쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 쥐 C1498 세포와 마우스에서 정맥 주사 후 유발되는 급성 백혈병을 특성화하는 것입니다. 이 절차의 주요 장점은 C1498 세포 주입 후 유발된 쥐 골수단핵구 백혈병이 인간 질병의 많은 특징을 나타낸다는 것입니다. 이 동물 모델은 백혈병 발병 및 면역 결핍을 유발하는 메커니즘이 무엇인지와 같은 혈액학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 동물 모델의 함의는 새로운 화학 물질 및 면역 투정제의 테스트를 용이하게 하기 때문에 백혈병 치료로 확장됩니다. 5-6주 된 암컷 선천성 C57 블랙 6 마우스를 멸균 층류 후드로 옮기는 것으로 시작합니다. 그런 다음 동물을 구속기에 넣으십시오.

다음으로, 100마이크로리터의 세포가 있는 29게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 로드합니다. 말단 끝의 꼬리를 잡고 70% 에탄올을 적신 거즈로 꼬리 피부를 소독합니다. 10에서 6번째 세포의 1배를 측면 꼬리 정맥에 천천히 주입합니다.

모든 세포가 전달되면 바늘을 제거하고 멸균 거즈로 주입하는 것을 보고 부드러운 압력을 가합니다. 그런 다음 다음 몇 주 동안 주의 깊게 모니터링하면서 동물을 우리로 되돌려 보냅니다. 17일에서 19일 후, 마취된 백혈병 동물의 눈의 내측 안각에 모세혈관을 삽입합니다.

100-200 마이크로리터의 혈액이 구동에서 모세혈관으로 빨려 들어갑니다. 튜브를 제거하고 멸균 거즈 스펀지를 눈에 부드럽게 펴 발라 출혈을 조절합니다. 그런 다음 혈액을 EDTA 튜브로 옮기고 단핵 세포가 분리될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관합니다.

혈액 단핵 세포를 분리하기 위해 먼저 1밀리몰 EDTA가 보충된 PBS를 최종 부피 500마이크로리터까지 추가합니다. 그런 다음 샘플을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 30게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 500마이크로리터의 분리 용액을 혈액 아래에 조심스럽게 겹쳐 놓고 층이 섞이지 않도록 주의하십시오.

원심분리로 세포를 분리하고 피펫을 사용하여 불투명한 흰색 단핵 세포층을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 PBS 1ml로 면역 세포를 씻어냅니다. 이들을 원심분리하고 펠릿을 600마이크로리터의 FACS 완충액에 다시 현탁시켜 염색 및 유세포 분석으로 분석합니다.

골수를 분리하기 위해 쥐를 플라스틱 판자 위에 등을 대고 놓고 동물의 팔다리를 고정합니다. 70% 에탄올로 동물을 소독하십시오. 그런 다음 관절 위의 대퇴골 상단에서 각 다리를 자르고 경골을 부드럽게 당겨 대퇴골에서 분리합니다.

집게와 가위를 사용하여 뼈에서 피부와 근육을 제거하고 뼈를 얼음 위의 페트리 접시에 옮깁니다. 가위를 사용하여 사지를 제거하십시오. 그런 다음 5ml의 차가운 PBS가 들어 있는 10ml 주사기에 부착된 26게이지 바늘을 한 번에 하나의 뼈 끝에 삽입하고 뼈 마로우를 접시에 씻어냅니다.

세포 현탁액을 바늘 끝으로 여러 번 통과시켜 골수 세포를 파괴합니다. 그런 다음 새로운 70미크론 필터를 통해 세포를 50ml 원추형 튜브로 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포를 원심분리하고 펠릿을 2mL의 용해 완충액에 다시 현탁시킵니다.

즉시 튜브에 최대 50ml의 차가운 PBS를 채우고 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 골수 펠릿을 10배에서 밀리리터당 6번째 세포로 차가운 FACS 완충액에 다시 현탁시킵니다. 먼저 염색을 위해 골수 세포를 준비하려면 미리 부착된 필터 카드가 있는 일회용 챔버에 슬라이드를 넣고 챔버를 세포 원심분리기에 넣습니다.

각 필터 카드 챔버에 100마이크로리터의 FACS 버퍼를 추가하고 슬라이드를 잠시 원심분리합니다. 스핀이 끝나면 각 챔버에 100마이크로리터의 세포를 추가하고 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 공기 건조를 위해 챔버에서 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다.

골수 세포를 염색하기 위해 슬라이드를 May-Grunwald 용액이 들어 있는 코플린 병에 5분 동안 담급니다. 다음으로, 슬라이드를 pH 6.8의 완충 용액 병에 1분 동안 옮깁니다. 그런 다음 10분 동안 슬라이드를 Giemsa R 솔루션으로 옮깁니다.

그런 다음 pH 중성 물로 10초 동안 씻습니다. 세척 후 슬라이드를 자연 건조시키고 각 샘플에 장착 매체 한 방울을 바르십시오. 그런 다음 커버 유리의 한쪽 가장자리를 슬라이드에 놓고 커버 유리를 셀 위로 조심스럽게 내리면서 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다.

대조군 동물과 비교했을 때, C1498 세포를 주입한 동물은 세포의 폭발과 같은 모습에서 관찰된 바와 같이 골수에 C1498 세포의 대량 침투를 나타냅니다. C1498 세포에 침투하는 골수는 급성 골수단세포성 백혈병의 특징인 단핵세포와 골수모세포를 각각 나타내는 단핵구 및 과립구 표현형을 보여줍니다. C1498을 주입한 마우스의 혈액 샘플에서 단핵 세포 빈도에 대한 유세포 분석은 전체 백혈구 집단의 약 1/4이 백혈병 세포로 구성되어 있음을 나타냅니다.

T 및 B 림프구 빈도는 대조군과 C1498 주입 동물 간에 유사합니다. 그러나 단핵구 빈도는 C1498 주입 마우스에서 더 높은 수준으로 관찰되며, 이는 급성 골수단핵구 백혈병의 특징입니다. 세포화학 및 May-Grunwald Giemsa 절차를 수행할 때 적절한 pH 값, 온도 및 배양 시간을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 급성 골수단핵구성 백혈병을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후, 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 다른 동물 모델에서 자연 및 유발 급성 백혈병의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.