고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

본 실험의 전반적인 목표는 인간 다능성 줄기세포를 고효율 및 재현성 있게 심근세포로 분화시키는 것입니다. 이 프로토콜은 바이오리액터에서 규모를 확대하거나, 단일 세포 배양에 민감한 세포주 분화를 위해 수정하여 사용할 수 있습니다. 이 방법은 인간 유도 다능성 줄기세포를 이용한 심장 질환 모델링의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 비용 효율적이며, 인간 배아 및 유도 만능 줄기세포 모두에 대해 높은 효율성, 재현성 및 적용성을 가진다는 점입니다. 오늘 시연을 도와줄 분은 Royan Institute 출신으로 현재 Victor Chang Cardiac Research Institute에서 박사 과정 중인 Hananeh Fonoudi입니다. 코팅 전, 세척 브러시와 증류수를 사용하여 유리 펜듈럼이 포함된 100 milliliter 스피너 플라스크에서 먼지나 배양 잔여물을 완전히 제거하십시오.

다음으로, 플라스크에 70% ethanol을 채웁니다. 30분 후, 플라스크를 증류수로 헹구고 5 M sodium hydroxide를 채웁니다. 다음 날 아침, 흐르는 물에 플라스크를 5분 동안 헹군 후 1 M hydrochloric acid를 채웁니다.

15분 후, 플라스크를 흐르는 물에 5분 동안 더 헹구고, 이어서 2회 증류수로 헹굽니다. 플라스크를 생물안전작업대(biosafety cabinet)에 넣어 건조합니다. 그런 다음, 플라스크에 실리콘화 용액 1.5 milliliters를 넣고, 플라스크를 수평으로 회전시켜 모든 표면이 실리콘으로 덮이도록 합니다.

코팅된 플라스크를 건조 오븐에서 100 °C로 1시간 동안 가열하십시오. 플라스크가 식으면 탈이온수로 15분 동안 3회 헹굽니다. 그런 다음, 용기를 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브 멸균하십시오.

단일 세포 계대 배양법을 사용하여 미분화 스페로이드를 최소 3회 계대 배양한 후, 5 mL 피펫을 사용하여 모든 미분화 스페로이드를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1 mL의 인간 배아 줄기세포 배지로 웰을 세척하여 남아 있는 스페로이드를 수집하고, 이를 수확한 스페로이드와 합칩니다. 스페로이드가 가라앉아 느슨한 펠릿을 형성하도록 5분 동안 방치합니다.

그 다음, 스페로이드를 제거하지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 이어서 1 mL의 PBS로 5분 동안 스페로이드를 세척하고, 37 °C에서 5 mL의 Trypsin EDTA에 넣어 배양합니다. 4~5분 후, 1 mL의 인간 배아줄기세포 배지를 넣어 반응을 중단시키고, P1000 피펫을 사용하여 스페로이드를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.

트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion)으로 세포 수를 센 후, 기본 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor)와 ROCK 억제제(ROCK inhibitor)가 첨가된 조건화 배지에서 세포 농도가 200,000 cell/mL가 되도록 재현탁하고, 세포 현탁액 100 milliliters를 실리콘 처리된 바이오리액터 플라스크에 옮깁니다. 플라스크를 교반기에 놓고 35 RPM으로 설정합니다. 24시간 후, 교반 속도를 40 RPM으로 높입니다.

48시간 후, 재형성된 모든 구상체가 플라스크 바닥에 가라앉을 때까지 5~10분 동안 교반을 중단하고, 배지의 절반을 basic fibroblast growth factor가 첨가된 조건화 배지로 교체합니다. 그다음, 40 RPM에서 교반기를 다시 작동시켜 24시간 동안 유지하며, 향후 3일 동안 매일 동일한 방법으로 배지의 절반을 교체합니다. 5일째 되는 날, 교반기를 5~10분 동안 중단합니다.

그런 다음, 모든 스페로이드를 50 mL 튜브에 옮겨 50 mL 이하의 배지에 넣습니다. 용기에 스페로이드가 남아 있지 않도록 주의하며 플라스크에 남은 배지를 모두 버립니다. 그 후, 가라앉은 스페로이드로부터 상층액을 조심스럽게 제거하고, 칼슘과 마그네슘이 포함된 25 mL의 PBS로 세포 클러스터를 세척합니다.

5~10분 후, 세척액을 제거하고 글리코겐 합성효소 키나아제-3 억제제(glycogen synthase kinase-3 inhibitor), ROCK 억제제 및 폴리비닐알코올이 첨가된 40 mL의 RPMI-B27 배지에 스페로이드를 재현탁합니다. 모든 스페로이드를 다시 바이오리액터 플라스크로 옮깁니다. 그런 다음, 총 부피가 100 mL가 되도록 신선한 RPMI-B27 배지를 추가하고 40 RPM으로 교반을 재개합니다.

24시간 후, 동일한 과정을 거쳐 RPMI-B27 배지로 배지를 교체합니다. 추가로 24시간이 지나면 동일한 과정을 반복하여 IWP2, purmorphamine 및 SB43이 첨가된 RPMI-B27 배지로 교체합니다. 이후 48시간 동안 배양합니다.

첫 박동은 보통 7일 후에 관찰됩니다. 단일 세포 배양에 적응되지 않은 인간 다능성 줄기세포 라인을 빠르게 분화시키려면, 마우스 배아 섬유아세포 세포 위에서 성장시킨 70~80% 합류도의 인간 다능성 줄기세포 배양물에 5 mL의 해리 용액을 처리하여 30~60초 동안 둡니다. 해리 용액은 MEF가 둥글게 변하고 hPSC 콜로니의 가장자리가 분명해질 때까지만 남겨두어야 합니다.

세포를 너무 오래 방치하면 제대로 분화되지 않습니다. 적절한 시점에 해리 용액을 75 mL의 collagenase type IV로 빠르게 교체하고, 몇 분마다 현미경으로 배양 상태를 확인하면서 37 °C에서 5~15분 동안 세포를 배양합니다. 콜로니 전체가 떨어지기 시작하면 collagenase를 1.5 mL의 인간 배아줄기세포 배지로 교체하고, P1000 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 세포 콜로니 전체를 조심스럽게 떼어냅니다.

콜로니가 작은 조각으로 부서지지 않도록 세포를 조심스럽게 떼어내야 합니다. 그런 다음, 5 mL 피펫을 사용하여 세포를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 1 mL의 인간 배아 줄기 세포 배지로 웰을 세척하여 남아 있는 모든 세포를 15 mL 튜브에 모읍니다. 5분 동안 침전시킨 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 기본 섬유아세포 성장 인자가 첨가된 2 mL의 신선한 인간 배아 줄기 세포 배지로 교체합니다.

새로운 5 mL 피펫을 사용하여 세포를 초저부착 플레이트로 옮기고, 콜로니를 6~12시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 5 mL 피펫을 사용하여 콜로니 응집체를 새로운 15 mL 튜브로 조심스럽게 옮기고, RPMI-B27 배지로 세척하여 남은 응집체를 모두 수집합니다. 콜로니가 가라앉으면 상층액을 glycogen synthase kinase-3 억제제가 첨가된 신선한 RPMI-B27 배지로 교체하고, 콜로니를 라미닌 코팅 플레이트로 조심스럽게 옮겨 37 °C에서 부착시킵니다.

24시간 후, 배지를 RPMI-B27 배지로 교체합니다. 다시 24시간이 지난 후, IWP2, purmorphamine 및 SB43이 포함된 RPMI-B27 배지로 교체합니다. 보통 7일 후에 첫 박동이 관찰됩니다.

현재까지 정적 현탁 분화 프로토콜을 5종의 인간 배아 줄기 세포 및 4종의 인간 유도 만능 줄기 세포 라인에 테스트한 결과, 각 라인에서 90% 이상의 박동하는 스페로이드가 형성되었으며, 이는 서로 다른 인간 만능 줄기 세포 라인 간에 이 프로토콜의 재현성이 매우 높음을 입증합니다. 분화 중인 스페로이드는 교반 현탁 바이오리액터 환경에서도 정적 시스템과 유사한 거동을 보였으며, 10일 차에 관찰된 스페로이드의 약 100%가 박동하였습니다. 실제로 30일 차에 수집한 박동 스페로이드 절편에서 각각 심장 트로포닌 T의 세포질 및 핵 발현과 심장 전사 인자 NKX2.5의 발현이 확인되었습니다.

또한, 분화되지 않은 스페로이드를 분화되지 않은 세포 응집체로 대체했을 때, 분화 7일 후에 박동하는 클러스터가 나타납니다. 테스트한 42종의 인간 유도만능줄기세포 라인에서 15일 차까지 평균 60% 이상의 cardiac troponin T 양성 세포군이 생성되었습니다. 박동하는 클러스터는 교반 현탁 바이오리액터로 생성된 스페로이드에서 관찰된 것과 유사한 cardiac troponin T 세포질 발현 및 NKX2.5 핵 발현을 보여주었습니다.

이 절차를 수행할 때, 바이오리액터 내 분화 전 최소 3세대(passage) 동안 단일 세포 배양에 적응된 hPSC를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차는 순수한 세포군을 확보하기 위해 심근세포를 농축하는 다른 방법들과 병행하여 사용할 수 있습니다. 이 기술은 hPSC 유래 심근세포의 상용화를 위한 기반을 마련하였습니다.

이는 임상, 제약, 조직 공학 및 장기 또는 오가노이드 개발 응용 분야에서 활용될 잠재력이 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 만능 줄기세포를 심근세포로 효율적으로 분화시키고 바이오리액터에서 배양 규모를 확장하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.