Name: 대한 유전 및 생화학 적 접근 생체 및 체외 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 배우세요 라이아노딘 수용체 올리고머화를 평가하는 유전 및 생화학적 방법을 통해 심장 부정맥의 분자 메커니즘을 연구하세요. 이 기법은 단백질 상호작용 분석에 필수적입니다.

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이 작품은 SZ (FS / 08 / 063과 FS가 / 15 / 3만1천4백94분의 30)에 영국 심장 재단 연구비에 의해 지원되었다.

<ol><li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li>
<li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li>
<li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li>
<li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li>
<li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interactions%3A+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li>
<li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast%3A+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li>
<li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies%3A+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li>
<li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li>
<li>Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElion%2C+EA+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2007).</li>
<li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKingston%2C+RE+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22">Curr Protoc Mol Biol</a>. , (2003).</li>
<li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+%28TPC%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
<li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li>
<li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+125%22%5BJournal%5D)">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li>
<li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+oligomerization%3A+how+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li>
<li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+oligomerization%2C+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li>
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<li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution%3A+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li>
<li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li>
<li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors%3A+biochemical+and+biophysical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li>
</ol>

저자는 선언 아무 상관이 없습니다.

단백질 호모 올리고머의 형성은 전사 인자, 효소, 이온 채널과 수용체 (25), (26)의 활성을 조절하는 중요한 생물학적 과정이다. 중요한 것은, 단백질 올리고머는 신경 퇴행 및 부정맥 심장 질환 4,27을 포함한 병리학 적 의미를 가지고있다. 이 문서에 설명 된 방법은 단백질 자체 협회 및 올리고머를 매개 도메인 - 도메인 상호 작용을 식별하는 데 사용됩니다. 다음, 우리는 각 프로토콜 내에서 중요한 단계를 가리, 우리는 중요한 고려 사항, 제한 사항 및 문제 해결에 대해 설명합니다. Y2H 시스템은 잠재적 상호 작용 단백질로 인해 상대적으로 높은 처리량 스크리닝 파트너, 사용의 용이성 및 높은 재현성 결과 화면 먼저 채용 될 수있다. Y2H 절차는 표준 (판 또는 통) 인큐베이터 룸 봉쇄 설비와 미생물 실험실에서 수행된다. FR의 사용β-갈 분석에서 최상의 결과를 위해, 갓 (구 오일까지) 효모 식민지를 성장 (단계 1.2.3)를 사용한다 반면 eshly 준비 유능한 세포 (단계 1.1.8), 고효율 효모 변환을위한 중요합니다. GAL4 및 / 또는 추가 / 대체 리포터 유전자 이외의 다른 전사 인자를 기반으로 시스템을 사용할 수 있습니다, 따라서 미끼 먹이 플라스미드은 해당 Y2H의 변형과 일치해야합니다. 몇몇 균주가 HIS3 리포터 유전자 7,8 중 항시 발현을 해소하기 위하여, 3- 아미노 -1,2,4- 트리아 졸 상기 HIS3 단백질의 경쟁적 억제제의 존재 하에서 배양한다. 미끼 및 대상 융합 단백질의 발현은 17 면역 블에 의해 확인해야합니다. 케이스 미끼 / 먹이 융합 단백질이 효모에 독성이 낮은 허용 단백질 수준 미끼 / 먹이식이 다른 프로모터에 의해 구동되는 다른 벡터의 클로닝에 의해 달성 될 수있다. 또한, t를 위해 필수적모자 미끼 / 먹이 융합 단백질은 자율 리포터 유전자 활동을 표시하지 않습니다. 자율 리포터 유전자가 활성화, 또는 이들 단백질에 대한 테스트 GAL4 DNA-BD와 AD 융합체를 바꾸면 담당 영역을 제거하는 구조를 수정하여 구조 될 수있다. 그들은 세포 내 막 구획에서 미스 폴딩 또는 융합 단백질의 mislocalization을 유도 할 수 있기 때문에 또한, 횡단 도메인은 더 나은 미끼 / 먹이 구조에서 생략됩니다. 실제로, Y2H 시스템의 주요 단점은 미끼 및 대상 단백질-위양성 또는 위음성 상호 작용 6-9의 결과, 특정 번역 후 변형이 부족한 거리에 자신의 생리 세포 내 위치에서 잠재적으로 효모 핵에 지역화 된 것입니다 . 이종 포유 동물 발현 시스템은 형태, 번역 후 변형 및 세포 내 편재 용어 포유 동물 세포막 단백질의 연구에 더 적합하다.가장 널리 사용되는 세포의 형질 전환 방법 중 하나는 주로 때문에 최소의 장비, 인산 칼슘 침전하고 시약은 11, 15을 요구했다. 다른 방법, 즉, 전기 천공, 리포좀과 양이온 성 지질 중합체는, 세포주에 따라 높은 형질 전환 효율이 수득되며 사용한 구성 할 수있다. 일반적으로, 형질 감염 효율에 영향을 미치는 주요 요인은 플라스미드 DNA의 품질과 셀 건강 / 생존이다. 높은 순도 (260 나노 미터의 / 280 ㎚ ​​흡광도 비가 1.8)과 적극적으로 분열하는 세포의 플라스미드 DNA를 사용할 때 최상의 결과가 달성된다. 외래 DNA를 수행하는 능력은 매체 (11)에 노출 된 세포의 표면 영역과 관련되어 있기 때문에, 70 % 합류 (단계 2.1.2) - 세포 따라서 더 60보다 형질한다. 또한, 형질 전환 (단계 2.1.3) 동안 배지에서 항생제의 포함은 증가 세포 사멸 (15)로 인해 권장되지 않습니다. 에프인산 칼슘 배속 HBS 용액 (단계 2.1.1)의 특별한주의 제조하고 (정확하게 7.05) pH 조정 석출 및 플라스미드 DNA / 칼슘 / 격렬하게 혼합한다 (단계 2.1.5)에 의하여 인산 착물을 적절히 형성하거나 고효율 형질 전환을위한 중요한 단계. 일반적으로, 24 내에서 일시적인 형질 피크에 의해 단백질 발현 - 72 시간. 세포가 수확되면, 이후의 절차는 단백질 분해 효소 활동을 최소화하기 위해 4 ° C에서 수행되어야하며, 프로테아제 억제제를 첨가하는 것이 좋습니다. 세포 균질화는 염색체 DNA 용액의 점도를 증가시키고, 비특이적 결합을 향상시킬 수 있기 때문에 핵을 제거하기 위해 원심 분리 단계에 이어한다. 따라서, 삼투압 버퍼의 기계적 수단에 의한 균질화는 보통 (0.3 M) 또는 수크로오스 (150 mM)을 염화나트륨으로 바람직하다. 일반적으로, 수 크로즈 계 버퍼 단백질 안정성을 향상시키고 잠재적 비원 단백질 응집을 감소시키기 위해 알려져 있지만, P에 의한단백질 표면에 조 수화 정전 단백질 - 단백질 상호 작용을 선호한다. 반대로 염계 버퍼 따라서 소수성 상호 작용을 기반 (28)을 향해 바이어스를 갖는 단백질의 표면 상에 대전 된 아미노산 사이드 그룹의 순 전하에 영향을 미친다. 공동 IP 특히 천연 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 생화학 분석이다. 주요 단점은 IP에서 사용 10,16,18를 면역 블에 대한 검증 매우 특이 항체에 대한 요구 사항입니다. 따라서, 재조합 단백질은 종종 펩티드 에피토프와 태그, 예., 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (YPYDVPDYA) 또는 인간 cMyc (EQKLISEEDL)를하는 높은 친화도 특이 항체가 시판되고있다. 원한다면, 항체 immunoprecipitating 화학적 공침 PR 가릴 수있는 면역 단계에서의 용출 및 검출을 방지하기 위해 단백질-A 수지 상에 접합 될 수있다otein (16); 이를 위해, 우리는 성공적 화학적 가교제 3,3&#39;- 디티 오비스 (sulfosuccinimidylpropionate) (24)를 사용했다. 이는 적절한 세제는 IP 버퍼에 포함 균질화 세포의 불용성 물질은 비 - 특이 적 결합 (단계 3.1.3)를 최소화하기 위해 원심 분리에 의해 제거되는 것이 필수적이다. 실질적으로 결합 비특이적을 줄일 강한 세제​​ 및 / 또는 높은 농도뿐만 아니라 X 폐지 할 수있다 : 선택과 세제의 농도는 중요한 고려 사항이다 약한 상호 작용이 관찰 될 수있다 Y 단백질 상호 작용, 낮은 농도 또는 온화한 세제 반면를 수 있지만, 과도한 비특이적 결합을 초래한다. . 1 % 농도 - 중간 강도 세제는 예를 들면, 트리톤 X-100 0.5이 바람직하다. 또한, 비 - 특이 적 결합 중성 단백질을 줄이기 위해 (예를 들어, 100 μg의 / ㎖의 소 혈청 알부민)은 IP 버퍼를 포함 할 수 있고, 및 / 또는 세포 용 해물은-cleare 미리 수혼자 단백질-A 수지와 사전 배양과 라. 세척의 수는 X에 최적화되어야한다 Y 쌍 테스트, IP 버퍼 (단계 3.1.9)와 일반적으로 3 10 분 세척을. 임의의 경우에, immunoprecipitating 항체 비 - 면역 IgG를 가진 공동 IP 샘플은 항상 음성 대조군 (단계 3.1.6)를 게재 병렬로 처리한다. 화학적 가교의 주된 이점은 단백질 호모 올리고머의 화학 양론 조성에 통지한다는 것이다. 그것은 어떤 특수한 장비를 필요로하지 않으며이 상호 작용 단백질 19, 20 사이의 열적 및 화학적으로 안정하고 가교를 생성하기 때문에 글루 타르 알데히드는 일반적으로 사용되는 가교제이다. 들이 화학 반응을 종결하기 때문에 유리 아미노 그룹을 갖는 화합물을 분석 완충액 (단계 3.2.1)에서 생략되어야한다. 글루 타르 알데히드 농도 및 반응 시간 (단계 3.2.4)가 관심 올리고머 단백질 복합체에 대해 최적화되어야한다. 이 기술, especi의 주요 단점전체 세포 제제에서 수행 아군 때 생물학적 중요성 부족 인공 단백질 응집체를 생성 할 수있는 화학 반응의 비 특이성이다. 생체 내에서 대체 (예., 형광 공명 에너지 전달, 이중 분자 형광 또는 발광 보완) 및 시험 관내 기법 (예., 크기 배제 크로마토 그래피, 분석 초 원심 분리, 등온 적정 열량)은 단백질 자체 협회 평가 특성화 사용할 올리고머 화학 양론 29, 30의. 각 방법은 그 자체의 장점 및 단점을 가지며, 이는 단백질 정제 / 안정성 장비 / 시약의 가용성에 따라, 특정 단백질의 연구에 더 적합 할 수있다. 세부 사항, 즉 Y2H 공동 IP 및 가교 여기에 기술 된 세 개의 상보 적 방법은, RyR2 호모 oligome 대한 강력한 증거를 제공하기 위해 조합하여 사용되어왔다격리 및 살아있는 세포 내에서 R 형성.

골격과 심장 근육의 수축 RyR에 의해 매개 근질 세망 칼슘 2 + 릴리스에 의해 트리거됩니다. 4 개의 동일한 서브 유닛으로 구성 기능 채널 세 포유 동물 RyR 이성체가있다. 각 서브 유닛 RyR 큰 세포질 규제 N 말단 부분 및 고 컨덕턴스 칼슘 기공을 형성하는 막 관통 도메인을 포함하는 작은 C 말단 부위로 구성된다. 이상 인트라 간 서브 유닛 상호 작용은 RyR 채널 기능 장애의 기초 및 신경 근육 및 심장 질환 1 초래한다. RyR 구조에 관련된 특정 도메인의 식별 및 특성 : 함수 관계는 RyR의 병태 생리의 이해 때문에 매우 중요하다. 전통적인 생화학 단백질 - 단백질 상호 작용을 기술들은 박테리아에서 생산 된 정제 된 단백질의 상당한 양을 필요로한다. 이것은 RyR 매우 큰 막 (P)의 경우에는 가능하지그 재조합 파편이 박테리아 발현 및 정제에 쉽게 의무가없는 반면 rotein는 ~ 5000 개의 아미노산으로 구성. 따라서, 진핵 숙주 세포를 포함하는 다른 발현 시스템들은 포유 동물 세포막 단백질이 요구된다. 우리는 이전에 집합 N 말단 테트라은 세 포유 동물 RyR가 2,3 이소 폼에 걸쳐 보존하는 구조적 기능이 있음을 입증하는 Y2H, 공동 IP 및 가교 시험 법을 사용하고있다. 중요한 것은, 우리는 부정맥 심장 질환과 관련된 하나의 점 돌연변이는 N 말단 자체 협회 및 장애 RyR 채널 4의 결과를 방해 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 RyR 세포질 C- 말단 꼬리 5뿐만 아니라 동종 세포 내 칼슘 방출 채널의 N 말단, 이노시톨 1,4,5- trisphosphate 수용체 (2)의 올리고머 화 연구에 이러한 기술을 적용하고있다. Y2H 분석에서, interacti사이에 두 개의 단백질 (X 및 Y)는 기능적인 전사 인자 (GAL4) 리포터 유전자 6-9의 계속되는 활성의 재구성에 의해 측정된다. DNA 결합 도메인 (DNA-BD)를 / 단백질 X 융합 (미끼) 및 활성화 도메인 (AD) / 단백질 Y : 두 개의 다른 클로닝 벡터는 GAL4의 두 개의 물리적으로 분리 독립 도메인이 두 시험 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용되는 융합 (대상). Y2H은 단백질이 GAL4 DNA-BD와 같은 단백질의 AD 융합체를 생성하여 그 자체와 상호 작용하는지 여부를 테스트 할 수있다. 유전자 Y2H 균주합니다 (GAL80 단백질이 GAL4의 리프레입니다) 결핍 GAL4 및 GAL80을하는 수정뿐만 아니라 TRP1과 결핍는 Leu2로 (각각 미끼 먹이 플라스미드에 대한 영양 선택을 제공하기 위해). 효모 핵 재조합 DNA-BD와 AD 펩티드는 그들의 융합체 &#39;X 통해 하이브리드 GAL4 전사 인자 생산 물리적으로 근접하게된다 : Y의 INTeraction. 이 방법은 리포터 유전자 (β-갈 락토시다 제 (β-갈)에 대한 LacZ를 인코딩) 및 발색 (AN 히스티딘 생합성에 필요한 효소를 HIS3 인코딩) prototrophic의 병렬 전사 활성화를 통해 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 신속 유전자 검사를 할 수 있습니다. Y2H의 주요 장점은 심지어 약하거나 과도 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 생체 내 분석법이 있다는 것이다. 또한, 검출은 미끼 및 대상 단백질의 정제 또는 특정 항체의 생성을위한 필요없이 간단한 (미디어 부족 히스티딘에서) 성장을 선택의 사용 또는 비색의 (β-갈) 분석을 포함한다. 또한 Y2H 또한 라이브러리 단백질의 cDNA의 직접 액세스를 제공하는 베이트 단백질의 신규 결합 파트너에 대한 임의의 알려지지 클론 (GAL4의 AD에 융합 된 cDNA 라이브러리 클론)의 컬렉션을 스크리닝하는데 사용될 수있다. Y2H 관측을 확장하려면, independENT 생화학 기법이 사용될 수있다. 공동 IP 면역 및 결합 가교 검정 복합 시료 혼합물 단백질 연관을 검출하도록 사용되는 방법, 예를 들면., 전체 세포 용 해물 (10)이다. 그들의 주요 장점은 재조합 단백질의 사용을 필요로하는 다른 방법과 달리, 기본 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한보고한다는 것이다. 재조합 단백질은 일반적으로 그들의 정확한 형태 및 번역 후 변형을 가질 가능성이있는 포유 동물 세포주뿐만 아니라, 세포 내 자국어로 표현을 사용할 수있다. CO-IP 및 가교 시험 관내 분석은 균질 세포의 활용에 있기 때문에 그러나, 두 파트너 단백질이 그대로 전지 (11)에서 공동화되어 있는지 여부를 확인할 필요가있다. 우리는 일상적으로 일시적으로 칼슘 포스페이트 침전 법 2를 사용하는 포유 동물 세포막 및 세포질 단백질을 발현하는 포유류 HEK293 세포의 형질 감염을 사용-4,12-14는 여기에 상세하게 설명했다. 이것은 효과적으로 균체 내에 플라스미드 DNA를 전달하는 저렴한 방법이지만 특정 사용한 세포주 및 세포 합류뿐만 아니라 플라스미드 DNA 11, 15의 순도에 의존한다. 공동 IP 분석은 추정 작용 파트너 10,16의 CO 정화를 가능하게 비 - 변성 조건하에 세포 용 해물로부터 관심 천연 또는 재조합 단백질의 분리를 포함한다. 두 개의 상이한 에피토프 다른 두 융합체를 생성함으로써 단백질 자체와 상호 작용하는지 여부를 테스트하는 것이 이용 될 수있는 두 개의 독립 항체의 사용, 단백질 X의 분리를위한 immunoprecipitating 항체 및 단백질 파트너 Y.의 검출을위한 면역 항체를 필요 태그 (예., HA 및 cMyc). immunoprecipitating 항체 단백질-A에서의 Fc 영역을 결합 (단백질 G, 항체가 발생 된 동물의 종에 따라 OR)되는아가로 오스 (또는 세 파로스)를 수지에 접합된다. 단백질 X는 항체에 의해 침전되어 단백질 수지 파쇄 균질화 셀 즉 세제 가용 분획과 인큐베이션 다음. 단백질 면역 복합체는 SDS 완충액을 함유이어서 SDS-PAGE로 분석 한 결과, 단백질의 존재 Y (17)를 검출하기 위해 항체를 사용하여 면역 블 용출된다. 공동 IP 과도한 비 - 특이 적 결합을 방지하기 위해 세제 수용성 단백질로 수행되어야한다. Y 쌍 10,16,18 : 세제 및 농도의 선택뿐만 아니라, 세척 횟수, 각 X에 대해 최적화되어야한다. 가교 올리고머는 단백질 복합체의 화학량 론을 결정하기 위해 사용된다. 이것은 인접한 상호 protomers 간의 공유 결합을 생성하는 화학 반응에 기초하고, 따라서, SDS-PAGE 분리 중에 단백질의 올리고머 상태의 보존을 가능하게한다. 다수의 가교 reage이 있습니다단백질, 일반적으로 주 아민, 카르 복실 또는 티올 그룹에 서로 다른 반응 그룹을 대상으로 다양한 길이 및 화학 국세청. 여기서, 우리는 글루 타르 알데히드의 사용을 설명 (OHC (CH 2) 3 CHO), 리신 잔기 (19, 20)에 존재하는 유리 아미노 그룹과 반응 양단에 두 개의 알데히드기를 가진 호모 이관 능성 가교제. 가교 결합은 부가 형성에 기인하는 농도 - 또는 시간 의존적으로 이어진다. 글루 타르 알데히드의 반응은 히드라진 (H 2 NNH 2) 단백질 시료 후 SDS-PAGE 분석 및 올리고머 화 상태를 평가하기 위해 17로 면역 블되어 정지된다. 우리는 올리고머를 유도하지 않는 가교를 참고하지만 단순히 기존의 단백질 복합체 사이의 안정된 다리를 작성해야합니다. 가교 실험을 수행 중요한 고려 가교제의 농도와 반응 시간 (19, 20)의 선택을 포함한다.

<table><tbody><tr><td>PART 1 효모 2-하이브리드</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 인큐베이터</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>30°C에서 사용됨; C</td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커 인큐베이터</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>30°C에서 사용; C 230 - 250 rpm에서 흔들림 분</td></tr><tr><td>광 광도계</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio +</td> <td>효모 배양의 OD600를 측정하기 위해; 액체 b-Gal 분석에서 420 nm에서 흡광도를 측정하기 위해</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>미끼 벡터 pGBKT7, 먹이 벡터 pACT2&nbsp; 및 효모 균주 Y190&nbsp;</td></tr><tr><td>효모 질소 기반</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>최소한의 SD 성장 매체를 준비하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>류신과 트립토판이 부족한 드롭아웃 보충제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>최소한의 SD growh 매체를 준비하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>류신, 트립토판, 히스티딘이 부족한 드롭아웃 보충제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>최소한의 SD growh 매체를 준비하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>청어 고환 운반체 DNA&nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>효모 변형용</td></tr><tr><td>Whatman 여과지 5등급&nbsp;</td><td>콜로니 리프트 여과지 b-Gal 분석에 사용하기 위한</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside)</td><td>콜로니 리프트 여과지 b-Gal 분석에 사용하기 위한</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>액체 b-Gal 분석</td></tr><tr><td>에 사용<강한>2부. 포유류 세포주에서 단백질 발현</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 세포주</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; &nbsp; CRL-1573&트레이드;</td><td></td></tr><tr><td>가습 인큐베이터 (5 % CO2, 37 &deg; C)</td> <td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>포유류 세포를 배양하려면</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle's medium)</td> <td>Invitrogen (ThermoFisher)</td> <td>41966</td><td>포유류 세포의 성장 배지를 준비하려면</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td> <td>10500</td><td>포유류 세포의 성장 배지를 준비하려면</td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>세포를 균질화하려면</td></tr><tr><td>바늘 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>세포를 균질화하기 위해</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (완전한)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>단백질 분해를 방지하기 위해</td></tr><tr><td>PART 3. 체외 생화학적 방법&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE 시스템)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 위해</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>전기영동 전송용</td></tr><tr><td>컴팩트 X-ray 필름 프로세서</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>면역 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>화학적 교차 연결</td></tr><tr><td>단백질-A 세파로스 비즈에 사용&nbsp;</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>co-IP 분석에 사용</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>co-IP assay에 사용하기 위한</td></tr><tr><td>비면역 토끼 IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Co-IP 분석에 사용</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 마우스 단클론 IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>면역 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 마우스 단클론 IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>면역 블로팅</td></tr><tr><td>안티 마우스 IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td>에 사용 <td>sc-2005</td><td>면역 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>하이퍼 필름 ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>면역 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>면역블로팅에 사용</td></tr></tbody></table>

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 ryanodine 수용체 사례 연구

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

올리고머화는 종종 단백질이 특정 세포 기능을 수행하기 위한 구조적 요구 사항입니다. 예를 들어, 리아노딘 수용체(RyR)의 사합체화는 기능적 Ca2+ 방출 채널 공극의 형성에 필요합니다. 여기에서는 효모 2-하이브리드(Y2H), 공동 면역침전(co-IP) 및 화학적 가교 분석을 포함하여 단백질 자가 결합 평가를 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. Y2H 시스템에서 단백질 자가 상호 작용은 GAL4 미끼 및 테스트 단백질의 표적 융합을 공동 발현하는 효모의 β-갈락토시다아제 분석에 의해 감지됩니다. 단백질 자가 상호 작용은 포유류 HEK293 세포에서 동시 발현된 테스트 단백질의 HA 및 cMyc 태그 융합을 사용하여 공동 IP에 의해 추가로 평가됩니다. HEK293 세포에서 발현된 후 가교 결합 및 SDS-PAGE 분석을 통해 단백질 호모올리고머의 정확한 화학량론을 조사합니다. 이러한 서로 다르지만 보완적인 기술을 사용하여 우리는 RyR N 말단 도메인의 자기 결합을 지속적으로 관찰하고 사량체를 형성하는 고유한 능력을 입증했습니다. 이러한 방법은 다른 포유류 적분막 단백질의 단백질-단백질 상호 작용 및 호모-올리고머화 연구에 적용할 수 있습니다.

Y2H 시스템에서, 미끼 : 먹이 상호 작용은 초기에 부족한 배지에서 효모의 성장 선택 (트립토판, 류신 등) 히스티딘에 따라 시험 할 때, 그 후 β-갈 효소 활성 분석 (그림 1)에 의해 평가. 먹이 단백질 상호 작용 : 중간 부족 히스티딘에서 배양 효모는 미끼의 강도에 따라 느린 성장 속도를 가지고있다. β-갈 분석은 효모에서 수행된다 후자의 항복 정량 결과, 중 고체 지지체에 (판 한천) 또는 액체 문화에서 성장 (배지에서 배양는 트립토판과 류신이 부족). 우리는 성공적 RyR2 도메인 내의 도메인의 상호 작용뿐만 아니라 신규 단백질 파트너 2-4,12,21,22를 식별 Y2H을 사용했다. 예를 들어, 우리는 N 말단 단편과의 상호 작용에 대한 RyR2 펩티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 중첩 구조의 일련의 스크린 (AD4L : RyR2 잔기 1-906 GAL4 AD의 융합). (906) GAL4 융합 - AD4L 자체로, 즉 BT4L 1 (RyR2 잔류를 구성하는 상호 작용하는 것을 보여주는, AD4L 쌍 (그림 2A) : 3 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석은 선명한 블루 컬러 만 BT4L에 대한 효모 식민지를 생산 DNA-BD). 효모 다른 구조와 공동으로이 변환 된 반면, AD4L 쌍의 극단적 인 C 말단 도메인 (BT8)와 보조 약한 연결을 제안 흰색과 미끼 따라서 부정적인 남아​​ : 창백한 푸른 식민지는 BT8 검출 된 먹이 단백질 상호 작용. 액체 β-갈 분석 (그림 2B)에 의해 얻어진 정량 결과, 강력한 BT4L 표시 :는 p53의 단백질 (pVA3)와 SV40 큰 T 항원 (pTD1) 사이의 알려진 협회 강도 AD4L 상호 작용 상당을 BT8 반면 : AD4L 상호 작용 상당히 약한 (&lt;10 % 제어에 비해)했다. 우리는 정기적으로 공동 IP 실험 (그림 3) F를 수행독립적 인 생화학 적 분석 등의 포유 동물 세포 라인 (HEK293)에 일시적 발현을 따르게하는 것은 Y2H 결과 2-4,12-14,21-24을 강화합니다. RyR2 N 말단의 자기 상호 작용을 확인하기 RyR2 잔기 인코딩 두 개의 플라스미드 1-906가 어느 cMyc 또는 HA 펩티드 에피토프 (각각 BT4L 및 AD4L) 태그, 인산 칼슘 침전 법을 이용하여 HEK293 세포로 공동 형질 감염시켰다 3. 균질화 된 세포의 후 핵 분획 세제 CHAPS 가용화시키고, 불용성 물질은 세포 용 해물을 생성하기 위해 원심 분리에 의해 제거 하였다. 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 된 세포 용 해물은 다음 HA-태그 AD4L을 면역 침전 AB를 HA 단백질-A 세파 로즈 비드와 함께 배양 하였다. 버퍼 SDS가 함유 용출 공동 IP 샘플, Ab의 HA와 Ab의 cMyc, 연구와 면역 블에 의해 두 개의 별도의 SDS-PAGE 젤 (1/10 일 9/10 일 분할)에로드 분석 하였다espectively. Ab의 HA에 의해 AD4L의 성공적인 직접 IP (~ 100 kDa의)이 아닌 비 - 면역 토끼 IgG에 (도 4a)를 사용하여 음성 대조군으로, 면역에 의해 확인되었다. 중요한 cMyc 태깅 BT4L (~ 100 kDa의)이 아니라 면역 AD4L (도 4b)의 부재 네거티브 컨트롤 만 구간 HA IP 회수 하였다. Y2H 공동 IP 분석법 RyR2 N 말단 자기 상호 작용 일관된 증거를 제공하지만, 그것은 단지 량체 이상의 복합체를 형성하는, 즉 여부 N- 말단 도메인의 올리고머 화 상태에 알리지 않았다. 이 복합체 해리 것을 주목해야만을 포함 소단위 단백질 - 단백질 상호 작용을 폐지 때문에 SDS-의 SDS-PAGE 및 열 유도 단백질 변성에 의해 검출 될 것이다. 이것을 극복하기 위해, 우리는 화학적으로 안정 기존 PROTEI을 conjoins 가교 (도 5)를 사용하여그 분자량 후 SDS-PAGE 크기 분리 2-5에 의해 검사 될 수 N 올리고머. 예를 들어, 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 cMyc-BT4L를 발현하는 HEK293 세포의 파쇄 액은 글루 타르 알데하이드 및 순이 cMyc (도 6)을 이용하여 SDS-PAGE 및 면역 블 롯팅 분석. RyR2 N 말단 테트라 형성 셋을 나타내는 단량체 (~ 100 kDa의) 시간 의존적으로 검출 하였다 ~ 400 kDa의 높은 분자량의 단백질 밴드 이외에. 특히, 테트라 최소한의 이량 체 관찰 삼량 밴드, 지배적 인 올리고머 종이었다. 15 % 구배 SDS-PAGE 겔 3 - 겉보기 분자 질량을 결정하기 위해, BT4L 올리고머 (4)를 통해 분리 하였다. 우리는 (30)의 범위와 단백질 표준을 사용하여 분자량 / 겔 위상차 표준 곡선 제작 - 460 kDa 이상을, 우리는 358 kDa의 15로 올리고머 계산 (N = 4). 이 겉보기 분자량이 배치 된 BT4L 량체와 일치기본 RyR2 채널 내에서 네 개의 서브 유닛의 배치에서 예상대로 오히려 선형 형태보다 폐쇄 순환 방식. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> 그림 1. Y2H 순서도. 효모, 공동 형질 전환 미끼 및 대상 플라스미드와 함께, 매체 부족한 히스티딘의 성장으로 선택 및 / 또는 β-갈 효소 활성에 대해 분석한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> 도 2는 Y2H RyR2 N 말단 도메인 자기 상호 작용을 의미한다. (A)에 대한 회로도 Y2H 시스템 시험 인간 RyR2 중첩 단백질의 단편 (미끼) 계열 묘사<html> RyR2 N 말단 AD4L (먹이) 구조와의 상호 작용. 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석에 의해 얻어진 성적 결과는 &quot;+&quot;배수 또는으로 표시됩니다 &quot;-&quot;부정적인 상호 작용을 양성 대조군에 대해 정규화 (B) 양이 액체 β-갈 분석을 (pVA3은 GAL4 DNA-BD에 대한 인코딩합니다. p53의 단백질과 융합, pTD1)는 SV40 큰 T 항원과 GAL4의 AD 융합을위한 인코딩합니다. 3에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> 도 3 공동 IP 순서도. 포유 동물 세포의 공동 형질 플라스미드의 X 및 Y로는 균질 세제 - 가용화 SDS-PAGE 및 면역 하였다 공동 IP 분석에 사용 된 세포 용 해물을 생성한다.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> 그림 4. 공동 IP는 포유 동물 세포에서 RyR2 N 말단 도메인 자체의 상호 작용을 나타냅니다. HEK293 세포 (BT4L) cMyc - 태그 및 HA가-태그 (AD4L) RyR2 N 말단 도메인의 과도 공동 식 (대한 공동 형질 감염시켰다 잔류 물 1-906). 음성 대조군으로서, 공동 IP 분석은 비 면역 된 토끼의 IgG로 수행 된 반면 AD4L는, CHAPS 및 디티 오 - 가용화 처리 HEK293 파쇄물 순이 HA로 면역 침전시켰다. 면역 침전 된 단백질을 5 분 동안 85 ° C로 가열 1/10 번째 또는 IP 시료 9/10 번째 로케이션 별도 6 % SDS-PAGE 젤을 통해 3 시간 동안 20mA에서 해결되었다. polyviny 상에 2 시간 동안 80 V에 따라 단백질 전송Ab의 HA (A) 또는 순이 cMyc 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 마우스 IgG이어서 각각 (B), (1 : 10,000 희석) 및 향상된 화학 발광 검출 : lidene 디 플루오 라이드 멤브레인은 면역 블 분석 (1000 희석 1)를 사용하여 행했다 (1 분 노출). 세포 용 해물의 분취 량은 IP 샘플 처리 체적의 1/50 번째는 또한 분자량 표준을 제공하기 위해 포함되었다. 3에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> X 플라스미드로 형질도 5 가교 순서도. 포유 동물 세포는 SDS-PA,이어서 균질화 및 가교 결합 분석에서의 글루 타르 알데히드와의 반응을 실시GE와 면역입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> 그림 6. 크로스 링크는 RyR2 N 말단 도메인 테트라 머 형성을 나타냅니다 HEK293 세포 cMyc-태그 (BT4L) RyR2 N 말단 도메인의 일시적 발현 (잔류 물 1-906)에 대한 형질 감염시켰다.. 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 세포 파쇄는 표시된 시간 점을 글루 타르 알데히드와 함께 배양 하였다. 샘플을 5 분 동안 85 ℃에서 가열하고 3 시간 동안 20mA에서 SDS-PAGE (6 % 겔)에 의해 해결되었다. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 마우스 IgG (1,이어서 (1000 희석 1) 순이 cMyc을 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 막 상에 2 시간, 80 V에서 단백질 이동에 따라, 면역 블 분석을 이용하여 수행 하였다 :10,000 희석) 및 향상된 화학 발광 검출 (1 분 노출). 단량체 (M : ~ 100 kDa의) 및 테트라 (T) 형태가 화살표로 표시됩니다. 3에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

효모 투하이브리드(yeast two-hybrid), 공침강(Co-immunoprecipitation) 및 화학적 가교 결합(chemical cross linking)이라는 세 가지 상호 보완적인 실험 기법의 전반적인 목적은 단백질-단백질 상호작용, 특히 자가 결합(self-association)을 평가하고 단백질 동종 올리고머의 화학 양론적 조성을 결정하는 것입니다. 이러한 방법들은 심장 부정맥 및 급사의 근원이 되는 초건성 수용체 올리고머화(ultra-dry receptor oligomerization)와 같이 심장질환 분야의 핵심적인 질문에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 최소한의 장비와 시약만으로도 상대적으로 높은 처리량의 스크리닝이 가능하고 사용이 간편하며 결과의 재현성이 매우 높다는 점입니다.이러한 기술들은 항부정맥제의 분자적 작용 기전을 규명하는 데 도움이 되므로, 부정맥성 심장 질환의 치료로 그 응용 범위가 확장됩니다. 일반적으로 공동면역침전법(Co-immunoprecipitation)을 처음 접하는 연구자들은 원심분리 단계에서 상층액을 흡입할 때 크기가 매우 작은 단백질 아가로스 비드를 실수로 버려 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 효모 이중 잡종 분석법(yeast two-hybrid assay)에서는 형질전환을 위해 대수 성장기 중기의 효모 세포를 사용합니다.원심분리를 통해 세포를 수확하고, 각 펠릿을 5 mL의 멸균수에 다시 현탁한 후 세포 현탁액을 하나로 모읍니다. 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 버린 후, 효모 펠릿을 새로 준비한 멸균 1x lithium acetate 및 TE 1 mL에 다시 현탁합니다.로 컴피턴트 효모 세포는 준비 후 1시간 이내에 사용해야 합니다.베이트(bait) 및 타겟 플라스마 DNA를 100 µg의 청어 정소 캐리어 DNA와 혼합하여 플라스미드 샘플을 준비합니다. 각 1.5 mL 튜브에 수용성 효모 현탁액 100 µL와 1X 리튬 아세테이트 및 PEG 용액 600 µL를 넣고 약 30초 동안 볼텍싱합니다. 30 °C에서 30분 동안 흔들어주며 배양합니다.80 µL의 dimethyl sulfoxide를 넣고 가볍게 뒤집어 잘 섞습니다. 2~3분마다 섞어주면서 42 °C 항온수조에서 15분 동안 열충격을 줍니다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 2분 동안 냉각시킨 후, 원심분리하여 효모를 회수합니다.각 세포 펠릿을 100 µL의 1X TE에 재현탁합니다. 베이트(bait) 및 타겟(target) 플라스미드 모두에 선택 압력을 유지하기 위해 세포를 적절한 최소 SD 배지 플레이트에 도말합니다. 플레이트를 뒤집은 상태로 30 °C에서 4~5일 동안 배양합니다. 효모 콜로니의 지름이 약 2 mm가 되면 본 분석을 수행할 준비가 된 것입니다.신선하게 조제한 Z buffer 및 X-gal 용액 2.5 milliliters를 깨끗한 100-millimeter 플레이트에 피펫으로 분주하고, 플레이트에 셀룰로오스 여과지를 넣습니다. 분석 대상인 효모 콜로니가 있는 새로운 여과지를 플레이트 표면에 올립니다. 핀셋을 사용하여 여과지를 플레이트 위에 부드럽게 문지르고, 콜로니가 부착될 수 있도록 약 5분 동안 그대로 둡니다.적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서, 여과지를 조심스럽게 들어 올려 액체 질소에 30초 동안 담급니다. 냉동된 여과지를 실온에서 2분 동안 해동합니다. 100mm 플레이트 내부에 미리 적셔둔 여과지 위에 콜로니 면이 위로 향하게 하여 여과지를 올리고, 청색 콜로니가 나타날 때까지 30°C에서 배양합니다.형질전환 하루 전, 다음 날 세포 밀도가 60~70%가 되도록 100mm 페트리 접시에 담긴 HEK293 세포에 배지를 공급합니다. 가습 배양기에서 16~18시간 동안 배양합니다. 형질전환 당일에 24 µg의 플라스미드 DNA를 60 µL의 2.5 M 염화칼슘과 멸균 탈이온수로 희석하여 최종 부피를 600 µL로 맞춥니다.볼텍스(Vortex)로 혼합합니다. 600 µL의 2X HEPES 완충 식염수가 담긴 50 mL 튜브에 플라스마 DNA-칼슘 용액을 계속해서 강하게 볼텍싱하며 한 방울씩 첨가합니다. 인산칼슘-플라스마 DNA 복합체가 형성되도록 실온에서 20분 동안 배양합니다.20분간 배양한 후, 짧게 볼텍싱하고, 용액을 HEK293 세포 위에 페트리 접시의 전체 표면적을 덮을 때까지 한 방울씩 첨가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 약 6시간 후, 성장 배지를 교체하고 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다.형질전환 24시간 후에 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 세포를 수확합니다. 세포 펠렛을 500 µL의 차가운 균질화 완충액에 재현탁하고, 세포 현탁액을 유리 구슬이 들어 있는 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 1 mm 주사기에 부착된 가는 바늘을 사용하여 얼음 위에서 세포를 균질화합니다.튜브 캡을 닫은 상태에서 바늘로 캡을 뚫고, 유리 비드를 통해 세포 현탁액을 격렬하게 분산시킵니다. 4°C에서 1500 ×g로 10분 동안 원심분리하여 핵과 파쇄되지 않은 세포를 제거합니다. 공동 면역침전 또는 가교 결합 실험에 사용할 포스트 핵 분획(post-nuclear fraction) 상층액을 수집합니다.이 절차를 시작하려면, 0.5% CHAPS를 사용하여 핵 제거 후 세포하 분획물을 가용화하고, 지속적으로 혼합하며 4 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 4 °C에서 20,000 ×g로 10분 동안 원심 분리하여 불용성 물질을 침전시킵니다. 상층액을 회수하여 보관합니다.이를 세포 용해물이라고 합니다. 프로토콜 본문에 설명된 대로 면역침전 완충액 내에서 protein-A agarose 비드를 준비합니다. protein-A가 포함된 튜브 하나에 1 µg의 면역침전 항체를 첨가합니다.음성 대조군으로, 다른 protein-A 함유 튜브에 1 µg의 비면역 IGG를 첨가하십시오. 4 °C에서 지속적으로 혼합하며 최소 2시간 동안 배양하십시오. 원심분리를 통해 비드를 회수하고, 피펫팅으로 상청액을 조심스럽게 제거하십시오.항체와 protein-A 비드가 들어 있는 두 개의 튜브에 각각 200 µL의 세포 용해물을 옮깁니다. 항원-항체 결합이 일어날 수 있도록 4 °C에서 계속 섞어주며 최소 2시간 동안 배양합니다. 비드를 회수하고 200 µL의 면역침전 버퍼로 세척합니다.혼합하며 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 세 번 세척한 후, 피펫팅을 통해 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 비드에 단백질 로딩 버퍼 30 µL를 추가하고 4 °C에서 1500 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.후속 SDS page 및 immunoblotting을 위해 앞서 언급한 co-IP 샘플이 포함된 상층액을 보관하십시오. 화학적 가교 결합(chemical cross-linking)을 수행하려면, 핵 제거 후의 세포 내 분획물을 원심 분리하여 단백질 응집체를 침전시키십시오. 상층액을 회수하여 20 µL씩 8개의 분주액으로 나누십시오.단 하나의 샘플에만 0.0025% (v/v) 글루타르알데하이드를 첨가합니다. 타이머를 시작하고 실온에서 지정된 시간 동안 글루타르알데하이드를 반응시킵니다. 정해진 시간이 되면 2% (v/v) 히드라진을 사용하여 글루타르알데하이드 반응을 중지시키고, 5 µL의 5X 단백질 로딩 버퍼를 첨가하여 단백질을 변성시킵니다.AD4L 및 말단 단편과의 상호작용을 확인하기 위해, ryanodine receptor 펩타이드 서열 전체를 아우르는 중첩 구조물들을 대상으로 효모 이중-하이브리드(Yeast two-hybrid) 스크리닝을 수행하였다. 콜로니 리프트 여과지 beta-gal 분석 결과, BT4L/AD4L 쌍에서만 선명한 청색 콜로니가 나타나 AD4L이 스스로와 상호작용함을 보여주었다. BT8/AD4L 쌍에서는 옅은 청색 콜로니가 검출되어, 극단적인 C-말단 도메인과 이차적인 약한 결합이 있음을 시사하였다.액체 beta-gal 분석의 정량적 결과는 BT4L/AD4L 상호작용이 강력함을 나타냈으며, 이는 P53 단백질(pVA3)과 SV40 large T 항원(pTD1) 사이의 알려진 결합 강도와 대등한 수준이었습니다. BT8/AD4L 상호작용은 상당히 더 약했습니다. 이러한 효모 이중 hybrid 분석 결과는 포유류 세포주에서 HA-tagged AD4L과 cMyc-tagged BT4L을 일시적으로 발현시킨 후 수행한 공동 면역침전 실험을 통해 더욱 뒷받침되었습니다.항체 2 HA에 의한 HA 태그 AD4L의 직접적인 면역침전이 관찰되었으며, cMyc 태그 BT4L은 anti-HA 면역침전에서만 회수되었습니다. cMyc BT4L을 발현하는 세포 균질액에 화학적 가교를 수행한 후, cMyc 항체를 사용하여 SDS page 및 면역블로팅을 실시하였습니다. 100 kilodalton 단량체 외에도 약 400 kilodalton의 고분자량 단백질 밴드가 시간 의존적으로 검출되었으며, 이는 ryanodine 수용체 및 terminus 사량체 형성을 나타냅니다.인산칼슘 침전법을 이용한 포유류 세포 형질전환을 시도할 때, 플라스마 DNA 소비 용액을 매우 천천히 첨가하는 동시에 효율적인 공기 유입을 위해 커다란 튜브에 담긴 인산염 완충액을 지속적이고 강력하게 볼텍싱해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 절차 이후에 칼슘 이미징을 위한 공초점 현미경 검사와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 기술들은 살아있는 세포 내 ryanodine receptor 채널의 국소화 및 칼슘 방출 특성과 같은 추가적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 것입니다.이러한 기술들이 개발된 이후, 세포 신호 전달의 다양한 분야 연구자들은 전사 인자, 효소, 이온 통로 및 수용체의 활성을 조절하는 근본적인 생물학적 과정인 단백질 동질-올리고머화(homo-oligomerization)를 평가할 수 있게 되었습니다.

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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