare mediante imaging in tempo reale su cellule vive. I metodi descritti in questo video possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, molecolare e meccanobiologia. Ad esempio, questo protocollo può essere utilizzato per identificare come la forma cellulare e la motilità siano modulate dall'interazione con diverse matrici extracellulari (ECM).La dimostrazione visiva è fondamentale perché le fasi di preparazione del campione sono difficili da eseguire. Richiedono una manipolazione precisa delle cellule in tempi stretti durante tutto il processo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla motilità delle cellule endoteliali durante l'angiogenesi, può essere applicato anche a indagini microscopiche di praticamente qualsiasi sistema modello di cellule aderenti.Utilizzando pinzette, prelevare un coprioggetto da un barattolo contenente etanolo al 100% e passarlo attraverso la fiamma di un becco Bunsen per sterilizzarlo. Quindi posizionarlo in una piastra di Petri da 35 millimetri. Preparare un coprioggetto per ogni campione.In un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri, aggiungere 10 microlitri di soluzione madre di fibronectina a 1 milligrammo per millilitro e 990 microlitri di PBS. Quindi pipettare 250 microlitri della soluzione su ciascun coverslip. Distribuire uniformemente la soluzione per coprire l'intera superficie.Incubare le coprioggetti per un minimo di tre ore a 37 gradi Celsius. Prima dell'uso, risciacquare ogni coprioggetto tre volte con due millilitri di PBS. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di HUVECs coltivati e trasferire un volume contenente 100.000 cellule per coprioggetto per esperimenti non migratori, oppure 500.000 cellule per coprioggetto per esperimenti di migrazione, in una provetta per microcentrifuga.Centrifugare le cellule a 1.400 × g per quattro minuti per formare il pellet. Al termine della centrifugazione, per ogni condizione da testare, risospendere fino a un milione di cellule in 100 microlitri di buffer per elettroporazione e combinarle con un microgrammo di cDNA. Trasferire le cellule in una cuvetta per elettroporazione.Trasfettare le cellule e la miscela di DNA utilizzando il programma designato per l'elettroporazione di HUVEC. Successivamente, recuperare le cellule trasfettate aggiungendo 500 microlitri di mezzo basale endoteliale completo. Quindi, seminare il volume cellulare appropriato su coprivetri rivestiti con fibronectina.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore per consentire il tempo necessario all'espressione dei costrutti di cDNA. In preparazione all'acquisizione delle immagini, prendere due strisce di nastro adesivo doppio faccia di 2,5 centimetri per 0,65 centimetri e fissarle orizzontalmente lungo i bordi superiore e inferiore di un vetrino pulito. Si noti che è importante lasciare un piccolo spazio tra il nastro e il bordo del vetrino per sigillare la camera.Montare il coprioggetto con il lato delle cellule rivolto verso il basso in modo che i due bordi del coprioggetto poggino sul nastro. Utilizzare pinzette per premere delicatamente e fissare il coprioggetto. Con una micropipetta, aggiungere 40 microlitri di mezzo di imaging tra il coprioggetto e il vetrino. Assicurarsi che lo spazio tra la lamellina e il vetrino sia completamente riempito con il mezzo di imaging. Rimuovere con un fazzoletto di carta qualsiasi eccesso di mezzo, se necessario. Sigillare tutti i bordi del vetrino con VALAP caldo.Verificare la presenza di perdite premendo delicatamente sul coprivetrino di vetro. Posizionare il coprivetrino montato e sigillato su un palchetto del microscopio preriscaldato a 37 gradi Celsius. Utilizzando un microscopio confocale a disco rotante, acquisire sequenze di immagini in lapse temporale, immagini della proteina fluorescente blu e immagini DIC.Analizzare la dinamica dei microtubuli e la co-localizzazione come descritto nel documento allegato. Per eseguire un saggio di migrazione cellulare, dopo il passaggio di elettroporazione, recuperare le cellule trasfettate aggiungendo 80 microlitri di mezzo basale endoteliale completo. Quindi, pipettare l'intero campione di 80 microlitri come una singola goccia al centro di un coverslip rivestito con fibronectina essiccato.Non disperdere la goccia. È necessario asciugare il coprivetrino per evitare che la goccia di 80 microlitri si separi al contatto con il coprivetrino. Questo approccio consente di concentrare le HUVEC in una piccola area del coprivetrino, favorendo così la rapida formazione di un monolayer confluenziale di cellule.Incubare il coprioggetto a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore per consentire alle cellule di aderire e formare un monolayer confluenziale. Quindi risciacquare i vetrini due volte in mezzo basale endoteliale completo per rimuovere le cellule non attaccate. Per creare un bordo di ferita sul monolayer di HUVEC, utilizzare una pinzetta per trattenere delicatamente il coprioggetto in posizione e trascinare con fermezza una lametta da rasoio al centro del monolayer cellulare.Lasciare che le cellule si riprendano in un incubatore a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi assemblare e montare i coprioggetti per l'acquisizione di immagini come in precedenza. Acquisire immagini a contrasto di fase a intervalli di 10 minuti per 12 ore utilizzando un obiettivo a contrasto di fase da 10X con apertura numerica 0,45 e un condensatore con lunga distanza di lavoro e apertura numerica 0,52.Utilizzare il pannello ND Acquisition del programma software per l'acquisizione delle immagini. Infine, quantificare la ramificazione e la migrazione delle HUVEC come descritto nel documento allegato. Le HUVEC sono state trasfettate per esprimere EB3 marcato con mApple, una proteina legante le estremità dei microtubuli, e sono state acquisite immagini in time lapse.Le immagini grezze di EB3 sono mostrate a sinistra. Le comete blu di EB3 rilevate dal software plusTipTracker sono mostrate a destra. Le comete rilevate in ciascun fotogramma sono state collegate in base al loro cambiamento di posizione da un fotogramma all'altro per generare tracce di EB3 e una sovrapposizione visiva delle tracce di EB3, come mostrato qui. La crescita lenta e di breve durata dei microtubuli è mostrata in rosso, la crescita lenta e di lunga durata dei microtubuli è mostrata in verde, la crescita rapida e di breve durata dei microtubuli è mostrata in giallo, e la crescita rapida e di lunga durata dei microtubuli è mostrata in blu. Per analizzare la ramificazione delle cellule endoteliali, sono state acquisite un'immagine DIC e un'immagine fluorescente di un singolo HUVEC a un ingrandimento di 60 volte. È stato disegnato manualmente un contorno lungo il margine cellulare nell'immagine fluorescente.Le origini dei rami sono state quindi definite tracciando una linea retta attraverso il ramo e lungo l'angolo di massima curvatura su ciascun lato del ramo. Sono stati conteggiati i rami più lunghi che larghi e di lunghezza minima di 10 micrometri, misurando la lunghezza dal punto di origine del ramo fino all'estremità distale dello stesso. Per valutare la migrazione delle cellule endoteliali al bordo della ferita, le HUVECs sono state coltivate ad alta densità ed è stata eseguita un'acquisizione temporale di cellule vive dopo la creazione della ferita, come descritto in questo video.Come mostrato qui, le cellule endoteliali del bordo della ferita si sono spostate in modo direzionale all'interno della zona della ferita. Questo movimento &egrave; stato analizzato utilizzando il nucleolo come marcatore di riferimento per tracciare la velocit&agrave;, la persistenza e la distanza della migrazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare, trasfettare e preparare le HUVEC per esperimenti di imaging della forma cellulare e della dinamica del citoscheletro oppure per studi sulla migrazione delle cellule al bordo della ferita.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la poliacrilamide o la coniugazione del collagene per rispondere a ulteriori domande relative all'interazione cellulare con ECM modificati. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo protocollo video illustra l'isolamento e la coltura di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) da cordone ombelicale umano. Una volta isolato queste cellule possono essere utilizzati per test in vitro angiogenesi come il saggio Ottimizzato fibrina Gel Bead dimostrata anche dal laboratorio di Hughes.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC)

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l'input minimo da parte dell'utente e pregiudizi.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate fino alla confluenza all'interno di un dispositivo di rete microfluidica. Sono state illustrate le distribuzioni della giunzione delle cellule endoteliali e della F-actina e sono stati quantificati in tempo reale a livello di singola cellula le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio e della produzione di ossido nitrico in risposta all'adenosina trifosfato (ATP).

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

Per quantificare il flusso microvascolare dalle sequenze di immagini capillari ad alta velocità, abbiamo sviluppato il software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Nell'intero campo dell'immagine e nel tempo, STAFF valuta le velocità di flusso e genera una sequenza di mappe spaziali codificate a colori per la visualizzazione e l'output tabulare per le analisi quantitative.

Analisi spaziale temporale del flusso Fieldwise nella microvascolatura

Questo protocollo è dedicato alla visualizzazione plus-end dei microtubuli mediante trasfezione della proteina EB3 per studiarne le proprietà dinamiche in coltura cellulare primaria. Il protocollo è stato implementato su fibroblasti cutanei primari umani ottenuti da pazienti affetti da Malattia di Huntington.

Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani

L'attuale studio descrive un protocollo per monitorare i cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) durante l'infezione virale utilizzando un sistema di analisi cellulare in tempo reale (RTCA).

Monitoraggio dei cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana in seguito a infezione virale utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale basata sull'impedenza

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

Scopri l'imaging time-lapse ad alta risoluzione e l'analisi automatizzata della dinamica dei microtubuli in cellule endoteliali venose ombelicali umane (HUVEC). Questo metodo permette di studiare la motilità cellulare e il comportamento del citoscheletro in vivo.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena (Video) | JoVE Journal

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

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