Name: 쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 C1498 세포와 급성 골수모구백혈병을 특성화하는 방법을 마우스 모델에서. 유세포측정법과 세포화학염색을 활용하여 백혈병 기전과 면역결핍을 연구하고 새로운 치료제를 테스트합니다.

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저자는 이 연구를 지원해 준 "Ligue Nationale contre le Cancer"(Comité du Septentrion), SIRIC ONCOLille(Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) 및 Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille(IRCL)에 감사를 표합니다. 그들은 Delphine Taillieu와 동물 시설 직원에게 쥐를 수용하고 복지를 유지해 준 것에 대해 감사하고 싶습니다. 또한 현미경 및 유세포 분석에 도움을 준 Raphaëlle Caillerez와 Nathalie Jouy에게도 감사드립니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이전 연구에서, C1498 세포주 급성 과립 5 myelomonocytic 6 또는 7 NKT 세포 백혈병 유도제로서 설명 하였다. 그러나, 문학 실증 데이터가 없거나 불완전한 중 하나였다. 여기에 제시된 프로토콜은 유동 세포 계측법, 면역, MGG 염색 및 세포 화학적 분석과 같은 다른 기술, 배양 C1498 세포를 특성화하고 주입 후 쥐에서 유도되는 백혈병의 특성을 결정하기 위해를 사용한다. 우리는 면역 염색 후 체외 배양 C1498 세포 phenotyped과 세포 계측법 분석을 수행 하였다 흐름 때 이러한 세포가 이전에 문헌 6,7에 설명 된 몇 가지 세포 표면 조혈 마커를 표현하기 때문에, 우리는 몇 가지 제한을 관찰했다. 우리의 결과와 일치, 라벨 씨 등은. 흐름 cytomet를 사용하여 C1498 세포에 성숙한 TCR의 세포 표면 발현을 관찰하지 않았다공예 염색. 그들은 CD3ε 및 TCRVβ8.2 7 mRNA를 검출 한 후 그러나 그들은 NKT 세포주로 그들을 고려. 우리는 또한 세포 (&gt; 70 %)의 대부분 TCRVβ 체인 및 CD3ε 분자의 세포 내 발현을 관찰하지만, 맥-3 분자의 수반 세포 내 발현도 있었기 때문에 자신의 조혈 계통은 확인할 수 없습니다. 마이 엘 로퍼 옥시 다제, MGG 염색 및 cytochemistry를 사용하여 기능 에스 테라 제를 분석 평가는 C1498 세포주는 골수 기원을 가지고 있었고, monoblasts 및 골수성로 구성되었음을 보여 주었다. 이러한 결과는 착색 유동 세포 계측법 분석 얻었다 맥 3 + 세포의 비율로 조화 된 있었다. 다음 단계는 키 실험을 나타내는 정량적하지 않지만 수행합니다. 사실, 그들은 전혀 또는 F를 표현 조혈 세포의 혈통과 분화 단계의 특성에 가장 적합한 기존의 방법은 지금까지 남아EW 특정 표현형 마커. 염색 유동 세포 계측법은 C1498 세포를 정맥 주사 한 후 congenic 마우스의 급성 백혈병의 개발을 설명하는 데 도움이되었다. 말초 혈액 및 다양한 기관에이 침투 CD45.2 + C1498 세포 격리했고, 그 주파수를 측정 하였다. 정량은 면역 표현형 후 고유 골수 및 비장 세포를 분석 하였다. 그들은 약간 조혈 마커를 나타낸 상기 C1498 세포 표현형 기관에서 조사 될 때 한계가 발견되었다 (이들 중 단지 소수의 B220 +이었다). 상기 관찰 급성 백혈병의 자연, 월 - 그룬 왈드 김사 염색 및 단핵구의 활동의 분석을 정의하고 과립 에스 테라 제 골수를 사용하여 수행 하였다. 결과는 C1498 세포가 myelomonocytic 백혈병의 발병을 공개, 그들의 myeloblastic 및 monoblastic 형태와 기능을 보존 것으로 나타났다. <p claspH의 오류가 결과의 잘못된 해석으로 이어질 수 있기 때문에 세포 화학적 반응과 MGG 염색을 수행 할 때이 프로토콜에서 설명하는 중요한 단계에 대한 고려의 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 특히주의 pH를 부여해야합니다. 과립구 및 림프구는 또한 더 높은 pH 값에서이 테스트에 대한 양성 염색 할 수 있기 때문에 예를 들면, α-나프 부티레이트 에스 테라 제 활성은 단지 6.0의 pH에서 단핵 세포에 특이. 세포를 집착하는 것은 MGG 염색을 수행하기 전에 권장, 우리는 C1498 세포를 이용하여 에스 테라 제를 세포 화학적 반응을 수행하는 경우에만 CAF 고정은 만족스러운 결과를 제공하는 것으로 나타났다되지 않습니다. 계측법은 시료 (예, 혈액, 골수, 비장 세포)의 모든 과정 동안 얼음에 보관해야 상기 CD115 분자의 발현과 흐름에 의해 그 검출을 보존. 전혀 오염은 유동 세포 계측법 / 또는 면역 실험 항체의 참조 스토리지 재 관찰되지 않으면표창 및 희석 확인해야합니다. 재료 / 장비 테이블에 지정된 참조는 유동 세포 계측법 또는 면역 응용 프로그램으로 선정되었습니다. 일차 / 이차 항체 또는 공액 형광 인해 부적절한 저장 그들의 활동을 분실했을 수 있습니다 (예를 들어, 빛이나 열에 노출), 부적절한 희석, 광범위한 동결 / 해동 또는 오염 된 버퍼의 사용. 그들이 제대로 작동하는지 확인하기 위해 긍정적 인 컨트롤을 실행합니다. 마우스 골수 또는 관심의 단백질을 발현하는 것으로 알려져있다 비장 유래 세포를 사용합니다. 높은 배경이 아닌 특정 얼룩을 방지하기 위해, 세포가 제대로 세척하고 (면역에 대한) 높은 습도 유지 및 지침에 따라 항체가 희석되어 있는지 확인하십시오. 정확한 샘플의 배경 레벨을 결정하기 위해 이소 타입 대조군 항체와 차 항체에 대해 동일한 농도의 희석을 사용한다. 에스 테라 cytochemistry 실험 들면,시약 정제 마우스 비장 과립 (Ly6G +) 및 단핵구 (CD115 +) 세포를 함유하는 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 사용하여 테스트 될 수있다. 이 연구에 기술 된 절차 C1498 세포의 주입 후 쥐에서 관찰 백혈병 많은 기능 인간 급성 백혈병 myelomonocytic 11,12와 공통 특징을 공유하는 것으로 나타났다. 침략 백혈병 세포는 성숙과 미성숙 (전구 세포 및 전구 물질) 골수 조혈 세포의 감소 결과. 단핵 세포만큼 C1498 세포는 말초 혈에서 고주파 (&gt; 20 %)에 존재한다. 비대와 비장은 백혈병 세포의 침투에 기인하는 것으로 관찰되었고, B 림프구 및 골수 세포에서 유의 한 증가는 비장 함께 관찰되었다. 혈소판 번호가 혈액 분석을 사용하여 추정 될 때 Thrombopenia도 관찰되었다. 그것은 쇼였다N, 시험 관내 실험에서 사용 C1498 세포를 용해 요소 (13)를 분비하여 정상 쥐의 조혈을 억제하는 것이다. 여러 종양 마우스 모델에서 (단핵구 및 과립 세포 포함) 미숙 골수 세포는 또한 항 - 종양 특이 적 T 세포 활성화 및 증식 (14)을 억제 비장에 골수 마이그레이션하는 것으로 나타났다. 따라서, 골수에서 관찰 한 조혈 세포의 감소는 조혈 및 / 또는 이민의 결핍 중 하나에 기인 할 수 있었다. 후자의 메커니즘은 말초 혈액에서 monocytosis의 존재 또는 비장 확대 골수성 분획의 관찰을 설명 할 수있다. 이들 세포는 조혈 개선 비장으로부터 유래 된 수 있다고도 생각할 수있다. 성숙한 B의 전구체 15 림프구 실제로, 정상 조건 하에서, 비장 B 세포의 일부 서브 세트는 확인되었다. 또한, 염증성 조건 하에서 메드ullary 조상 줄기 세포는 성숙한 단핵구 (16)의 생산을 유도하는 비장 이주 도시되었다. 이 프로토콜은 우리가 백혈병의 개발에 참여하고 있으며, 추가 기능뿐만 아니라 분자 분석이 이렇게하기 위해 사용되어야하는 메커니즘에 관한 결론을 도출 할 수 없습니다. 그러나, 이러한 데이터는 급성 myelomonocytic 백혈병의 임상 적 특징에 대한 자세한 정보를 포함하고 평가 및 새로운 치료제의 효과를 이해하는 연구자 도움이 될 것입니다.

급성 골수성 백혈병 (AML)의 성숙의 다른 단계에서 차단되어 골수 조혈 세포의 억제되지 않는 증식을 특징으로한다. 이 조절 곤란은 과립, 단핵구, 적혈구 또는 megaryocytic 분화 경로 1에 영향을 줄 수 있습니다. AML 세포는 thrombopenia, 림프구 감소증과 빈혈을 초래 장애인 조혈, 선도, 골수에 축적. 백혈병 세포는 혈액 및 비 림프 기관 침입. C1498 마우스 모델은 문헌 혈액으로 침입 설명 암세포 1941에서 백혈병 10 개월 된 C57BL / 6 (H-2 b) 암컷 마우스로부터 분리 된 이후 급성 백혈병의 모델로서 수십 년 동안 사용되어왔다 조혈 기관 (예를 들어, 비장과 림프절) 및 비 조혈 기관 (예를 들어, 간은, 폐, 난소, 신장)이 높은 증식 C1498 세포로는은에서를 통해 주입 된 후travenous, 취약 마우스 2-4로 피하 또는 복강 내 경로. 그러나,이 마우스 모델은 하나 또는 과립 2,5- myelomonocytic 6 백혈병을 유도하는 것으로보고되었다. 최근에는 2002 년에 발표 된 연구는 쥐 NKT 세포 백혈병 (7)과 같은 암의 유형을 설명했다. 따라서, 상기 문헌은 본 C1498 세포주의 특성 및이 마우스에서 유도 관련 백혈병 관한 다르다. 70 년대 - 이러한 불일치는 세부의 부족과 세포에 대한 업데이트 게시 된 정보 및 많은 연구가 1950 년에 수행 되었기 때문에 일반적으로 백혈병 질병에 주로 기인한다. 여기에서는 C1498 세포를 특성화하고 마우스에 정맥 내 주사에 의해 그들의 유도 백혈병 질병의 특성을 분석하는 방법을 설명하는 세부적인 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜의 첫 번째 섹션은 체외에서 배양 된 C1498 세포의 설명에 최선을 다하고 있습니다. 형광 방지표면 및 세포 내 조혈 마커에 대해 감독 기관은 유동 세포 계측법 사용하여 표현형을 결정하는 데 사용되었다. 마이 엘 로퍼 옥시 다제의 존재가 면역 형광 현미경을 사용하여 평가하고, 그 리니지 조혈 및 분화 단계는 에스 테라 제의 활성을 평가하기 cytochemistry를 이용하여 평가하였고, 5-6의 Grunwald 김사 염색을 수행 하였다. C1498 세포는 생쥐에 주입하고, 유도 된 급성 백혈병 질환이 원고의 두번째 섹션에 설명되어있다. 동일한 기술은 주파수와 골수 백혈병 및 고유 세포, 말초 혈, 비장 및 비 - 조혈 기관 (간 및 폐)의 표현형을 결정하는 데 사용 하였다. 이 프로토콜은 높은 재현성이며, 여기에 제시된 데이터는 연구자들이 새로운 치료 전략의 효과를 평가하는데 도움이 될 것이다. 이러한 백혈병 마우스 모델 이미 면역이 접근 테스트하는 데 사용 된차 다른 암 화학 요법 약물 8,9. 효능은 종양 부담과 생존율의 진화를 확인하여 평가 하였다. 이 프로토콜은 치료 중 백혈병 및 다른 조혈 세포 집단의 생존 및 분포에 대한 추가 정보를 제공하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>C1498 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc A Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Cells 배양 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes, Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 솔루션, Gibco&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지 (Gibco, GlutaMAX 보충제)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 염색 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>클론 RA3-6B2, 최종 희석 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 B220 비오틴 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>클론 RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>클론 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>클론 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>클론 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>클론 GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>클론 GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD8 비오틴 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>클론 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>클론 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11a 비오틴</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>클론 M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>클론 M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD16/32 비오틴</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>클론 93, 1/400</td></tr><tr><td>정제 안티-마우스 CD16/32 (FcR 차단)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>클론 2.4G2</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD18 비오틴 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>클론 M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>클론 M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>클론 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>클론 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>클론 390, 1/100</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>클론 RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD44 PE</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>553134</td><td>클론 IM7, 1/50</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>클론 104, 1/100</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD49b/Pan NK PE</td><td>&nbsp; BD biosciences</td><td>553858</td><td>클론 DX5, 1/50</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD80 비오틴</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>클론 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD86 비오틴</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>클론 GL1, 1/200</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>클론 M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>클론 AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>클론 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>클론 A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>클론 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD274 (PD-L1) 비오틴</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>클론 MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>클론 D7, 1/100</td></tr><tr><td>안티-마우스 Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>클론 HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>안티-마우스 Ly-6G&nbsp; (Gr-1) 비오틴 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>클론 RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>클론 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>안티 마우스 MHC 클래스 I (H-2Db) 비오틴</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>클론 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>안티 마우스 MHC 클래스 II (I-A/I-E) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>클론 M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>안티 마우스 NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>클론 PK136, 1/50</td></tr><tr><td>안티-마우스 TCRVb FITC</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>553170</td><td>클론 H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>스트렙타비딘 PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/200</td></tr><tr><td>면역형광 염색 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 골수페록시다아제(중쇄 항체)&nbsp;</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp; 항염소 IgG (텍사스 레드 결합 항체)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 용액</td><td>BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>장착 매체 1 (Fluoromount)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Esterase cytochemical staining reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naphtol AS-D chloroacetate 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>염료 용액(Fast Red Violet LB Base solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6.3 완충 농축액(TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 질산염 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>시트레이트 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액, 37%</td> <td>시그마-알드리치</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-나프틸 부티레이트 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>아질산나트륨 정제</td><td>시그마-알드리치</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>파라로사닐린 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>마운팅 매체 2 (Clearmount)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald Giemsa 염색 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald 솔루션</td><td>RAL 진단</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa R 솔루션&nbsp;</td><td>RAL 진단</td><td>320310</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/20</td></tr><tr><td>pH 6.8 완충 용액</td><td>RAL 진단</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td>기타 재료, 시약 및 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 1000 (100 mg/ml)</td><td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml)</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin 알부민 혈청(BSA) 분말</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>PBS 용액 (1x 농축액)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>사포닌&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>초순수 0.5m EDTA 용액, pH 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>분리 용액(Pancoll 마우스)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>용해 완충액(적혈구 용해 완충액) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 용액 (0.4 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>50 ml 튜브 (팔콘)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 셀 스트레이너 (팔콘)&nbsp;</td><td>코닝 생명과학</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 챔버 & 필터 카드 (EZ Cytofunnel Shandon)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 안경, 24 x 24mm</td><td>니트 유리</td><td>VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 (Starfrost - ground edges 90)</td><td>니트 유리</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 150mm(모세관)</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>26 G 바늘</td><td>테루모</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 인슐린 주사기와 바늘 29 G</td><td>테루모</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>30 G 바늘&nbsp;</td><td>벡턴 & Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 튜브 (파란색)</td><td>Beckman Coulter</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>방수 펜(Dakopen)</td><td>Dako</td><td>S200230</td><td></td></tr><tr><td>날카로운 멸균 가위&nbsp;</td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>멸균 집게</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Thoma 세포 계수 챔버</td><td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (Fisherbrand 플라스틱)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>원통형 재분배기 15 - 30 gm</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 세포 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈 스폰지</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 c1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

1941이 주사 급성 백혈병의 개발 결과 때문에 동계 또는 congenic 마우스에 C1498 세포의 정맥 내 주사가 수행되었다. 그러나,이 병의 성격이 잘 문헌에 기록되지 않았습니다. 여기서는 C1498 시험 관내 세포의 특성과 생체 내에서 유도 성 백혈병의 특성을 결정하기위한 프로토콜 기술을 제공한다. 이 절차의 첫 번째 부분은 조혈 리니지 배양 C1498 세포의 분화 단계를 결정하는 단계에 초점을 맞추고있다. 이를 위해, 다중 파라미터 유세포 염색 조혈 세포 마커를 검출하기 위해 사용된다. 면역 형광 현미경 cytochemistry 및 5 월의 Grunwald 김사 염색 한 다음, 각각의 마이 엘 로퍼 옥시 다제 발현 및 세포 형태 에스 테라 제의 활성을 평가하기 위해 수행된다. 이 프로토콜의 두 번째 부분에 유도되는 백혈병 질환을 설명하기 위해 최선을 다하고 있습니다생체. 후자는 혈액에서 백혈병 및 고유 셀의 주파수를 결정함으로써 달성 될 수있다 계측법 특정 염색을 이용하여 유동 조혈 기관 (예, 골수, 비장) 및 비 림프계 조직 (예, 간, 폐)을 분석한다. 백혈병의 특성은 골수 특정 에스 테라 제에 대한 5-6의 Grunwald 김사 염색 얼룩을 사용하여 확인된다. 여기, 우리는 연령대 C1498- 및 PBS-주입 된 쥐에서이 프로토콜을 사용하여 얻었다 결과를 제시한다.

C1498 마우스 모델의 특성을하기 위해, 우리는 두 가지 주요 단계를 계속했다. 우선, C1498 세포는 시험 관내에서의 혈통 조혈 성숙 단계 (도 1)을 결정하는 것을 특징으로 하였다. 이들 세포를 congenic 생쥐에 주입하고, 유기 백혈병 질환의 성질은 상이한 특징을 결정하는 평가 하였다 : 백혈병 세포의 침윤, 그 표현형, 골수의 조혈 세포의 정량화 (성숙 및 선조 / 전구체) 주파수를 C1498 세포와 혈액에 성숙 조혈 세포 및 장기 부종의 평가 (비장, 간, 폐) 및 세포 조성물. 시험 관내 C1498 세포 표현형을 특성화하기 위해, 세포를 조혈 전구체 및 성숙한 세포 (표 1)에 의해 표현되는 분자에 대한 항체로 표지하고, 그 결과 유동 cytomet를 사용하여 분석 하였다공예. C1498 세포 맥-1 (CD11b를 / CD18) (~ 7 %), B220 (&gt; 25 %)의 세포 표면 발현을위한 양성이었고, 그들은 CD3ε, T 세포 수용체 (TCR) Vβ 쇄 맥의 세포 내 발현을 나타 -3 (도 2A와 B). 세포는 세포 표면 마커 Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 및 팬 NK 분자를 부정적이었고, CD4와 CD8의 세포 내 발현 (데이터 도시하지 않음) . 이들은 다음의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 (표 1)의 마커에 대해 조사 하였다. 그들은 또한 CD117, CD34, 무서-1, CD150 및 CD16 / 32의 세포 표면 발현을위한 음성이었다 (데이터는 보이지 않음). 이러한 백혈병 세포를 접착 항원 제시 및 공동 자극 분자의 발현을 확인하기 위해 테스트 하였다. 세포 표면 마커 LFA-1 (CD11a에 / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1) 및 H-2D B를 발현시키고, CD80, CD86 및 CD274 (데이터 미도시) MHC 클래스 II 부정적이었다. C1498 세포 therefore 골수 (맥-1, 맥-3) 및 림프 마커 (B220, CD3, TCR) 모두를 표명했다. 더 잘 조혈 혈통을 특성화, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 발현은 면역 형광 현미경을 사용하여 평가 하였다. 모든 세포는 골수 유래 (도 3A)을 검증 마이 엘 로퍼 옥시 다제, 양성이었다. 세포의 대부분은 또한 α 나프 틸 부티레이트 에스 테라 제 (그림 3B, 왼쪽 패널)에 대한 긍정적 인 염색, 그들 중 일부는 나프톨 AS-D 클로로의 에스 테라 제 (검은 색 화살표) (그림 3B, 오른쪽 패널)에 대한 스테인드. 그 결과 세포가 단핵 세포 및 과립구의 혼합물을 함유하는 것으로 나타낸다. 5-6의 Grunwald 김사 염색을 수행 한 후, C1498 세포는 높은 nucleo - 세포질 비율 핵 3-5 핵소체하는 핵 주변 할로, 다수의 액포와 호 염기성 세포질 (도 3c를 폭발과 같은 형태를 표시하는 관찰 ). 일우리는 C1498 세포주 monoblasts 및 골수성 구성된다. C1498 세포 (CD45.2 +)은 다음 정맥 CD45.1 + 마우스에 주사 하였다. 쥐 세포를 주입하고 17 내지 19 일 후에 굴복. 그들은 질병 사망 전에 백혈병 유형을 분석 할 수 있도록 상기 마우스들을 희생시켰다. PBS 주입 된 대조군 마우스는, 비교를위한 동일 시점에서 분석 하였다. C1498 세포 주입 된 마우스는 5-6의 Grunwald 김사 염색 (도 4A)을 수행 한 후에 셀의 폭발과 같은 외관에 의해 입증 된 바와 같이, 그들의 골수 C1498 세포의 대량 침투를 표시. 또한 급성 myelomonocytic 백혈병의 특징이다 monoblastic 및 myeloblastic 세포의 축적을 보여주는, 자신의 단핵구 및 과립 표현형 (그림 4B 및 C)를 보존. (D)에골수 조혈 세포 번호, 백혈병 세포의 침윤, CD45.2 + C1498 세포, B의 림프구, 단핵구 및 (조상, 전구체 및 성숙 세포를 포함) 과립 인구 다음 낮았다 면역 염색 및 세포 계측법 분석 다중 파라 메트릭 흐름을 사용하여 정량화되었는지 etermine. 백혈병 세포가 조혈 세포의 36 %로 (16)로 표시 (데이터는 보이지 않음). 다른 세포 유형 모두 과립 세포와 평균 3 배에 대한 평균 4 배, B 세포 하위 집합에 대한 평균 5 배 (PBS를 주입 쥐에 비해 C1498 주입 된 쥐에서 상당히 낮은 숫자에 제시 하였다 C에 단핵구 부분 집합에 대한) (그림 5A). 백혈병 및 제어 마우스 혈액의 단핵 세포의 빈도에 대한 조사는 림프구 (도 6A)의 비교 백분율하지만 단핵구 높은 주파수를 함유하는 것으로 나타났다및 백혈병 세포. 이러한 특성은 급성 백혈병 myelomonocytic (11) (도 6b)을 대표한다. 급성 myelomonocytic 백혈병 (12)의 다른 기능 중, C1498 주입 마우스 부어 간 (간 비대), 폐와 비장 (비장) (도 7a)에 발표했다. CD45.2 + C1498 세포의 다양한 주파수는 면역 형광 염색법을 사용하여 이러한 기관에서 검출 및 분석 (그림 7B) 유동 세포 계측법했다. 로 비장 비대 침투 단핵 세포의 높은 숫자에서 발생할 수 있습니다, 우리는 또한 비장 인구의 비율을 추정했다. 상기 B 림프구, 단핵 세포 및 과립구 세포 분획의 수는 2 배의 평균 상당히 컸다 2.5 배 및 3 배 각각 제어 비장 (도 7C)보다 백혈병 비장있다. 얇은 페이지 = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> 체외 배양 C1498 셀 라인과 급성 백혈병의 생체 설명에 특성화를위한 설정 프로토콜. 조혈 계통 및 조직 배양 C1498 세포의 분화 단계의 그림 1. 도식 표현 먼저 결정 하였다. C1498 세포는 급성 백혈병의 개발을 유도 congenic 마우스에 주사 하였다. 골수, 말초 혈, 비장, 간, 폐 조직의 분리는 C1498 세포 침윤 후 주파수 표현형 및 형태 학적 변화를 결정하기 위해 수행되었다. IV : 정맥 MGG :. 월 - 그룬 왈드 김사 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> 광고 / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; 체외 문화. 도트 플롯과 세포 표면 (A) 및 세포 (B)의 히스토그램 세포 계측법 대표 흐름 후 C1498 세포의 그림 2. 표현형 분석 조혈 성숙한 세포 분화와 관련 된 분자가 표시됩니다 C1498-표현했다. C1498 세포는 세포 표면는 CD11b, CD18 및 B220 마커 또는 아이소 타입 컨트롤 특정 하였다 형광 항체를 사용하여, 배양 물로부터 수확 된 세정 표지 하였다. 세포 염색을 위해, 세포를 고정 및 투과 화 맥 3 CD3ε 대한 항체 및 TCR (T 세포 수용체) Vβ 쇄 또는 아이소 타입 컨트롤 공통 에피토프를 사용하여 라벨링 하였다. 분석은 살아있는 세포에 게이팅 사용하여 수행 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> ntent &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> 그림 3. 기능 및 배양 C1498 세포의 형태 학적 특성. C1498 세포 배양 물로부터 수확 현미경 슬라이드에 원심 분리 하였다. (A) 마이 엘 로퍼 옥시 다제 발현 염색 면역 형광을 사용하여 수행 하였다. (B) 세포 화학적 반응은 α-나프 부티레이트 에스테라아제 (NBE) 및 나프톨 AS-D 클로로 아세테이트 에스 테라 제를 분석 하였다 (CAE) C1498 세포에서 활동. 세포는 갈색과 붉은 보라색, 큰 세포질 과립, 각각 관찰되었다 각 레이블에 대한 긍정적 인 것으로 간주되었다. C1498 세포의 (C) 월 - 그룬 왈드 김사 (MGG) 염색. 각 염색 실험은 현미경 대물 렌즈 배율을 나타낸다. 각 이미지는 세 개의 실험을 나타낸다.large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> 그림 4. PBS-과의 골수 모폴로지 마우스를 C1498 주입. 골수 세포는 PBS-및 C1498 세포 주입 쥐에서 분리하여 현미경 슬라이드에 원심 분리 하였다. (A) 월 - 그룬 왈드 김사 (MGG) 염색. (B ) α 나프 틸 부티레이트 에스 테라 제 (NBE) 및 클로로 에스 테라 제 (CAE) 기능이 cytochemistry를 사용하여 평가 하였다 AS-D (C) 나프톨. 패널 (A)에서, 밴드 (미숙 한) 또는 분할 (성숙) 호중구는 PBS-주입 된 쥐보다 C1498 주입 쥐의 골수에서 덜 볼 수 있습니다. 패널 B 및 C는 제어 골수에서 관찰 된 숫자에 비해 백혈병 골수 단핵 세포 및 과립구의 축적 있다는 것을 나타낸다. 모든현미경 분석은 100X 배율 목표를 사용하여 수행 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> 그림 5. PBS-과의 수질 인구의 정량 분석 마우스를 C1498 주입. 골수 세포는 PBS-및 C1498 세포 주입 쥐에서 분리 된 세포 계산을 수행 한 후 추정되었다. 다른 세포 집단의 주파수가 면역 및 세포 계측법 분석 생균 게이트 흐름 후에 측정 하였다. (A)가 B 세포의 서브 세트는에서 B 림프구 (B) 과립 세포 성숙 프로 B 세포로부터 단계에서 CD19 + B220 + 세포를 포함 전구체을 포함 CD11b를 + Ly6G + 계통, - CD3. CD115 + 및 단핵구 단계 성숙하는 전구 세포를 포함 - 차 미성숙과 성숙 과립구 (C)는 단핵구 부분 집합은 CD3로 정의 하였다. n은 7 마우스 / 그룹 및 데이터 =은 SEM ± 수단을 보여주는 히스토그램으로 표시하고 있습니다. ***, p &lt;0.0001 **, P &lt;0.01, PBS-및 C1498 주입 쥐를 비교 짝이 학생의 T- 테스트. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> PBS-과의 단핵 세포 하위 집합의 그림 6. 혈액 분석 쥐를 C1498은 주입. 각각 PBS-및 C1498의에서 CD3 +와 B220 + 세포로 정의 하였다 (A) T와 B 림프구 비율의 도트 플롯 세포 계측법 대표 유동 세포 주입.와 CD115 + Ly6C 높은 세포 - 마우스 (B) C1498의 백혈병 및 제어에 단핵구 세포 주파수 (PBS) 마우스 CD115 + Ly6C를 분석하여 측정 하였다. 분석은 생균 게이팅에 의해 수행되었다. 백혈병 및 제어 쥐를 비교하기 위해, C1498 세포는 제외 하였다 + CD45.2입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> 백혈병 및 제어 마우스의 비장 인구의 그림 7. 평가. (A) 마우스 백혈병 부종, 간, 폐, 비장의 대표 사진은 대조군 마우스와 비교. 비장은 조직 중단 다음 수집 및 무게, 및 비장 세포를 계수 하였다되었다. (B) 히스토그램은 diff에서 백혈병 세포의 주파수를 나타내는erent 기관 면역이 CD45.2 + 세포에 대해 수행하였으며, 그 결과는 유동 세포 계측법으로 분석 한 후. (C) 비장 B, 면역 후 과립구 및 단핵구 세포 수의 추계 분석 게이팅 유동 세포 계측법 살아있는 CD19 + B220을 식별하기 위해 수행되었다 + , CD3 - CD11b를 + Ly6G +, CD3 - CD11b를 + Ly6C - 및 CD3 - CD11b를 + Ly6C 높은 세포. 폐, 비장 및 간에 대해 표시 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. .. n은 5 = - 8 마우스 / 그룹 및 데이터 SEM ± 수단으로 막대 그래프로 표시됩니다 * P &lt;0.05, **, P = 0.0033, PBS-과 비교 짝이 학생의 T- 테스트 C1498이 주입 된 쥐 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">하세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbodY&gt; <tr><td> 셀 유형 </td><td> 막 또는 세포 내 분자 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 전구체와 성숙한 세포 </td><td></td></tr><tr><td> NK 세포 </td><td> NK1.1 +, 팬-NK의 + </td></tr><tr><td> NKT 세포 </td><td> NK1.1 +, 팬-NK +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 + </td></tr><tr><td> T 림프구 </td><td> TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> B 세포 전구체와 B 림프구 </td><td> B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + </td></tr><tr><td> 과립 전구체 및 과립구 </td><td> Ly6G +, 맥-1 +, CD11b를 + </td></tr><tr><td> 단핵구 전구체 및 단핵구 / 대 식세포 </td><td> CD11b를 +, 맥-1 + 맥 - 3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 조상 </td><td></td></tr><tr><td> 능성 전구 세포 </td><td> CD117 + 무서-1+ CD34 + (선형 적 CD150-) </td></tr><tr><td> 림프 - 프라임 능성 전구 세포 </td><td> CD117hi 무서-1hi CD127 + (선형 적) </td></tr><tr><td> 일반적인 림프 전구 세포 </td><td> CD117lo 무서-1lo CD127 + (선형 적) </td></tr><tr><td> 공통 골수 전구 세포 </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int (선형 적 무서-1) </td></tr><tr><td> 과립구 - 대 식세포 선조 </td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (선형 적 무서-1) </td></tr><tr><td> 거대 핵 세포 - 적혈구 전구 세포 </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (선형 적 무서-1) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 조혈 줄기 세포 </td><td> CD117 + 무서-1 + CD150 + (선형 적 CD34-) </td></tr></tbody></table> 표 조혈 세포 계통과 차별화 1. 마커. CD : 차별화의 클러스터; 린 : 성숙한 세포의 마커; 봐라:낮은 표현; 안녕하세요 : 고 발현; INT : 중간 표현; NK : 자연 살해 세포; TCR : T 세포 수용체.

이 논문은 시험 관내 및 주사 후 마우스에서 유도 된 급성 백혈병 C1498 세포 배양을 특성화하는데 사용될 수있는 기술적 인 방법을 제공한다. 표현형 및 기능 분석은 유동 세포 계측법, 면역 형광 현미경, cytochemistry 월 - 그룬 왈드 김사 염색을 사용하여 수행됩니다.

쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

이 절차의 전반적인 목표는 Murine C1498 세포의 특성을 분석하고, 이를 마우스에 정맥 주사하여 유도되는 급성 백혈병을 규명하는 것입니다. 이 절차의 주요 장점은 C1498 세포 주입 후 유도된 마우스 골수성 단구성 백혈병이 인간 질환의 많은 특징을 나타낸다는 점입니다. 이러한 동물 모델은 백혈병 발생 및 면역 결핍을 유도하는 메커니즘이 무엇인지와 같은 혈액학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 동물 모델은 새로운 화학 요법 및 면역 치료제의 테스트를 용이하게 하여 백혈병 치료에 기여할 수 있습니다. 먼저 5~6주 된 암컷 동종 C57 black 6 마우스를 멸균 라미나 플로우 후드로 옮깁니다. 그런 다음, 동물을 보정기에 넣습니다.다음으로, 29 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 100 µL의 세포를 채웁니다. 꼬리의 원위부를 잡고 70% ethanol을 적신 거즈로 꼬리 피부를 소독합니다. 1 × 10⁶ 개의 세포를 측면 꼬리 정맥에 천천히 주입하십시오.모든 세포가 주입되면 바늘을 제거하고 멸균 거즈로 주입 부위를 가볍게 압박합니다. 그 후 동물을 케이지로 옮기고 향후 몇 주 동안 주의 깊게 관찰합니다. 17~19일 후, 마취된 백혈병 모델 동물의 안구 내측 안각에 모세관을 삽입합니다.안와 정맥동에서 100 내지 200 µL의 혈액을 모세관 튜브로 채취합니다. 튜브를 제거하고 멸균 거즈 스펀지를 눈 위에 부드럽게 눌러 지혈합니다. 그런 다음, 혈액을 EDTA 튜브로 옮기고 단핵구 분리 시까지 튜브를 얼음 위에 보관합니다.혈액 단핵구를 분리하려면 먼저 1 mM EDTA가 포함된 PBS를 최종 부피 500 µL가 되도록 추가합니다. 그다음, 샘플을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이어서, 30 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 혈액 아래에 분리 용액 500 µL를 조심스럽게 층이 지도록 넣으며, 이때 층이 섞이지 않도록 주의합니다.원심분리를 통해 세포를 분리하고, 피펫을 사용하여 불투명한 흰색의 단핵구 층을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 1 mL의 PBS로 면역 세포를 세척합니다. 세포를 원심분리하고, 염색 및 유세포 분석을 위해 펠렛을 600 µL의 FACS 버퍼에 재부유시킵니다.골수를 분리하기 위해 마우스를 플라스틱 보드 위에 등으로 눕히고 사지를 고정합니다. 70% ethanol로 동물을 소독합니다. 그 다음, 각 다리의 관절 윗부분 대퇴골 상단을 절개하고 경골을 부드럽게 당겨 대퇴골에서 분리합니다.포셉과 가위를 사용하여 뼈에서 피부와 근육을 제거하고, 뼈를 얼음 위의 페트리 접시로 옮깁니다. 가위를 사용하여 말단 부위를 제거합니다. 그런 다음 5 mL의 차가운 PBS가 담긴 10 mL 주사기에 연결된 26 gauge 바늘을 한 번에 하나의 뼈 끝에 삽입하여 골수를 접시로 씻어냅니다.골수 세포를 분산시키기 위해 세포 현탁액을 바늘 끝으로 여러 번 통과시킵니다. 그 다음, 새로운 70 micron 필터를 통해 세포를 50 milliliter 원심분리관에 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포를 원심분리하고 펠렛을 2 milliliter의 용해 버퍼(lysis buffer)에 다시 현탁합니다.즉시 튜브에 차가운 PBS를 최대 50 milliliters까지 채우고 세포를 원심분리합니다. 그런 다음, 골수 펠렛을 차가운 FACS buffer에 1 $\times$ 10⁶ cells/milliliter 농도로 재현탁합니다. 염색을 위해 골수 세포를 준비하려면, 먼저 필터 카드가 부착된 일회용 챔버에 슬라이드를 넣고 챔버를 세포 원심분리기에 넣습니다.각 필터 카드 챔버에 100 µL의 FACS 버퍼를 넣고 슬라이드를 짧게 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 각 챔버에 100 µL의 세포를 넣고 세포를 원심 분리합니다. 그 다음, 공기 중에서 건조시키기 위해 챔버에서 슬라이드를 조심스럽게 꺼냅니다.골수 세포를 염색하려면 슬라이드를 May-Grunwald 용액이 담긴 코플린 자(coplin jar)에 5분 동안 담급니다. 다음으로, 슬라이드를 pH 6.8의 완충 용액이 담긴 자로 옮겨 1분 동안 둡니다. 그 후, 슬라이드를 Giemsa R 용액으로 옮겨 10분 동안 염색합니다.그 후 pH 중성수로 10초 동안 세척합니다. 세척 후 슬라이드를 공기 중에서 건조시키고, 각 시료에 봉입제를 한 방울씩 떨어뜨립니다. 그런 다음 커버글라스의 한쪽 가장자리를 슬라이드 위에 놓고, 커버글라스를 세포 위로 조심스럽게 내리며 가볍게 눌러 기포를 제거합니다.대조군 동물과 비교하여 C1498 세포가 주입된 동물은 세포의 모세포(blast)와 같은 외형을 통해 관찰되는 바와 같이 골수 내에 C1498 세포가 대량으로 침윤되어 나타납니다. 골수에 침윤된 C1498 세포는 각각 단구모세포(monoblastic)와 골수모세포(myeloblastic)를 나타내는 단구성 및 과립구성 표현형을 보이며, 이는 급성 골수단구성 백혈병의 특징입니다. C1498이 주입된 마우스의 혈액 샘플에서 단핵구 세포 빈도를 유세포 분석법으로 분석한 결과, 전체 백혈구 집단의 약 4분의 1이 백혈병 세포로 구성되어 있음을 알 수 있습니다.T 및 B 림프구 빈도는 대조군과 C1498 주입 동물 간에 비슷하게 나타납니다. 그러나 단핵구 빈도는 급성 골수단핵구성 백혈병의 특징적으로 C1498 주입 마우스에서 더 높은 수준으로 관찰됩니다. 세포화학 및 May-Grunwald Giemsa 과정을 수행할 때는 적절한 pH 값, 온도 및 배양 시간을 유지하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후에는 급성 골수단구성 백혈병을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술의 개발 이후, 혈액학 분야의 연구자들은 다른 동물 모델에서 자발성 및 유도성 급성 백혈병의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

bm12 림프구가 C57BL/6 수용자로 이식되는 것은 전신 홍반성 루푸스의 확립된 모델입니다. 여기에서는 이 모델을 사용하여 질병을 시작하는 방법과 유세포 분석을 통해 T 여포 보조 세포, 생식 중심 B 세포 및 형질 세포를 특성화하는 방법을 설명합니다.

C57BL / 6 마​​우스의 전신 홍 반성 루푸스의 BM12 유도 성 모델 (SLE)

이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

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뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

이 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계(HIS) 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 이 모델에 이식된 인간 종양에 대한 인간 면역치료제를 시험하기 위한 이 모델의 사용에 있어서의 지침 및 고려사항은 종양에 대한 인간 면역계의 반응을 특성화하는 것에 중점을 두고 제시된다.

인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트

여기서, 백혈병 세포의 복강 내 주사는 마우스에서 급성 골수성 백혈병(AML)을 확립하고 전파하는 데 활용됩니다. 이 새로운 방법은 AML 세포의 연속 이식에 효과적이며 생쥐에서 정맥 주사에 어려움과 불일치를 경험할 수 있는 사람들을 위한 대안이 될 수 있습니다.

생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

이 프로토콜은 유도 화학 요법에 대한 반응의 역학을 기반으로 급성 림프구성 백혈병의 재발을 생성하기 위한 마우스 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다.

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

배우세요 C1498 세포와 급성 골수모구백혈병을 특성화하는 방법을 마우스 모델에서. 유세포측정법과 세포화학염색을 활용하여 백혈병 기전과 면역결핍을 연구하고 새로운 치료제를 테스트합니다.

쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

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