Name: 각막 상피 창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 배우세요 RNA 간섭 기법을 활용하여 HSP27이 각막 상피 세포에서 상처 치유 과정에 미치는 역할을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 유전자 발현을 효과적으로 조절하여 단백질 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 의학, 서울, 울산 대학교 의과 대학 학생 연구 그랜트 (13 ~ 14)과 아산 생명 과학 연구소, 서울, 한국에서 보조금 (2014-464)에 의해 지원되었다.

1. 세포주 <ol><li> 6 웰 플레이트에 문화 10 6 텔로 머라 제 - 불후의 인간의 각막 상피 세포 (인체 각막 상피 세포) : 기관지 상피 성장 매체 (BEGM)를 사용하여 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 (밀도 1039.9 셀 / mm 2)까지 그들은 95 %의 합류에 도달합니다. </li></ol> 2. 웨스턴 블롯 분석 상피 스크래치 상처를 작성 후 <ol><li> 킬 멸균 200 μL 피펫 합류 배양 된 인체 각막 상피 세포의 잘의 표면을 가로 질러 팁 생물 안전 캐비닛 접시 당 네 번 (클래스 II, 유형 A2)와 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 별도로 인체 각막 상피 세포를 배양 1, 5, 10, 30, 60 및 120 분. </li><li> 각막 상피 ​​상처 후 배양 시간에 따라 여섯 가지 샘플에 대해 하나의 6 웰 플레이트를 사용합니다. </li><li> 1X PBS로 부상 HCEC의 단일 층을 세 번 세척 한 후 각 웰에 2.0 ml의 BEGM를 추가합니다. </li><li> (2)를 사용하여 인체 각막 상피 ​​세포를 분리ml의 0.25 % 트립신 - 에틸렌 디아민 5 분 동안 잘 당 아세트산 (EDTA), 15 ML 튜브에서 5 분 900 XG에 원심 분리기 및 흡인 트립신 EDTA는 1 ml를 피펫을 사용하여. </li><li> PBS 1 배 1 ml의 인체 각막 상피 ​​세포를 일시 중단하고 1.5 ML 튜브로 전송. </li><li> 15 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기 인체 각막 상피 ​​세포 및 흡인 1X PBS는 1 ml를 피펫을 사용하여. </li><li> 100 μl의 빙냉 용해 완충액에서 재현 탁 인체 각막 상피 세포 (10 mM 트리스, 10 mM의 NaCl을 2 mM의 EDTA, 25 mM의 NaF로부터, 2 mM의 나트륨 3 VO 4,1 밀리미터 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 [PMSF], 프로테아제 억제제 [A 펩 스타틴 1 μM, 1 μM의 류 펩틴, 0.1 μM 아프로 티닌] 0.5 % 트리톤 X-100의 pH 7) 및 그들을 잘 섞는다. </li><li> 세포 용해를 유도하는 얼음에 30 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 원심 분리기 15 분 동안 10,000 XG에 4 ° C에서 해물을하고 신선한 1.5 ml의 튜브 (90 μL 씩)에 상층 액을 전송하고 -80 ° C에 저장합니다. </li><li> 브래드 포드 (PR)을 사용하여 세포 용 해물의 전체 단백질 농도를 결정otein 분석. (9) </li><li> 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)를위한 10 % 또는 12 % 아크릴 아마이드 겔에 부하 30 μg의 총 세포 단백질을 전기 영동 이동은 4 ℃에서 1 시간에 대해 200mA 전류 니트로 셀룰로오스 필터에 단백질 밴드 분리 C는 웨스턴 블롯 분석에 사용할 수 있습니다. </li><li> 5 % 차단 니트로 셀룰로오스 여과막 비 인산화 HSP27 대해 기본 토끼 폴리 클로 날 항체를 추가로 1 시간 동안 트윈 -20 (TBST)를 TBS 버퍼에서 탈지유 (1 : 1000 희석) 또는 인산화 HSP27 대해 기본 토끼 다 클론 항체 (1 : 1000 5 % 소 혈청 알부민에 희석) (BSA), 및 진탕 기에서 4 ℃에서 하룻밤 부화 막. </li><li> TBST로 10 분간 3 회 세척 한 후, 5 %의 BSA (10,000 희석 1) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 결합 염소 항 - 토끼 항체를 사용하여 면역 반응성 밴드를 검출한다. </li><li> 서쪽 블로 팅 루미놀 시약에 멤브레인을 품어 (6-7m실온에서 1 분 동안 5cm 막 × 10cm) 당 리터. </li><li> 시약 용액으로부터 막을 제거, 플라스틱 시트 보호에 과잉 흡수 수건 액체과 장소를 제거합니다. </li><li> 안전한 빛 어두운 방에서 작업, 단백질면이 위를 향하도록 필름 카세트에 덮여 막 배치합니다. </li><li> 막 위에 X 선 필름을 넣고 1 분 동안 노출. </li></ol> 3. siRNA를 형질 분석 (10) <ol><li> 문화 5 × 10 5 세포에서 인체 각막 상피 세포 / 잘가 95 %의 합류에 도달 할 때까지 BEGM를 사용하여 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 6 웰 플레이트. </li><li> 10 또는 50 nM의를 만들 수 감소 혈청 배지를 형질 전환 (희석 요인이 41 또는 14.3이었다) 100 ㎕를 감소 혈청 매체와 형질 전환 시약 (2.5 또는 7.5 μl를) 희석과 HSP27 별을 용해하고 100 μL에 제어 siRNA를 스크램블 HSP27 별 및 제어 siRNA의 스크램블. </li><li> 100 μ 믹스100 ㎕의 희석 된 형질 전환 시약 L 개의 siRNA의 용액 (1 : 1 비) 실온에서 15 분 동안 혼합물을 배양한다. </li><li> 세포에의 siRNA - 지질 단지를 추가합니다. 그 후 4 시간 변화 매체 후 37 ℃에서 2 일 동안 세포를 BEGM를 완료하고 부화합니다. </li><li> 4.7 절 4.1에서 설명 된 바와 같이, 웨스턴 블로 팅에 의해 형질 전환 된 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> siRNA를 형질 세포 (11) 4. 웨스턴 블롯 분석 <ol><li> HSP27 특정 추출하고 100 μl의 빙냉 용해 완충액 (10 mM 트리스, 10 mM의 NaCl을 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 25 mM의 NaF로부터, 2 mM의 나트륨 3 VO를 이용한 생물학적 안전 캐비넷 제어 siRNA를 형질 인체 각막 상피 세포를 스크램블링 4, 1 ㎜ 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 프로테아제 저해제, 및 0.5 % 트리톤 X-100, pH가 7). </li><li> 세포 용해를 유도하는 얼음에 30 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 10,000 XG에 펠렛 해물을 15 분 동안하고 신선한 1.5 ML의 욕조에 상층 액을 전송ES (90 μl의 분취 량) 및 -80 ° C에 저장합니다. </li><li> 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석을 이용하여 세포 용 해물의 단백질 농도를 결정한다. (9) </li><li> 10 % 또는 12 % 아크릴 아마이드 겔에 총 세포 단백질의 동일한 양의로드 샘플은 SDS-PAGE에 젤 대상 및 전기 영동 4 ° C에서 1 시간을 위해 200mA의 전류 니트로 셀룰로오스 필터로 분리 된 단백질 밴드를 전송 웨스턴 블롯 분석에 사용합니다. </li><li> , (1000 희석 1) (1000 희석 1) 인산화 된 Akt 5 % 블록 니트로 셀룰로오스 여과막 인산화 비 인산화 HSP27에 대한 일차 항체를 추가 1 시간 동안 트윈 -20 (TBST)를 TBS 버퍼에서 탈지유 Akt의 인산화되지 않은 (1 : 1000 희석, 세포 생존 마커로 사용됨), BCL-2 관련 X 단백질 (1 : 1000 희석, 프로 - 세포 사멸 단백질로 사용), 및 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH 1 5 % 소 혈청 알부민으로 로딩 대조군으로 사용한 200 희석) (BSA), 및쉐이커에 4 ° C에서 하룻밤 멤브레인을 품어. </li><li> 세척 후 TBST로 3 회, 각 10 분간 세척을 5 % BSA에서 (10,000 희석 1) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 결합 염소 항 - 토끼 항체를 사용하여 면역 반응성 밴드를 검출한다. </li><li> 실온에서 1 분 동안 웨스턴 블롯 루미놀 시약의 막 (6-7 mL의 10cm × 5cm 막) 부화. </li><li> 시약 용액으로부터 막을 제거, 플라스틱 시트 보호에 과잉 흡수 수건 액체과 장소를 제거합니다. </li><li> 안전한 빛 어두운 방에서 작업, 단백질면이 위를 향하게와 필름 카세트에 덮여 막 놓습니다. </li><li> 멤브레인 위에 X- 선 필름을 넣고 1 분 동안 노출. </li></ol> 5. 스크래치에 의한 세포 이동 (12)의 방향 상처 분석 평가 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에서의 합류 문화의 잘의 표면을 멸균 피펫 팁을 드래그하여 상처를 만들HSP27 특정 siRNA를 형질 또는 스크램블 제어 siRNA를 형질 인체 각막 상피 ​​세포. </li><li> 바로 부상 후 부상 후 24 시간 동안 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 BEGM 문화에서 그들을 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻어 유지한다. </li><li> 24 시간 부상 후 100 배의 배율로 직립 현미경을 사용하여 HCEC 이미지를 촬영하고 배경은 필터를 사용하여 병합 수행 이미지 분석 소프트웨어 명령어. </li><li> 선택 측정 명령을 사용하여 초기 상처의 끝과 끝에서 수직으로 커버 할 수있는 동일한 크기의 다각형과 관심 (AOI)의 영역을 정의하고, 각 샘플의 상처 지역에 세 가지 다른 AOI을 결정합니다. </li><li> 자동 카운트 / 크기 측정 메뉴 옵션을 사용하여 각 분야에서 세포 수를 계산. </li></ol> 세포 사멸 6. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 문화 HSP27 특정 siRNA를 형질 및 제어의세포 BEGM 5 % CO 2 분위기로 37 ° C의 배양기에서 95 % 합류점에 도달 할 때까지 / 웰 6 웰 플레이트에 5 × 105 세포의 농도로 각 10 nM의 siRNA를 함유 인체 각막 상피 세포를 IRNA는 형질. </li><li> 1 ML의 피펫을 사용하여 5 15 ML 튜브에 분하고, 흡인 트립신 EDTA 900 XG에서 5 분, 원심 분리기 잘 당 2 ml의 0.25 % 트립신 - EDTA를 사용하여 인체 각막 상피 ​​세포를 분리합니다. </li><li> 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어 준 후 10 6 세포 / ml의 농도로 완충액 (0.1 M HEPES / NaOH로 [pH를 7.4, 1.4 M의 NaCl, 25 mM의 CaCl2를)를 결합 1X에서 세포를 재현 탁. </li><li> 5 ㎖의 배양 관 내로 세포 현탁액 (1 × 105 세포) 100 μL를 전송. </li><li> 5 μL를 형광 염료 - 복합 넥신 V 및 5 μL의 프로피 디움 아이오다 이드를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 와동 세포 및 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안이를 부화. </li><li> 흐름 C가 세포를 각 튜브에 1X 결합 버퍼의 200 μl를 추가하고 분석1 시간 내에 ytometer. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

저자는이 연구에서 언급 된 모든 자료 나 방법에는 금융 또는 소유권 관심이 없습니다.

본 연구에서는 시험관 내 접근법을 사용하여 각막 상피 상처에서 HSP27의 잠재적 역할을 평가했습니다. 중요한 단계에는 스트레스를 받는 세포에서 HSP27의 기능을 관찰하기 위해 HSP27 녹다운을 위한 siRNA 형질감염이 포함되었습니다. 특히, HSP27의 역할은 각막 상피 상처 치유 중 상피 세포 이동 및 세포사멸에서 이러한 실험에 의해 밝혀졌습니다. 쥐 HSP27 특이적 siRNA를 사용하여 혈관 평활근 세포를 형질감염시킨 이전 연구10 과 달리, 우리는 siRNA 형질감염 기술을 사용하여 인간 CEC에서 유전자 발현을 변형하여 HSP27 특이적 유전자 발현을 효과적으로 녹다운하고 HSP27 기능을 연구했습니다. 우리가 사용한 표적 서열과 세포 밀도, 최종 siRNA 농도 및 배양 시간에 차이가 있었지만 제조업체에서 권장하는 프로토콜을 명시적으로 따랐습니다. 대체 방법 측면에서, HSP27 녹아웃 마우스는 HSP27 인산화가 상피 이동 및 세포 사멸을 포함하는지 여부를 보여주는 데 사용...

그들은 동시에 윤부 각막 상피 기저 층에서 세포로 대체하는 동안 각막 상피 세포 (CECs)이 지속적으로, 눈물 막으로 흘려된다. (1) 다양한 외부 스트레스가 CECs의 세포 사멸 및 박리를 유도 할 수 있습니다. 2 열 충격 단백질들 (HSPs) 고도로 보존되어 있으며, 분자의 크기에 따라 두 개 패밀리로 분할 될 수있다. (3) 최대 HSP 계열은 HSP90, HSP70, 및 HSP60 및 작은 가족 HSP27 포함을 포함한다. 4 HSP27의 인산화는 세포 생존에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 때문에 굴지의 리모델링이 단백질의 역할의 세포 이동이 필요합니다. 5-7 따라서, 우리는 상피 상처 치유의 체외 모델에서 CEC 마이그레이션 및 세포 자멸사에서 HSP27 인산화의 잠재적 인 역할을 테스트하려고했습니다. RNA 간섭 (RNAi의) 작거나 짧은 간섭 RNA를 하나를 사용하여 (siRNA의)은 GE있다잠재적으로 허용하는 두 기초 및 응용 생물학 nerated 관심이 관심의 유전자의 발현이 노크 다운 될 수 있습니다. (8) 여기서, 우리는 CEC 상처 치유와 세포 자멸사에 대한 HSP27의 기여를 평가하기 위해 HSP27 특정 siRNA를 사용했다. 세포에서 유전자 노크 다운에 대한 기존의 RNAi 방법은 siRNA를을 만드는 조립 될 수있는 두 개의 수정되지 않은 21 메르 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 합성 RNA 이중 가닥을 사용합니다. 우리가 본 연구에 사용 된 siRNA의 RNAi의 세포를 형질하는 간단하고 효율적인 방법이며,이 시약은 다양한 불멸화 세포주와 함께 작동한다. 이 연구에서는, 우리는 스크래치에 의한 방향 상처 분석, 웨스턴 블로 팅, siRNA를 형질 분석, 면역 형광 분석을 포함하여이 분석에 사용되는 방법을 설명하고, 유동 세포 계측법.

<table><tbody><tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&nbsp; 대한민국 대전&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>클래스 II, 타입 A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNAi&trade; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; 스크램블 컨트롤-siRNA 및 HSP27 특정 siRNA</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>기관지 상피 성장 매체&nbsp;</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340 ,P7626</td><td>1 &#956; M 펩스타틴 A, 1 &#956; M 루펩틴, 0.1 &#956; M 아프로티닌</td></tr><tr><td>브래드포드 단백질 분석&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001</td><td>Bradford 단백질 분석&nbsp;</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 필터&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, UK</td><td>RPN3032D</td><td>웨스턴 블로팅 멤브레인</td></tr><tr><td>비인산화 HSP27&nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>1:1,000 희석 (총 HSP27)</td></tr><tr><td>인산화 HSP27 (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>1:1,000 희석 HSP27은 Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg; RNAiMAX 시약에서</td> 인산화되었습니다.<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>인산화 Akt (Ser473)</td><td>세포 신호 기술, Danvers, MA</td><td>No. 4060</td><td>1:1,000 희석 Akt는 Ser473 (세포 생존 마커)</td></tr><tr><td>비인산화 Akt에서</td> 인산화되었습니다.<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4061</td><td>1:1,000 dilution (Total Akt)</td></tr><tr><td>Bcl-2-associated X protein&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4062</td><td>1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>No. 4063</td><td>1:1,000 loading control marker (house keeping gene)</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit anti-rabbit Thermo</td><td>Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10,000 dilution</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>형질주입을 위한 저감 혈청 매체</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Olympus, Inc., Tokyo, Japan</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>스킴 분유&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>6웰 배양 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>35.00mm 직경 / 웰</td></tr><tr><td>24웰 배양 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>산타크루즈 생명공학, 산타크루즈, 캘리포니아</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td>플로우 사이토메트리</td></tr><tr><td>X-선 필름</td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>의료용 X-선 카세트, 녹색 400 화면&nbsp;</td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅 루미놀 시약</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences, 프랭클린 레이크스, 뉴저지</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 rna 간섭 기반 조사

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA)는 단백질 코딩 유전자의 단기 침묵을 위해 가장 널리 사용되는 RNA 간섭 방법 중 하나입니다.siRNA는 mRNA 전사체를 특이적으로 표적으로 하여 분해를 유도하기 위해 만들어진 합성 RNA 듀플렉스이며 다양한 세포 과정에서 새로운 경로를 식별하는 데 사용되었습니다. 각막 상피 상처 치유에서 인산화열충격단백질27(HSP27)의 역할에 관한 보고는 거의 없다. 본 명세서에서, 배양된 인간 각막 상피 세포는 스크램블된 control-siRNA 형질주입된 그룹과 HSP27-특이적인 siRNA-형질주입된 그룹으로 분할되었다. 그런 다음 스크래치 유도 방향성 상처 분석, 웨스턴 블로팅 및 유세포 분석을 수행했습니다. 우리는 HSP27이 상피 세포 사멸 및 이동을 포함할 수 있는 각막 상피 상처 치유에 역할을 한다는 결론을 내렸습니다. 여기에서는 시료 준비 및 연구 프로토콜에 대한 단계별 설명이 제공됩니다.

인산화 HSP27의 발현은 크게 5, 10로 증가하고, 처음 30 분 후에는 13 unwounded 인체 각막 상피 세포에 비하여 부상. 웨스턴 블롯 분석 Bax의 발현이 크게 HSP27 특정 siRNA를 형질 인체 각막 상피 세포 (그림 1A-E)에서 증가하는 반면 인산화 HSP27과 인산화 된 Akt의 발현이 모두 유의하게 감소 된 것으로 나타났습니다. 인산화 HSP27의 발현을 30 % 40 10 뉴 멕시코 % 및 HSP27 고유의 50 nm의 siRNA를 형질 감염된 세포를 각각 제어 siRNA를 형질 세포 있지만 인산화 HSP27의 발현에 비해 감소되지 않았다 (도 1A-B로 감소시켰다 ). 또한, 비 인산화 HSP27의 발현은 10 nM 내지 20 % 및 30 % 감소 하였다 siRNA를 형질 감염된 세포에 각각하지만 비 인산화 HSP27의 발현이 감소되지 않았다 ...

본 연구에서는 각막 상피 상처 치유 중 HSP27의 기능을 평가하기 위해 열 충격 단백질 27(HSP27) 특이적 소형 간섭 RNA를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. RNA 간섭은 다양한 세포 유형에서 단백질 기능을 조사하기 위해 유전자 발현을 효과적으로 knockdown하는 가장 좋은 방법입니다.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

본 RNA 형질전환 분석의 전체적인 목표는 HSP27 특이적 소간섭 RNA(small interfering RNA)를 사용하여 각막 상피 상처 치유에서 HSP27의 잠재적 역할을 평가하는 것입니다. 이 방법은 상피 상처 치유 과정 중 Heat Shock Protein 27의 기능에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소간섭 RNA가 특정 메신저 RNA 전사체를 표적으로 삼아 분해를 유도하도록 정밀하게 생성된 민감한 RNA 구조라는 점입니다.이 방법은 다양한 세포 프로세스에서 새로운 해충을 식별하는 데 사용되어 왔습니다. 이 기술은 각막 상피의 상처 치유에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 피부 및 점막과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 테크니션인 강순숙 님이 진행하시겠습니다.이 절차를 시작하려면, 인간 각막 상피 세포를 bronchial epithelium 성장 배지가 담긴 6-웰 플레이트에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 95% confluence가 될 때까지 배양합니다. 다음으로, 트랜스펙션을 위해 트랜스펙션 시약을 2.5 µL 또는 7.5 µL 취해 100 µL의 reduced serum 배지로 희석합니다. 그 후, HSP27 특이적 siRNA와 scrambled 대조군 siRNA를 각각 100 µL의 reduced serum 배지에 녹여 HSP27 특이적 siRNA 10 nM과 scrambled 대조군 siRNA 15 nM 농도의 용액을 제조합니다.그 다음, 100 µL의 siRNA 용액을 100 µL의 희석된 transfection 시약과 혼합하고, 이 혼합물을 상온에서 15분 동안 배양합니다. 이어서, siRNA 지질 복합체를 세포에 첨가합니다. 4시간 동안 배양한 후, 배지를 완전 기관지 상피 성장 배지로 교체하고, western blot 분석 전까지 세포를 37 °C에서 2일 동안 배양합니다.이 단계에서는 생물안전작업대 내에서 100 µL의 얼음처럼 차가운 lysis buffer를 사용하여 HSP27 특이적 siRNA 및 scrambled control siRNA가 transfection된 HCECs를 추출합니다. 그 다음, 세포 용해를 유도하기 위해 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 이어서, 용해물을 10,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.그 다음, 상층액을 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮겨 -80 °C에서 보관하십시오. 이후 Bradford 단백질 정량법을 사용하여 세포 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음, 총 세포 단백질의 양을 동일하게 맞추어 10% 또는 12% acrylamide 겔에 시료를 로딩하십시오.겔을 SDS-PAGE에 걸고, 분리된 단백질 밴드를 200 mA의 전류로 1시간 동안 4 °C에서 니트로셀룰로오스 필터로 전기영동 전이시킵니다. 다음으로, TBST에 5% 탈지분유를 섞어 니트로셀룰로오스 필터 막을 1시간 동안 블로킹합니다. 그 후 1차 항체를 첨가하고, 셰이커 위에서 4 °C로 하룻밤 동안 막을 배양합니다.다음 날, 멤브레인을 TBST로 3회 세척하며, 각 세척 단계마다 10분씩 소요합니다. 그 후 5% BSA 내에서 horseradish peroxidase가 결합된 goat anti-rabbit 항체를 사용하여 면역 반응 밴드를 검출합니다. 이어서, 멤브레인을 western blotting luminol 시약에 넣고 상온에서 1분 동안 반응시킵니다.시약 용액에서 멤브레인을 꺼냅니다. 그 다음, 흡수성 타월로 과잉 액체를 제거하고 플라스틱 시트 보호기에 넣습니다. 이후, 덮개로 덮인 멤브레인을 단백질 면이 위를 향하도록 필름 카세트에 넣습니다.멤브레인 위에 X선 필름을 올리고 1분 동안 노출시킵니다. 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내에서, HSP27 특이적 또는 scrambled control siRNA가 transfection된 HCEC의 confluent culture 위로 멸균된 피펫 팁을 끌어 상처를 냅니다. 상처를 낸 직후 세포를 1XPBS로 두 번 세척하고, 37 °C, 5% CO2 조건의 기관 상피 성장 배지에서 24시간 동안 배양합니다.손상 후 24시간이 지나면 정립 현미경을 사용하여 100배율로 HCECs 이미지를 촬영하고, 이미지 분석 소프트웨어의 필터 명령을 사용하여 배경 평탄화(background flattening)를 수행합니다. 측정 선택 명령을 사용하여, 초기 손상 부위를 양 끝에서 수직으로 덮을 수 있는 동일한 크기의 다각형 모양으로 관심 영역(area of interest)을 정의합니다. 그런 다음, 각 샘플의 손상된 부위에서 세 군데의 서로 다른 관심 영역을 지정합니다.세포 수 측정 메뉴 옵션을 사용하여 각 시야의 세포 수를 자동으로 계산합니다. 여기에 제시된 Western blot 분석 결과, 인산화된 HSP27과 인산화된 Akt의 발현이 모두 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 반면, HSP27 특이적 siRNA가 transfection된 HCECs에서는 backs의 발현이 유의하게 증가했습니다.대조군 siRNA를 transfection한 세포와 비교했을 때, 10 nM 및 15 nM의 HSP27 특이적 siRNA를 transfection한 세포에서 인산화된 HSP27 발현이 각각 30% 및 40% 감소하였습니다. 또한, 10 nM 및 15 nM의 HSP27 특이적 siRNA를 transfection한 세포에서 비인산화 HSP27 발현이 각각 20% 및 30% 감소하였습니다. scratch 유도 방향성 상처 분석 결과, 상처 유도 24시간 후 10 nM 및 15 nM의 HSP27 특이적 siRNA를 transfection한 세포에서 이동성이 감소한 것으로 나타났습니다.또한, 유세포 분석 결과 HSP27 특이적 siRNA가 형질전환된 HCEC는 scrambled 대조군 siRNA가 형질전환된 세포에 비해 더 많은 세포사멸 및 괴사성 세포 사멸을 보였습니다. RNA 형질전환 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 24시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이러한 절차를 거치면 각막 상피 상처 치유에서 Heat Shock Protein 27의 초기 기능과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 lock mouth와 같은 에피소드를 생성할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 Heat Shock Protein 27 특이적 소간섭 RNA를 사용하여 각막 상피 상처 치유에서 Heat Shock Protein 27의 잠재적 역할을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 소간섭 RNA 및 시약을 다루는 작업은 위험할 수 있으며, 이러한 절차를 수행하는 동안에는 생물 안전 작업대와 보호 마스크와 같은 사전 준비 장비를 항상 사용해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

인간 당뇨병 장기 배양 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료의 예는 이러한 각막에서 지연된 상처 치유와 현저히 감소된 상피 줄기 세포 마커 발현의 정상화를 위해 제시됩니다. 또한 줄기세포가 풍부한 윤부 상피 배양에서 이 과정의 최적화를 설명합니다.

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.

Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

이 프로토콜, 마우스의 눈 표면에 마모를 및 상처 치유 과정 그 후에 따라 메서드를 설명 합니다. 프로토콜은 부분적으로 anaesthetized 쥐에서 눈의 표면 상피를 제거 하는 눈 버 합니다.

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기에서, 트레핀 및 무딘 골프 클럽 스푸드를 사용하여 마우스에 중앙 각막 상피 마모 상처를 만들기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 각막 상처 치유 모델은 재현성이 높으며 현재 질병의 맥락에서 손상된 각막 상처 치유를 평가하는 데 사용되고 있습니다.

각막 상처 치유를 연구하기위한 상피 마모 모델

여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 다른 단계를 보여줍니다. 재생 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있습니다.

배아 상처 병아리 각막의 흉터없는 조직 재생 조사

이 프로토콜은 세포 수준에서 후속 상처 폐쇄를 평가하기 위해 마모를 통해 제브라 피쉬의 안구 표면을 손상시키는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 안구 버를 이용하여 각막 상피를 부분적으로 제거하고 주사 전자 현미경을 사용하여 상처 폐쇄 중 세포 형태의 변화를 추적합니다.

제브라피쉬 각막 상처 치유: 마모에서 상처 폐쇄 영상 분석까지

본 연구는 핵이 있는 구체의 고해상도 라이브 셀 이미징을 가능하게 하기 위해 3D 프린팅 홀더를 활용하는 새로운 실험 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 생체 외 글로브 에서 상처 입은 각막 상피의 세포 칼슘 신호 전달 활성을 실시간으로 관찰 할 수 있습니다.

새로운 3D 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징

우리는 각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 통해 심각한 각막 염증을 일으키는 쥐 모델을 개발했습니다. 이 연구는 염증 상태에서 각막 염증 패턴, 상피 증식 및 윤부 줄기 세포의 변화를 평가했습니다.

각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립

돼지 각막 체외 장기 배양 및 상피 상처 치유는 화학 물질의 안구 독성을 테스트하기 위한 경제적이고 윤리적이며 재현 가능하고 정량적인 수단을 제공합니다. 또한 상피화 및 조직 복구의 조절의 기전을 규명하고 당뇨병성 각막병증 및 상처 치유 지연을 치료하기 위한 치료법을 평가하는 데 도움이 됩니다.

장기 배양 돼지 각막 및 상피 상처 치유를 사용한 치료 및 화학적 독성 평가

배우세요 RNA 간섭 기법을 활용하여 HSP27이 각막 상피 세포에서 상처 치유 과정에 미치는 역할을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 유전자 발현을 효과적으로 조절하여 단백질 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

더 많은 동영상 탐색

각막 상피 창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사