Name: 를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립 대장균 휴대없는 전사 번역 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 학습하세요 비정규 아미노산을 모델 단백질에 잔류 특이적으로 삽입하는 무세포 발현 시스템을 이용한 방법입니다. 이 기술은 단백질 구조 및 기능 연구에 활용됩니다.

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E.G. Worst와 A. Ott는 공동 연구 센터 SFB 1027과 Saarland University 내의 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)의 재정 지원을 인정합니다.E.G. Worst, A. Ott 및 V. Noireaux는 Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO)의 재정 지원을 인정합니다. 저자는 비평적 독서를 해준 Tobias Baumann과 Stefan Oehm(베를린 공과대학교 화학연구소)에게 감사를 표합니다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

한 - 쉬운 -에 잔류 특히 단백질에 ncAAs를 통합 할 수있는 실행 가능한 전략으로 무 세포 발현 시스템을 사용하여 표시됩니다. 이 때문에, 조 추출물은 관심의 단백질 에너지 버퍼 대응 아미노산 벡터 DNA 코딩으로 보충된다. 원유 추출 나누어지는 볼륨이 조 추출물의 단백질 농도 (34)에 달려 있습니다. 무 세포 발현 효율은 벡터 DNA 구조의 농도에 따라 최적화된다. 에너지 버퍼 기기의 볼륨은 무 세포 발현 모델 단백질의 높은 수율을 가능하게하기 위해 최적화 및 MG-K-글루타메이트 농도의 함수로서 변화한다. 혼입 실험의 예비 평가는 미정 무 세포 반응 매질의 SDS-PAGE를 수행하여 얻을 수있다. 자세한 분석을 위해 HPLC-ESI 질량 스펙트럼을 완료 잔류 특정 incor를 확인하기위한 수단으로 제안미식 축구의의 poration. 후자에 대한 준비로서, 스핀 열 시스템은 그의 태그 정화를 활성화하고 우리는이 프로토콜에서 사용하는 작은 볼륨과의 교류를 버퍼링하는 데 사용됩니다. HPLC-ESI 질량 스펙트럼 포함한 전체 프로토콜 2 일 내에 수행 될 수있다. 그것은 어떤 특히 중요한 단계가 포함되어 있지 않습니다. 그러나 농도 MG-및 K-글루타메이트의 최적화뿐만 아니라 벡터의 같은 DNA 모델 단백질의 높은 수율을 표현하기 위해 매우 중요하다. 고효율 발현 벡터의 사용 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1이-gene_of_model_protein는-T500는 것이 좋습니다. 그의 - 태그 단백질의 용출로 인해 이미 다졸의 높은 농도 (&gt; 150 밀리미터) 등의 NaH 2와 같은 다른 염을 일반적으로 질량 분광 분석 (49) 높은 배경 잡음을 발생 PO 4 (&gt; 300 밀리미터) 또는 염화나트륨 (&gt; 50 밀리미터)입니다 . 적합한 단백질 저장 버퍼와 같은 용출 버퍼 교환 모델을 안정화 보호 자전거과 크게 질량 분광 분석시 배경 잡음을 줄일 수 있습니다. 결과적으로, 모델 단백질 내의 모든 여섯 위치의 Arg을 대체 할 수 있습니다. 발현 시스템에서, 어떠한의 Arg 잔기가 검출 될 수 없다. 이것은 더 고갈 전략 (29, 30)을 필요로하는 다른 발현 시스템에 비해의 Arg 유사체의 잔류 고유의 통합을 단순화합니다. 제시된 무 세포 접근 방식은 캔 독성에 기인 생체 접근 방법의 본질적인 한계, 또는 단일 단백질 생산 전략 24,31에서 mRNA의 순서에 강한 의존성을 우회. 체외 시스템에 사용되는 달리, 캔의 생체 내 분열은 호모 세린하고 hydroxyguanidine (31)를 발생 않습니다. 그러나, 무 세포 시스템은 HYL 같은 유사체과 경쟁리스 충분한 양을 유지한다. HPLC-ESI 질량 분광 분석 모델 단백질 양으로 C를 포함 도시anonical뿐만 아니라 다른 비율로 비정규 아날로그. 라이신 잔기의 특이 결합은 일반적으로 가능하지만, ncAAs 인식 용으로 최적화 완료 치환, 상기 공핍 전략 또는 특수하게 설계 및 Aars의 tRNA가 개발되어야 할 필요가있다. 우리는 정식 것과 같은 농도에서 NCAA를 추가하여 무 세포 발현, 변형 모델 단백질의 우수한 수율을 달성했다. 혼입 효율이 통합 될 수있는 NCAA의 성격에 따라 달라집니다. 더 높은 금리는 여전히 NCAA의 농도를 최적화함으로써 실현 될 수 있습니다. 제시된 결과는 그들이이 정규 내인성 번역 시스템에 의해 허용됩니다로 ncAAs의 잔류 특정 법인의 고용 시스템의 적용 가능성을 보여줍니다. 특정 ncAAs의 잔류 특정 법인의 경우, 하나의 추가 요구를 조사하는 경우 유사한 CAA의 distur의 잔류발현 시스템을 ㄱ. 무 세포 전사 번역 시스템은 다른 요구 (54)에 대응하는 다른 생물로부터 설계 될 수있다. 모든 E. 여기에 제시 무 세포 시스템의 대장균 전사 - 번역 기계는 박테리오파지와 E의 사용을 가능하게 콜라이 촉진제, 이들은 병렬로 캐스케이드 또는 연속적으로 (55)에 작용할 수있다. 일반적인 적용과 유용성이 방법은 아미노산의 독성 및 치료 응용 프로그램에 더 연구를위한 강력한 도구합니다.

유전 코드는 생물권 보편적이다. 때때로 셀레 노 시스테인 피 롤라이 신 1 또는 2에 의해 확장 20 표준 아미노산의 세트, 그것을 코드. 이 단백질에 접어 아미노산 사슬로 된 tRNA의 도움으로 유전자 코드 변환 리보솜이다. 정규 아미노산의 작용기는 번역 후 변형과 조합하여, 단백질 기능의 3,4- 매우 넓은 범위에 기여한다. 원칙적으로 인해 표준 아미노산의 제한된 기능에 제한이 더 혼입함으로써 극복 될 수 있고, 새로운 화학 새로운 기능 3,4- 있도록 비정규 아미노산 (ncAAs). 사이트 - 또는 잔류 별 통합 : ncAAs의 통합을위한 두 개의 보완적인 접근 방법이있다. 전자의 방법은 아미노 아실 tRNA의-신디사이저의 표준 세트 이후, 상당한 기술적 인 문제를 수반한다etases (Aars의)과의 tRNA는 내생 번역 기계와 상호 작용하지 않아야 직교​​ Aars의-tRNA의 쌍으로 확장해야합니다. 주의 깊은 설계에 기초하여,이 방법은 목적 단백질의 사이트에서 하나의 점 돌연변이로서 ncAAs를 포함한다. ncAAs의 부위 - 특이 적 결합은 유전자 정규 아미노산 (CAA), 5-9 코돈 보통 정지에 할당되지 않은 코돈에 의해 암호화된다. 이 방법은 오히려 전체 단백질의 10 ~ 13에 걸쳐보다 특정 사이트에서 기능의 변화를 수반한다. 반면, 잔류 별 통합은 정식 번역 기계에 의해 비정규 아미노산의 잘못된 인식에 의존합니다. 혼입 인해 Aars의 기질 특이성의 부족으로 발생한다. 코헨과 ​​동료 (14)의 작업을 기반으로 ncAAs의 잔류 고유의 통합은, 그 (것)들의 사이에서 중요한 응용 프로그램 3,10, 단백질의 바이오 직교 라벨 15-17하게되었다X 선 결정학 (18)에서 단백질 또는 구조 해명. 자연 Aars의 일반적으로 생체 잔류 특정 법인의 효율적인 등 구조적 NCAA를 통해 자신의 동족 아미노산을 선호 바와 같이 일반적으로 NCAA의 표준 아날로그를 합성 할 수없는 영양 요 발현 숙주가 필요합니다. 숙주 세포를 유사 CAA의 낮은 농도를 얻어 성장 배지에서 배양한다. 미식 축구와 연속적인 보완과 함께 그 피로는 여러 canonically 규정 사이트에서 모델 단백질로 NCAA를 통합하는 식 호스트를 강제로. 부위 특이 적 접근법과 대조적으로, 이는 일반적으로 상당히 19,20 단백질의 물리 화학적 성질을 변형 선도 전체 단백질 구조에 깊은 영향을 미친다. 그들은 많은 다른 PROT 혼입 된 바와 그러나 ncAAs 대부분은 발현 숙주 세 성장 억제제이다재조합 유전자 발현 동안 관심의 그 외에 고용주 식별 번호 (EIN). 이 명확하게 생체 내 접근을 제한한다. 독성 또는 단백질 구조에 강한 영향을 미치는 아미노산의 생체 혼입 특히 도전 남아있다. 그러나, 이러한 분자는 특별한 기능을 가진 단백질을 설계하기 위해 가장 유망한 중입니다. 한 가지 예는 독성, 비정규, 자연적으로 발생하는 L-카나 바닌 (canavanine) (수), L 아르기닌 (ARG) 선수의 아날로그입니다. 그것은 영향을 블록은 관련 규정 및 촉매 반응 경로를 인수하고, 살아있는 세포에서의 존재는 즉시 사망 3,21-23으로 이어질 수 있습니다. 아르기닌 위치에서 단백질로의 결합은 단백질 안정성 21-23을 줄일 수있다. 인해 얻어진 독성 대장균 (대장균) 및 다른 일반적인 호스트 발현 단백질을 함유 카나 바닌 (canavanine)의 발현 도전 남아있다. 이러한 이유로, 완전한 생체 전모든 위치에서의 Arg 캔 ncorporation 적절 정교 단일 단백질 생산 시스템을 사용하여, 24 단 한번 확인되었다. 그러나, 캔 항암제 25-27 제안, 인간 (28)자가 면역 질환을위한 자극제로서되었다. 또한, 그것의 반 대사, 항균, 항 곰팡이에 대한 다양한 연구 및 항 바이러스 성질 (25)의 적용을받습니다. 이러한 속성에 대한 요구를 제기 효율적이고 쉽게 수행 약국 및 기능 연구에 단백질을 포함 할 수 표현하는 방법을. 생체 내 생산에 연결되어 많은 문제점이 무 세포 발현 시스템을 이용하여 회피 할 수 있지만, 시험 관내 잔류 특정 방식으로 만 제대로 탐구되었다. L 자 트립토판 아날로그 29 복수 ncAAs (30)의 무 세포 잔사 특정 혼입보고되었다. 이러한 방법은 매우 effic에 기초ient T7 RNA 중합 효소. T7 RNA 중합시켜 내생 전사에 비해 유전 기능을 감소 박테리오파지와 같은 전사를 수반한다. 모든 위치에서의 Arg 모델 단백질로 캔의 완전한 잔류 특정 혼입 최근 무 세포 발현 시스템을 이용하여 32, 31을보고 하였다. 동일한 시스템의 약간의 수정은 억제 (33) 종결 코돈을 통해 모델 단백질에 다른 피 롤라이 신 유사체의 사이트 별 통합 할 수있었습니다. 채용 된 무 세포계 31-33은 모든 E.에 기초 대장균 전사 - 번역 시스템. 일본어 전사 - 번역 모듈을 많이 유지하면서, - (재조합 단백질의 1 ㎎ / ㎖, 0.5) 32 그럼에도 불구하고, 효율적으로 전류 박테리오파지 시스템 에서처럼 단백질 발현을 가능하게한다. 본 연구에서는 상세한 프로토콜은 어떻게 잔유에 제공ncAAs의 단말 특정 결합이 모두 E.를 사용하여 실현할 수있다 대장균 세포가없는 시스템 32. 또한, HPLC-ESI 질량 분광 분석을 통해 적절한 평가를 위해 발현 된 단백질을 제조하기 위해 추가 단계가 제안된다. 이 무 세포 시스템의 특성을 확장하려면,이 작품은 캔 (31)의 출판 통합을 참조뿐만 아니라 비정규 L- 라이신 아날로그 L 하이드 록시 라이신과 관련된 새로운 데이터를 제공하지 않습니다. ncAAs의 잔류 별 통합하기위한 다음과 같은 프로토콜은 최근 조브 (34)에 발표 된 프로토콜의 적응이다. 후자의 프로토콜은 표준 아미노산과 고효율 셀 표현의 자유를 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 조 세포 추출액의 제조, 아미노산 용액, 에너지 원액 및이 방법에 사용 된 에너지 버퍼를 나타낸다. 다음 프로토콜은 이전 P에 비해 변경된 단계에 중점순서 rotocol는 ncAAs의 잔류 고유의 통합을 가능하게합니다. 보정 피펫, 낮은 결합 피펫 팁과 마이크로 원심 분리기 튜브는 준비하는 것이 좋습니다. 이하, 아미노산 IUPAC 약어가 사용된다.

<table><tbody><tr><td>보호 안경</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑 (사이즈 S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z768960</td><td>카탈로그 번호 다른 크기: M의 경우 Z768979, L의 경우 Z768987, XL의 경우 , XL의</td></tr> 경우 <tr><td>Z768995 Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, 스위스</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>마이크로스패튤라(L 6 5/8인치, 스테인리스강, 로드 직경 0.09인치)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C9758</td><td>급성 독성: 보호대, 방진 마스크, 보호 장갑 착용</td></tr><tr><td>하이드록실리신(라세미 혼합물)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-gloves(S 사이즈, 방수)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z183490</td><td>카탈로그 번호 다른 크기: M의 경우 Z183512, L의 경우 Z183520, XL</td></tr><tr><td>RTS 아미노산 샘플러</td><td>Biotechrabbit의 경우 Z183539, Hennigsdorf, Germany</td><td>BR1401801</td><td>아미노산 저장 용액의 홈메이드 준비를 위해, 이 프로토콜35을 따르고, 고체 아미노산 키트 LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) 및 L-lysine (L5501-5G)을 사용하십시오. (모두 미국 세인트루이스 시그마-알드리치 출신)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (from E. coli, pack size 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>500 mg의 팩 크기에 대한 카탈로그 번호는 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (효모에서)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-글루타메이트</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-글루타메이트</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, USA</td><td>Plasmid #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% 프리캐스트 트리스-글리신 겔 (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 코스)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS 러닝 버퍼 (10 x 농축액, 5,000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS 로딩 버퍼 (2 x 농축액, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1060091011</td><td>흡입, 피부 접촉 및 삼키면 유독 : 보호 장갑을 착용하고 흄 후드 아래에서 작업</td></tr><tr><td>아세트산 (99.8 %)</td> <td>VWR International, 다름슈타트, 독일</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Protein Miniprep kit</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Germany</td><td>P2002</td><td>제품은 Zymo Research Corporation, Irvine, USA에서도 배포&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤, 99%</td><td>VWR International, 다름슈타트, 독일</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 미니 스핀 컬럼</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germany</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, 미국</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator 5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>비드 박동 튜브 (폴리프로필렌 마이크로바이알)</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>비드, 0.1&nbsp; mm 직경</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA 단백질 분석 키트</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Germany</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>큐벳, 1.5&nbsp; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 바이오 스핀 크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Germany</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-well 광학 바닥 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 밀봉 테이프</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, USA</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성 용액</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 단일염기성 용액</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 투석 카세트, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; L 원심분리기 병</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; L Erlenmeyer 플라스크</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26XP 원심분리기</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>393127</td><td>또는 1L 병을 원심분리할 수 있는 동급 원심분리기.</td></tr><tr><td>Forma 480 오비탈 쉐이커</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>480</td><td>또는 동급의 쉐이커는 가슴 크기 6 x 4 L를 흔들 수 있습니다.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 로터</td><td>Beckman-Coulter, Brea, 미국</td><td>363688</td><td>또는 위의 원심분리기용 5,000 x g 로터로 1L 병을 원심분리할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R 냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>368831</td><td>또는 2ml 반응 튜브를 원심분리할 수 있는 동급 원심분리기.</td></tr><tr><td>가열 블록 HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Germany</td><td>24465</td><td>또는 반응 튜브의 샘플을 최대 100°C까지 가열할 수 있는 동등한 가열 블록.</td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin 원심분리기</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5452000018</td><td>또는 2 ml 반응관을 원심분리할 수 있는 동급의 원심분리기.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2,500 rpm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z654760</td><td>또는 이와 동등한 소용돌이.</td></tr><tr><td>스코틀랜드인 AF103 아이스 플레이커 기계</td><td>K&auml; lte-베를린, 베를린, 독일</td><td>AF103</td><td>또는 이에 상응하는 얼음 얇은 조각기 기계.</td></tr><tr><td>MyTemp 미니 디지털 인큐베이터</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z763314</td><td>또는 29°C에서 샘플을 가열할 수 있는 동급 인큐베이터.</td></tr><tr><td>EcoCell 전기영동 셀/챔버</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>AN12005</td><td>또는 상기의 프리캐스트 겔 또는 사용된 다른 겔로 수직 겔 전기영동을 수행할 수 있는 동등한 전기영동 챔버.</td></tr><tr><td>전기 영동 셀 / 챔버 용 Power-phor 전원 공급 장치</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro &szlig; -Bieberau / Rodau, Germany</td><td>AN12001</td><td>또는 위의 사용 전기 영동 셀 / 챔버에 전원을 공급할 수있는 동등한 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>613-5278</td><td>또는 동일한 정밀도로 유사한 부피를 피펫팅할 수 있는 동등한 마이크로피펫</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>613-5279</td><td>또는 동일한 정밀도로 유사한 부피를 파이펫팅할 수 있는 동등한 마이크로피펫</td></tr><tr><td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171101</td><td>또는 동일한 정밀도로 유사한 부피의</td></tr><tr><td>Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, 미국</td><td>F171301</td><td>또는 동일한 정밀도로 유사한 부피를 피펫팅할 수 있는 동등한 저결합 피펫 팁</td></tr><tr><td>Pipetman 팁 다이아몬드 D1000ST (100 - 1,000&nbsp; &마이크로; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171501</td><td>또는 동일한 정밀도로 유사한 부피를 파이펫할 수 있는 동등한 저결합 피펫 팁</td></tr><tr><td>나사 캡이 있는 50ml 원심분리기 튜브(멸균)</td><td>VWR International, 다름슈타트, 독일</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>나사 캡이 있는 15ml 원심분리기 튜브(멸균)</td><td>VWR International, 다름슈타트, 독일</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>14ml 폴리프로필렌 튜브(둥근 바닥, 2위치 환기 스토퍼, 멸균)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC 컬럼(3 &마이크로; m 입자 크기, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 HPLC machine</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega 마이크로플레이트 리더</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Germany</td><td>415-101</td><td>또는 동등한 마이크로플레이트 리더로 표현된 모델 단백질의 형광을 측정할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Hanna Checker pH 미터</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z351091&nbsp;</td><td></td></tr><tr>LC-MS <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>용 포름산 용리액 첨가제</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립<em&gt; 대장균</em&gt; 휴대없는 전사 번역 시스템

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

아미노산의 표준 세트는 단백질 기능의 매우 넓은 범위로 이어집니다. 그럼에도 불구하고, 잔기의 집합은 여전히​​ 잠재적 단백질 응용에 한계를 부과한다. 비정규 아미노산의 혼입이 범위를 확대 할 수있다. 비정규 아미노산의 혼입이 상보적인 방식이있다. 부위 - 특이 적 결합을 위해, 내인성 표준 병진 기계 외에, 직교 아미노 아실 tRNA의 신테-tRNA의 쌍은 표준들과 상호 작용하지 않도록 제공되어야한다. 결과적으로, 정규의 아미노산, 일반적으로 종결 코돈에 할당되지 않은 코돈은 또한 요구된다. 이 유전자 코드 확장 단백질 내 단일의 특정 부위에서 비정규 아미노산의 혼입을 가능하게한다. 여기에 제시된 연구는 유전자 코드가 내생 번역 시스템 내에서 재 할당되는 잔류 고유의 통합에 대해 설명합니다. 번역 기계즉 canonically 소정의 위치에 그것을 통합하는 대리로 비정규 아미노산을 ccepts, 단백질의 표준 아미노산의 모든 항목은 비정규 하나에 의해 대체된다. 비정규 아미노산의 혼입이 현저하게 변형 된 물리적 및 화학적 특성을 일으키는 단백질 구조를 변경할 수있다. 들은 내인성 단백질을 수정 이후 비정규 아미노산 유사체들은 생체 내 단백질 생산에 제한 발현 호스트 세포 증식 억제제로서 작용한다. 단백질에 독성 비정규 아미노산의 생체 혼입 특히 도전 남아있다. 여기서, 비정규 아미노산 L-카나 바닌 (canavanine)에 의한 L- 아르기닌의 전체 교체를위한 무 세포 방법은 제시된다. 이는 생체 내 발현의 고유 한 문제를 회피. 또한, 질량 스펙트럼 분석을위한 표적 단백질을 제조하는 프로토콜을 포함한다. 즉 L이 L 라이신 하이드 록시 라이신으로 대체 될 수 도시낮은 효율이기는하지만. 원칙적으로, 임의의 비정규 아미노산 유사체 한 내인성 시험 관내 번역 시스템이 인식으로 제시된 방법을 사용하여 통합 될 수있다.

이 프로토콜 모델 단백질로 ncAAs의 무 세포 잔사를 특이 결합을 통해 안내한다. 이 혼입 실험 적절한 HPLC-ESI 질량 분광 분석 모델 단백질을 제조하기 위해 추가 단계의 예비 평가를 SDS-PAGE를 제안한다. 여기서, 아날로그의 Arg 캔의 무 세포 잔사 특정 결합뿐만 아니라, 라이신 유사체 L 히드 록시 리신 (HYL)의 대표적인 결과가 제시되어있다. 다른 아미노산 용액, 에너지 버퍼 모델 단백질 및 무 세포 반응에 대한 벡터 DNA 코딩은 전술 한 바와 같이 제조된다. 레퍼런스 셀 무 반응은 20 CAAS 이루어진 아미노산 용액으로 제공된다. 각 실험에서, 음성 대조군 무 세포 반응은 당해 NCAA의 표준 아날로그 부족 아미노산 용액이 공급된다. 각 appr에 대한oach는 1 무 세포 반응은 CAA는 비정규 아날로그로 치환 된 아미노산 용액의 존재 하에서 단백질 모델을 표현한다. 그의 태그 정화 버퍼 교환 HPLC-ESI 질량 분석은 상기 프로토콜에 따라 실행된다. 모델 단백질은 deGFP (32), EGFP (53)의 잘린 버전 그분이-태그 C- 말단이다. 그 문자를 하나의 아미노산 서열 (보충 재 (2))에서 찾을 수있다. 이 모델 단백질 (6)의 Arg, 18리스 위치를 포함, 각각. 발현 벡터는 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1 - deGFP-T500이다. 미식 축구 완전히 혼입의 경우, 하나는 음성 대조군 반응이없는 20 CAAS 하나 이후 deGFP을 표현하지 않는다고 가정 할 수있다. 반대로, deGFP 다른 두 반응에서 감지해야 다음 REFE의 고유 한무 세포 반응과 NCAA 구비 무 세포 반응의 변성 단백질을 알수 있습니다. 도 1a는 캔 법인 실험의 예비 SDS-PAGE 평가를 보여줍니다. 레퍼런스 셀 무 반응 deGFP 높은 발현 수준을 갖는다. 캔 구비되는 무 세포 반응에서, deGFP 약간 낮은 농도로 표현된다. 어떤 deGFP 발현이 대조군에 감지 할 수 없습니다. 이는 SDS-PAGE 결과를 표적 단백질에 deGFP 캔의 성공적인 도입에 대한 좋은 표시이다. , deGFP으로도 1b에 가시화 정제 모델 단백질 모두 캔의 가설 완전한 결합을 입증하기 위해, HPLC-ESI 질량 분광법으로 분석 하였다.도 1C 정제 deGFP 분자 deconvoluted 질량 스펙트럼을 나타낸다. DEGF의 deconvoluted 질량<html> 기준 무 세포 반응으로 표현되는 P가 26,192.8 다이다. deGFP를 들어 26202.5 다의 질량이 나타납니다 무 세포 반응을 포함하는 캔 표현. 완전히 캔으로 대체되고 기본 deGFP6Arg과의 Arg와 수정 된 deGFP6Can의 예상 질량은 각각 26,193 다 및 26204 다 있습니다. deGFP6Can 1.5 다의 질량 차이 스펙트럼 컨벌루션의 오차 내에있다. 따라서, 6 개 위치에서의 Arg deGFP 캔에의 완전한 혼입은 확인된다. 감소 강도의 두 봉우리는 성숙한 형광을 달성하지 않은 기본 deGFP6Arg 수정 deGFP6Can에 해당합니다. 형광은 자기 촉매 산화 하였다하는 H 2 O 분자의 제거에 의해 생성된다. 이것은이 과정이 진행되지 않을 경우 20 다 증가 질량에 이르게. PG &quot;/&gt; 무 세포 발현되고 정제 deGFP 분자의 결합 수 실험 및 HPLC-ESI 질량 스펙트럼도 1의 SDS-PAGE 평가. (A) SDS-PAGE를 사용하여 혼입 할 실험의 예비 평가. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 단백질 표준, 기준 셀 무 반응, 음성 대조군 및 무 세포 반응 수 대신의 Arg의 제공. (B) 그 태그 정제 한 후 SDS-PAGE 및 표현 deGFP 분자의 교환 버퍼. 캔 포함하는 반응 deGFP 정제 단백질 표준, 기준 반응에서 정제 deGFP : 왼쪽에서 오른쪽으로. HPLC-ESI 질량 분광법에 의한 캔의 전체 법인의 (C) 확인. 완전히 캔으로 대체 기본 deGFP과의 Arg로 수정 deGFP의 예상 질량은 각각 26,193 다 및 26204 다 있습니다. 각각의 스펙트럼은 최고 강도 (카운트)로 정규화된다. 피크 위치가 표시됩니다다한다. 시각화를 위해 겔 레인이 젤 이미지로부터 추출되고, 접합, 그레이 스케일로 변환되어, 크기가 최적화되어 콘트라스트뿐만 아니라 휘도가 향상된다. 원래 젤 레인은 보충 자료 (3)에 제시되어있다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 2a는 HYL 법인 실험의 예비 SDS-PAGE 평가를 보여줍니다. HYL 구비되는 무 세포 반응에서, deGFP가 표현된다. 첫 번째 실험과는 달리 약한 deGFP 대역 음성 대조군 반응에서 관찰 될 수있다. 이 무 세포 반응에서리스 잔류 물에 의한 수 있습니다. 이리스도 HYL도 첨가 된 대조군 반응에서 희미한 deGFP 발현을 가능하게한다. H에 대한<html> PLC-ESI 질량 스펙트럼, HYL 구비 무 세포 반응 deGFP 분자 정제 및 버퍼 (도 2B)를 교환한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> HYL 법인 실험 그림 2. SDS-PAGE 평가 (A) 왼쪽에서 오른쪽으로. 음성 대조군 세포 무 반응, HYL 단백질 표준을 포함하는 무 세포 반응. (B) 그 태그 정제 한 후 SDS-PAGE 및 표현 deGFP 분자의 교환 버퍼. HYL에서 정제 deGFP 반응 단백질 표준을 포함​​ : 왼쪽에서 오른쪽으로. 시각화를 위해 겔 레인이 젤 이미지로부터 추출되고, 접합, 그레이 스케일로 변환되어, 크기가 최적화되어 콘트라스트뿐만 아니라 휘도가 향상된다. 원래 젤 레인은 보충 자료 3에 제시되어있다.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 3은 정제 deGFP 분자 deconvoluted 질량 스펙트럼을 나타낸다.도 3a는 무 세포 반응에 이미 존재하는 라이신 잔기의 가설을 확인한다. 스펙트럼의 주된 피크는 기본 deGFP (:​​ 26193 다 예상 질량)에 해당한다. 다시, 그 형광 물질을 개발하지 않은 다 이상 20 질량 deGFP 분자를 검출 할 수있다. 개의 Lys 잔기 우선적 네이티브 deGFP18Lys 높은 발현 수준에 이르는 리실 -의 tRNA 신테 tRNA에 의해리스 상에 로딩된다. HYL과 라이신 간의 질량 차이는 16 다이다. 때문에 (모든 가능한 deGFP 종 생성 된 라이신 잔기 경쟁 deGFP18Hyl이다 HYL의 존재,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (그림 3B). 틀림없이 deGFP1Hyl 17Lys +의 피크는 형광체 (도 3A) 및 일부 피크의 질량이 예상 질량에서 2 개 이상의 다 다르다 생성되지 않은 네이티브 deGFP의 피크와 중첩. 이러한 질량 차이 때문에 deGFP 종 소량 높은 잡음에 기인 할 수있다. 그러나, HYL은 일반적으로 무 세포 시스템으로 통합된다. 추가 개선은 무 세포 반응에 라이신 잔기를 폐지하기 위해 수행되어야한다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . (: 성숙한 형광 26213 다없이 형광 26193 다 예상 질량) HYL를 함유하는 무 세포 반응의 정제 deGFP 분자도 3 HPLC-ESI 질량 스펙트럼 (A) 네이티브 deGFP18Lys 주로 검출된다. (B)확대 가능한 모든 deGFP 종 (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys)의 존재를 알 수있다. 이들 예상 질량이 26,193 다 N + 16 다 (N = 1, ..., 18)를 X. 스펙트럼은 최고 강도 (카운트)로 정규화된다. 피크 위치가 다에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> 보충 재 (1) 계산 템플릿. 제 2 항에있어서, 에너지 버퍼 마스터 믹스의 제조는 조 추출물 분취 액 30 μL와 최적 MG-각각이 3mm K 글루타메이트 농도 및 30 mm의 사용을들 수있다. 이 예는 3 에너지 버퍼 분취를 산출 마스터 믹스 볼륨에 연결됩니다. 초에서기 3 무 세포 반응의 준비는 무 세포 반응에서 10 nM의 최적의 벡터 DNA 농도를 선도하는 90 나노 DNA 원액을 사용을들 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 조 추출물의 부피 : 28 μL, 최적의 Mg 글루타메이트 2 mm의 최적 K 글루탐산 : 40 mm의 수가 적절한 추적의 경우, 계산 템플릿의 사용은 위의 예와 다를 이러한 전형적인 값을 삽입하여 예시 (100), 무 세포 반응에 최적의 벡터 농도 : 8 nm의, DNA 벡터 원액 : 150 nm의 원하는 버퍼 씩의. 먼저 첫 번째 템플릿 섹션의 오렌지 필드에 조 추출물 볼륨으로 28 μl를 입력합니다. 그런 다음 두 번째 템플릿 섹션에 2 mM의를 입력D 40 밀리미터로 최적의 MG-와 오렌지 필드에 K-글루타메이트 농도. 고려하여 최적의 K-MG-및 농도, 15 ㎕의 에너지 버퍼의 조성물뿐만 아니라, 대응하는 최대 스케일링 된 16 μL의 분취 량을 산출한다. 다음, 그에 따라 에너지 버퍼 씩의 원하는 숫자 (16 μL)으로 100을 입력합니다. 100 mM의 마그네슘 - 글루타메이트 원액 204 ㎕의 3 M K 글루탐산 스톡 용액의 136 μL, 14 배의 에너지 용액 728.73 μL, 510 μL : 템플릿은 다음과 같이 1700 ㎕의 마스터 믹스를위한 다른 버퍼 성분의 양을 적응 40 %의 PEG-8000 및 121.27 ㎕를 멸균 DDH 2 O. 마지막으로, 세번째 주형 섹션 8 nM 내지 무 세포 반응의 최적 벡터 농도 150 nM의 각각의 DNA 벡터 원액 농도를 입력한다. 템플릿은 90 μL의 준비를 마무리 조 추출물의 28 μl를 추가해야합니다 다른 기기의 볼륨을 적응무 세포 반응을 다음과 같이 에너지 완충액 15 μL, 3 개의 다른 합성 아미노산 용액 중 하나의 15 μL, 벡터 DNA 용액 (150 ㎚)의 4.80 μL, 멸균 DDH 2 O.의 27.20 μl를 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> 모델 단백질 deGFP의 보충 자료 2. 문자를 하나의 아미노산 서열이.이 모델 단백질 (6)의 Arg, 18리스 위치가 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> 개별 기업들에 제시된 재료 3. 전체 길이 겔 이미지에 대응하는 미 변성 겔 레인 제시된도 1 및도 2 겔 레인<html> ubfigure은 동일한 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔로부터 추출된다. 그림 1과 2 이러한 차선에서 프리젠 테이션을 위해 함께 합류했다. 단백질 표준의 밴드 분자량 도면 옆에 표시된다. (A.1) 그림 1A의 자르지 젤 레인. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 단백질 표준, 기준 셀 무 반응, 음성 대조군 및 무 세포 반응 수 대신의 Arg의 제공. (A.2) 그림 1B의 자르지 젤 레인. 캔 포함하는 반응 deGFP 정제 단백질 표준, 기준 반응에서 정제 deGFP : 왼쪽에서 오른쪽으로. (B.1) 그림 2A의 자르지 젤 레인. 부정적인 제어 무 세포 반응, HYL 단백질 표준을 포함​​하는 무 세포 반응 : 왼쪽에서 오른쪽으로. (B.2)도 2b의 자르지 젤 레인. HYL에서 정제 deGFP 반응 단백질 표준을 포함​​ : 왼쪽에서 오른쪽으로.D / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

다운스트림 분석을 포함하여 비표준 아미노산 유사체를 단백질에 잔류물 특이적으로 통합하기 위한 사용하기 쉬운 무세포 발현 프로토콜이 의료, 제약, 구조 및 기능 연구를 위해 제시됩니다.

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

이 절차의 전반적인 목적은 무세포 발현 시스템을 사용하여 모델 단백질 내의 특정 잔기에 비천연 아미노산 유사체를 통합하고, 이에 대한 다운스트림 분석을 제공하는 것입니다. 이 방법은 단백질 구조 내 비천연 아미노산의 역할과 같이 의약품 및 구조 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 숙주가 없는 상태에서 독성 아미노산을 모델 단백질에 통합할 수 있다는 점입니다. 실험을 시작하기 위해 20가지 표준 아미노산(CAA)의 전체 스톡 용액과 미리 준비한 비천연 아미노산(ncAA) 스톡 용액을 실온에 둡니다. 용액이 해동되면 빈번하게 볼텍싱하여 침전된 아미노산을 다시 용해시킨 후 아미노산을 얼음에 놓습니다. 다음으로, 멸균 2회 증류수 1.4 mL를 15 mL 원심 분리 튜브에 옮기고 얼음에 둡니다. 각 아미노산 스톡 용액 175 µL를 차례대로 추가하고, 각 추가 단계 후 튜브를 철저히 볼텍싱한 뒤 용액을 다시 얼음에 둡니다. 모든 아미노산을 추가한 후 튜브를 철저히 볼텍싱합니다. 용액이 최대한 투명해질 때까지 튜브를 배양합니다. 아미노산 마스터 믹스 용액을 1.5 mL 반응 튜브 3개에 1.35 mL씩 동일한 부피로 나누어 담고 얼음에 보관합니다. 첫 번째 분할 부피에 ncAA의 유사체인 CAA의 168 mM 스톡 용액 50 µL를 추가하여 20가지 CAA를 모두 포함하는 아미노산 용액을 만듭니다. 용액을 철저히 볼텍싱한 다음 튜브를 다시 얼음에 둡니다. 용액을 반응 튜브에 소분하고 plus CAA라고 표시합니다. 소분한 샘플을 액체 질소로 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관합니다. 다음으로, 아미노산 마스터 믹스의 두 번째 분할 부피에 멸균 2회 증류수 50 µL를 추가하여 19가지 CAA를 포함하는 아미노산 혼합물을 준비하고, 용액을 철저히 볼텍싱한 뒤 얼음에 둡니다. 용액을 소분하고 튜브에 minus CAA라고 표시합니다. 마지막으로, 마지막 1.35 mL에 ncAA의 168 mM 스톡 용액 50 µL를 추가하여 19가지 CAA와 ncAA를 포함하는 아미노산 혼합물을 준비합니다. 혼합물을 철저히 볼텍싱하고 다시 얼음에 둡니다. 튜브를 소분하고 표시한 뒤 냉동합니다. 얼음 위에서 30 µL 조추출물 소분액 3개(plus CAA 소분액 1개, minus CAA 소분액 1개, ncAA 소분액 1개), 에너지 버퍼 소분액 3개, 그리고 벡터 DNA 용액을 해동합니다. 멸균 2회 증류수를 얼음에 둡니다. 다음으로, 에너지 버퍼 15 µL를 추가하고 파이펫팅한 후, 용액을 부드럽게 볼텍싱하여 혼합합니다. 조추출물 30 µL에 plus CAA 아미노산 용액 소분액 15 µL, 90 nM 벡터 DNA 용액 10 µL, 멸균 2회 증류수 20 µL를 추가합니다. 조추출물 30 µL에 에너지 버퍼 15 µL, minus CAA 15 µL, 90 nM 벡터 DNA 용액 10 µL, 멸균 2회 증류수 20 µL를 추가하여 음성 대조군을 설정합니다. 조추출물 30 µL에 에너지 버퍼 15 µL, plus ncAA 15 µL, 90 nM 벡터 DNA 용액 10 µL, 멸균 2회 증류수 20 µL를 결합하여 ncAA 반응을 진행합니다. 그런 다음 모든 튜브를 배양합니다. SDS-PAGE를 실행하기 10분 전에, 반응 튜브에서 점성이 있는 각 무세포 반응물 1 µL를 멸균 2회 증류수 4 µL에 희석합니다. 철저히 볼텍싱하고 미니 원심분리기로 액체를 짧게 스핀 다운합니다. 희석된 무세포 반응물 5 µL에 2X 로딩 버퍼 5 µL를 추가합니다. 철저히 볼텍싱하고 미니 원심분리기로 액체를 스핀 다운합니다. 반응 튜브를 가열 블록에 넣고 뚜껑이 제대로 닫혔는지 확인합니다. 그동안 전기영동 챔버에 러닝 버퍼를 옮깁니다. 가열 후 미니 원심분리기로 액체를 스핀 다운합니다. 스핀 다운 후 튜브를 짧게 볼텍싱하고 스핀 다운을 반복합니다. 단백질 표준물질 15 µL와 각 샘플 10 µL를 웰에 옮기고 전기영동을 시작합니다. 카세트에서 겔을 조심스럽게 꺼내 30분 동안 고정합니다. 그런 다음 겔을 염색 용액에 60분 동안 담급니다. 염색 후 겔을 탈색 용액에 60~120분 동안 담급니다. His-결합 버퍼와 무세포 반응물을 동일한 부피로 섞고 혼합물을 파이펫팅합니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 볼텍싱합니다. 다음으로 컬럼 시스템을 조립합니다. 겔 수지가 완전히 용해될 때까지 His-친화성 겔 스톡 용액을 철저히 볼텍싱합니다. 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 겔 수지 250 µL를 컬럼에 옮깁니다. 13,000~15,000 ×g에서 5~10초 동안 컬럼을 원심 분리합니다. 겔 수지가 완전히 배수되었는지 확인한 후, 무세포 반응 His-결합 버퍼 혼합물 150~300 µL를 컬럼에 옮깁니다. 컬럼을 원심 분리합니다. 통과액을 버리고 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣습니다. His-세척 버퍼 250 µL를 추가하고 컬럼을 탭핑 및 부드럽게 볼텍싱하여 겔 수지를 재현탁합니다. 컬럼 튜브를 원심 분리합니다. 수집 튜브를 버리고 컬럼을 새 1.5 mL 표준 반응 튜브에 넣습니다. 용출 버퍼 150 µL를 추가하고 탭핑과 부드러운 볼텍싱으로 겔 수지를 재현탁합니다. 그런 다음 컬럼을 원심 분리하여 용출 버퍼 내에 정제된 단백질을 희석합니다. 먼저 겔 여과 스핀 컬럼의 하단 캡을 제거한 다음 상단 캡을 제거합니다. 컬럼을 2 mL 세척 튜브에 넣고 원심 분리하여 겔 보관 버퍼를 제거합니다. 통과액을 버린 다음, 단백질 보관 버퍼를 최대 400 µL까지 추가하고 컬럼을 원심 분리합니다. 단백질 보관 버퍼 전체가 겔에 로드되도록 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 컬럼을 새 수집 튜브에 넣고 정제된 모델 단백질 용액 최대 100 µL를 겔 베드의 중앙에 조심스럽게 추가합니다. 컬럼을 원심 분리합니다. 버퍼 교환 후, 모델 단백질 용액 100 µL 전체를 열린 튜브에 담아 회전 진공 농축기에 넣습니다. 농축기의 뚜껑을 닫고 30 °C에서 회전을 시작합니다. 이 SDS-PAGE는 target 단백질 deGFP에 L-canavanine(Can)이 성공적으로 통합되었음을 보여주며, 참조 무세포 반응에서 deGFP 발현 수준이 가장 높습니다. 무세포 Can 반응은 약간 낮은 deGFP 농도를 나타내며, 음성 대조군에서는 deGFP 발현이 검출되지 않습니다. 발현된 deGFP 분자들의 His-tag 정제 및 버퍼 교환 후 SDS-PAGE를 수행했습니다. HPLC

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

합성 생물학 비정규 아미노산의 co-translational 삽입을 사용 하 여 전례 없는 속성으로 단백질의 엔지니어링을 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 소설 형광 분 광 속성, "금" 형광 성 단백질 (GdFP), 불리는 GFP 형 fluorophore의 spectrally 레드 이동 변종 생산 대장균 에서 선택적 압력 관 (SPI)를 통해 제시.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

유전자 코드 확장 acetylation 단백질을 포함 한 생물 학적 과정의 넓은 범위를 공부 하는 강력한 도구 역할을 합니다. 여기 균질 생성 하기 위한이 기술을 악용 하는 손쉬운 프로토콜 acetylated 단백질 대장균 세포에 특정 사이트에 설명 합니다.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

프로토콜 선물 대장균-lactococcal 항균 성 펩 티 드 nisin에 비정규 아미노산 (ncAAs)의 선택적 압력 관을 기반으로. 재조합 식을 통해 대체 정의 된 성장 매체에서 원하는 ncAAs로 동안 그것의 속성을 변경할 수 있습니다. Bioactivity 결과 변화 성장 금지 분석 실험 및 형광 현미경 검사 법에 의해 매핑됩니다.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.

더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

고전적 부위-지시된 돌연변이유발의 한계를 극복하기 위해, 특이적 변형을 갖는 프롤린 유사체를 몇몇 형광 단백질에 혼입시켰다. 우리는 수소를 불소로 대체하거나 프롤린 잔기의 이중 결합에 의한 단일 ( "분자 수술")이 접힘 및 빛과의 상호 작용을 포함한 근본적인 단백질 특성에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

이 프로토콜은 모델 막 단백질을 지질 이중층으로 합성하고 통합하는 연구를 위해 거대 단층 소포(GUV) 내에 CFE(cell-free expression) 시스템을 캡슐화하는 데 사용되는 역에멀젼 방법을 설명합니다.

Cell-Free Expression System의 캡슐화에 의한 박테리아 글루타메이트 수용체 채널의 재구성

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

학습하세요 비정규 아미노산을 모델 단백질에 잔류 특이적으로 삽입하는 무세포 발현 시스템을 이용한 방법입니다. 이 기술은 단백질 구조 및 기능 연구에 활용됩니다.

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립

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