Name: 갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 학습하세요 갭 접합부 세포 간 통신 측정 방법을 WB-F344 쥐 간 상피 세포를 이용하여 독성 물질이 세포 신호 전달에 미치는 영향을 평가하는 데 활용합니다. 이 기술은 조직 항상성 연구에 필수적입니다.

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이 연구의 프로토콜은 쥐가 인도적과 고통의 경감을위한 관련하여 처리 한 것을 보장하기 위해 동물 관리 및 생체은 실험이 수행 된 곳이다 일본의 건강 과학, 국립 연구소의 이용위원회에 의해 승인되었다. 1. SL-DT 생물 검정 <ol><li> 이글스 함유 시드 3 × 105 WB-F344 쥐 간 상피 세포 (35) 상 mm 직경의 배양 플레이트를 37 ºC 100 % 상대 습도 (RH), 5 % 인큐베이터 배지 플러스 5 % 소 태아 혈청, 및 배양 세포를 변형 CO 2. </li><li> 배양 세포들은 100 % 합류 (일반적으로 2 일)에 도달하고 후술하는 바와 같이 셀의 원하는 치료 실험을 수행 할 때까지. <ol><li> 복용량 응답 실험을 실시 <ol><li> 10 ㎕의 100 % 아세토 니트릴 4 μL 6 μL에서 페난 트렌의 2 mM의 스톡 용액 20 μL 및 phenan의 20 mM 스톡 용액 8 μl를 추가원액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 트렌. </li><li> 4 μL 6 μL 8 μL, 10 μL, 상기 차량 제어 역할을하는 아세토 니트릴 용액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 아세토 니트릴 100 % 용액 20 μL를 추가한다. </li><li> 37 ° C, 100 % RH 5 % CO 2로 설정 인큐베이터에서 15 분 동안 접시를 품어. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 행동 시간 응답 실험 <ol><li> 각 시점 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 분)에 대한 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다. </li><li> 각 시점은 차량 제어 역할을하는 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다. </li><li> 각 지정된 시간 페이지에 대 한 번호판을 품어37 ° C에서 항온 OINT, 100 % RH, 5 % CO 2. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 시간 복구 실험을 실시 <ol><li> 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다. </li><li> 차량 제어 역할을 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다. </li><li> 페난 트렌 또는 아세토 니트릴 중 하나를 함유하는 배지를 경사 분리하고 인산염 완충 식염수 3 ㎖ (PBS)로 3 배 각 린스. </li><li> 원하는 복구 시간 (즉, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 분) 37 ℃의 배양기에서 100 각 플레이트에 신선한 성장 배지 2 ㎖를 첨가하고 부화 % RH 및 5 % CO 2. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 행동의 메커니즘 실험 <ol><li> 신호 전달 억제제의 추가 예 </li><li> 차량 제어 역할을 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴의 5 μL를 추가한다. </li><li> 추가로 15 분 동안 성장 배지 플러스 D609 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다. </li><li> 차량 제어 역할을 추가로 15 분 동안 성장 배지 플러스 100 % 아세토 니트릴 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 어느 부드럽게 매체를 주입하여 진공 흡인에 의해 배양 배지를 버리고. 참고 : 적절하게 유해 폐기물을 포함하는 배지를 폐기 할 것. </li><li> 3 PBS ㎖의 betwee 캔트 또는 흡인 중 하나와 세포에게 3 회 씻어여기서 n은 린스. </li><li> 피펫 1 mg을 ml의 / 루시퍼 노란색 염료는 각 셀 플레이트에 PBS (LY)에 용해 ㎖로. </li><li> 부드럽게 판의 세 가지 영역에서 세포 집단을 둥근 모서리와 # 20 외과 스틸 칼날 압연하여 세포에 염료를 미리로드. <ol><li> 메스 수직 (90 ° 각도) 배양 접시의 가장자리에서 5mm를 배치하는 것으로 시작하고 15 ° (도 1 참조)의 각도에 대해 수직이 각도에서 메스 롤. 참고 :이 집게 손가락과 엄지 손가락 사이의 메스를 곤란에 의해 달성된다. (둥근 블레이드는 단순히 세포를 통해 롤백) 메스 부드럽게 15 ° 위치로 90 °에서 갈 수 있도록 중력을 사용합니다. 이 운동은 시각적으로 눈에 띄는 들여 쓰기 라인을 떠날 것이다. </li></ol></li><li> 실온에서 3 분 동안 LY 용액으로 세포를 인큐베이션. </li><li> 경사 분리 또는 LY 대기음 모든 extrace을 제거하기 3 ㎖ PBS로 3 회 씻어llular 세포 외 배경 형광을 제거하기 위해 염색. </li><li> 세포를 해결하기 위해 10 % 인산염 완충 포르말린 용액의 0.5 ML을 추가합니다. 참고 : 포르말린에 고정 후, 공기는 ​​세포 건조하고 LY 염료의 최소 광표백으로 최대 2 년 동안 어둠 속에서 저장합니다. 필요한 경우, 형광 색소의 전면을 시각화하고, 10 % 포르말린 용액으로 재수. </li><li> 200X의 배율 536분의 428 나노 미터의 여기 / 방출 피크 이색 큐브를 구비 한 표면 형광 현미경을 이용하여 세포를 고정보기. 들여 쓰기 라인이 비전의 수평 필드에 평행이되도록 모든 판을 맞 춥니 다. 참고 : FITC의 이색 큐브가 잘 작동합니다. <ol><li> CCD 카메라 및 지원 소프트웨어로 이미지를 캡처합니다. <ol><li> CCD 카메라에 대한 지원 소프트웨어를 열고 자동 노출 설정을 사용합니다. 디지털 이미지를 획득하기 위해 "캡처"버튼을 사용합니다. "저장"버튼을 사용하여 .tif 파일로 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 간 조직에 SL-DT 분석 2. 적응 <ol><li> 5 주 이전, 남성 피셔 344 쥐 사용하여 해부 가위에서 약 간의 왼쪽 엽에서 2 × 2cm 슬라이스를 제거하고 접시에 젖은 거즈 (12)으로 덮여 중량 측정을 플라스틱에 놓습니다. </li><li> 피펫 0.5 내지 1 ㎎을 함유하는 PBS 용액 ㎖ / ml의 루시퍼 옐로우 및 로다 덱스 트란 (RD) 플라스틱의 간 조각의 표면에 무게 플레이트의 각. 주 : RD는 간극 결합 채널을 통과 할 수없고로드 된 셀을 표시하는 염료이다. </li><li> 날카로운 블레이드와 무게 판의 염료 용액을 가지고 간 조각의 표면에 약 1cm 길이 3 ~ 5 절개를 확인하고 절개를 채우기에 충분 추가 염료를 추가합니다. </li><li> 접시의 무게를 플라스틱에 실온에서 3 분 동안 조직을 인큐베이션. </li><li> PBS 5 ㎖로 3 회 헹군다. </li><li> 조직 비켜 수정실온에서 어두운 곳에서 50 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 10 % 인산염 완충 포르말린 30 ㎖에 rnight. </li><li> 다음 날, 물 조각을 씻어 1 × 1 × 0.5 cm 3 스트립에 가위를 해부와 절개 주위 조직을 손질 한 후 파라핀 13 조각을 포함하는 표준 기술을 사용합니다. </li><li> 제 전까지 어둠이 5㎛의 두께로 절개 라인에 수직 인 슬라이스 저장 샘플을 마이크로톰 절편 13 표준 기술을 이용하여 묘화한다. </li><li> 섹션 1.10 7 항에 형광 염료 전선의 이미지를 시각화하고 캡처하는 CCD 디지털 카메라가 장착 된 표면 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol> 3. 정량화 GJIC <ol><li> (예 ImageJ에)은 형태 학적 소프트웨어 패키지를 사용하여 형광 염료 확산을 측정한다. <ol><li> "파일"탭을 클릭 한 다음 클릭을 열고 "열기"저장된 이미지. </li><li> 염료 전면의 윤곽을 추적하기 위해 도구 모음 탭에서 "무료 손 도구"를 클릭합니다. </li><li> 은 "분석"탭을 클릭 한 다음 "측정"을 클릭합니다. 참고 :이 원하는 경우 다른 스프레드 시트 프로그램으로 복사 할 수 있습니다 스프레드 시트의 영역 값을 생성합니다. </li></ol></li><li> 스프레드 시트 프로그램을 사용하여, 염료가하기 식을 사용하여 제어 플레이트의 이동 영역에 의한 실험 접시 염료 확산 영역을 분할하여 제어 (FOC)의 비율을 계산한다 : <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54281/54281equation1.jpg"> E = 그러한 특정 투여 량 및 시간에서 화학 물질로 처리 된 세포와 같은 실험 변수에 노출 된 세포에서의 염료 확산 영역 관심있는 화학 물질을 용해하는 데 사용되는 비히클로 처리 된 세포는 상기 제어의 염료 확산의 C = 영역 주의 : 차량의 영향을 결정하기 위해,E는 비히클 처리 된 세포에 염료 확산 영역 것 및 C는 차량에 의해 처리되지 세포 염료 확산 영역 일 것이다. 차량의 효과는 바람직하게는 10 % 미만이어야한다. </li></ol>

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SL-DT 분석은 GJIC을 측정하는 간단하고 다양한 기술이지만, 적절한 실험 프로토콜을 설계 할 때 고려되어야한다 몇 가지 중요한 문제들이있다. SL-DT 분석을 사용하여 GJIC의 강력한 측정을 위해 셀 갭 접합을 통해 LY의 좋은 염료 확산이 있어야합니다. 최소한, 적절한 시간 염료 양방향 메스로드 셀에서 셀의 8 개 이상의 행을 퍼지는 것을 보장하도록 선택되어야한다. 또한, 염료 메스로드 셀에서 이전의 거리 측정의 용이성, 제어 플레이트의 염료 확산 시야의 70 내지 90 %를 채우고 보장 배율 인자를 선택한다. WB-F344 쥐 간 상피 세포, 색소 앞에 네 개의 셀 열 넘어갈 대한 LY 용액 세 분 인큐베이션 충분하며, 200 배의 배율이 최적이다. 세포 loadi 아주 수정할 수있는 인 35mm 직경 플레이트상에서 성장메스와 세포에 염료를 ng를. 그러나, 셀은 작은 웰에서 배양 될 수 있지만, 메스의 사용은 특히 96 웰 배양 플레이트에서 불가능하다. 작은 우물의 경우, 우물에 맞게 다시, 롤링 액션을 사용할 수...

이 방법의 전체 목표는 화합물의 잠재적 인 독성을 평가하기 위해, 간단하고 비교적 저렴 ​​광범위한 기술을 제공하는 것이다. 이것은 여러 세포주에서 사용할 수있는 시험 관내 접근법이다. 표면 형광 현미경을 갖춘 표준 세포 생물학 연구소는이 분석을 사용하여 연구를 수행 할 수 있습니다. 세포 기능의 우리의 기본 지식은 시험 관내 생물 검정에 크게 의존하고 있으며, 제약, 환경 오염 물질, 식품 태어난 오염 물질의 독성 평가에 필수적인 요소가되고있다. 불행히도, 모든 독성 종합적 평가에 대한 요구를 충족시킬 수있는 단일 관내 생물학적 검정 시스템이 없다. 시험 관내 분석의 많은 설계 및 평가뿐만 아니라 특정의 생화학 적 또는 분자 포인트를 평가하도록 최적화되어있다. 이들은 매우 자주의 섭동을 반영하도록 설정 높은 처리량 결합에스트로겐 수용체 1 신호와 같은 특정 신호 전달 경로. 이 전략은 매우 성공적 이었지만, 유전자의 발현에 관여하는 신호 전달 경로의 수는 광범위한 매우 복잡 평가하는 특정 신호 전달 경로를 선택하는 작업을한다. 높은 처리율 프로토콜은 현재 개발되고 동시에 단일 분석의 한계 중 일부를 극복하기위한 하나의 접근법을왔다 수많은 신호 전달 경로를 측정하기 위해 사용되고있다. 그러나 모든 신호 전달 경로가 성공적으로보다 포괄적 인 접근 방식에 통합되었습니다 더불어 새로운 신호 전달 경로는 지속적으로 더 복잡하게하는이 평가 과정을 발견되고있다. 특히 높은 관통 넣어 시스템, 생체 외 접근법의 광범위한 번호를 사용하여, 포괄적 인 독성 평가도 매우 고가이며 대부분의 한 조사에 도움이되지 않습니다에 대한 연구 프로젝트를 주도했다. GJIC는 프로세스이다 TIGhtly 멤브레인 및 세포 골격 단백질과 2,3- 주요 세포 내 신호 전달 경로와 상호 작용에 의해 조정 된 전압의 변화에, 칼슘 농도의 pH, 산화 환원의 균형에 의해 제어. 따라서 GJIC의 억제는 다양한 세포 유형의 스트레스, 다른 세포의 기능 장애 또는 다른 신호 전달 경로의 섭동을 반영 할 수있다. 제한된 신호 전달 생물 검정의 이용을 극복하는 또 다른 방법은, 가장 많이있는 경우, 신호 전달 경로는 상기 간극 결합 채널 4-8 통해 협력 세포 내 신호 전달 체계에 의해 다양한 변조되는 생물학적 현상을 활용하는 것이다. 세포 내 신호 전달 체계는 다수의 다중 경로 제어하에 있더라도, 갭 정션 채널을 통해 세포 간 신호 전달은 궁극적으로 부분적으로 또는 완전히 닫힌 개폐되는 채널의 함수이다. 이것은 쉽게 다양한 사용하여 측정 할 수있는 포인트를 제공한다체외 생물 검정 시스템 7인치 조직의 항상성 세트 포인트는 갭 접합부 간 통신에 대한 화합물의 효과를 결정하는 단계, 개방 채널을 필요로 고려 (GJIC)의 화합물 4,8- 잠재적 독성을 결정하는보다 포괄적 인 접근이다. 본질적으로, 유전자 발현을 제어하는 ​​복수의 신호 전달 사건을 조정에서 중심 역할이 중요한 생물학적 현상 독성 효과의 광범위한 평가를 허용한다. 따라서, 생물 검정 GJIC 평가는 화합물의 독성 잠재 성을 평가하는 좋은 출발점이다. GJIC을 평가하는 데 가장 광범위한 기술이 형광 프로브로 세포를 미리로드 한 후, 인접 셀에로드 된 세포 또는 세포로부터 염색제의 이행을 감시에 기초한다. 염료를 미리로드하는 기술은 프로브 (11)의로드 (10), 및 메틸 에스테르를 긁어, 미세 주입 구를 포함했다 </suP&gt;. 메스로드 - 형광 염료 전송 (SL-DT) 방법은 스크랩 부하의 변형입니다 - 엘 Fouly (10)에 의해 개발 된 전송 분석을 염색. 오히려 더 침습적 스크랩보다,이 보고서의 메스를로드하는 방법은 침략 피해를 최소화 세포 (그림 1)의 단층을 통해 라운드 블레이드와 메스의 부드러운 롤을 포함한다. 이 기술의 장점은 셀보다는 마이크로 인젝션 분석의 단일 세포 집단의 독성 평가한다. 마이크로 인젝션 기술 및 형광 프로브의 메틸 에스테르를 사용하는 기술을 사용하는 방법은 훨씬 많은 시간을 소비하며 상당히 높은 기술 수준을 요구하는 반면 또,이 분석의 단순성 단시간에 다수의 판의 빠른 검출을 허용한다. GJIC 연구의 모든 필요를 충족하는 단일 방법이 없지만; SL-DT 분석은 할 수있는 단순하고 매우 저렴하고 다양한 분석입니다다양한 화합물의 독성의 초기 평가에 대한 요구의 대부분을 충족. 주요 장점은 다음과 같습니다 : 단순, (FRAP) 분석 및 분자 형광 프로브 분석, 대형의 GJIC의 신속하고 동시 평가 지역의 활성화를 photobleaching에 후 같은 미세 주입, 형광 복구와 같은 다른 방법에 필요한 장비 나 기술에 대한 특별한 필요 생체 내 연구를위한 자동화 된 형광 현미경 영상 분석뿐만 아니라 적응성 높은 처리량 설정에 도움이되는 세포의 수.

<table><tbody><tr><td>WB-F344 쥐 간 상피 세포</td><td>노스 캐롤라이나 대학교 (노스 캐롤라이나 대학교 (채플 힐, 노스캐롤라이나)의 J. W. Grisham</td><td></td> <td>박사와 MS Tsao 박사가 제공 노스 캐롤라이나 대학교 - 채플 힐 - 노스 캐롤라이나</td></tr><tr><td>35 mm 배양 플레이트</td><td>코닝</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 배양 플라스크</td><td>코닝</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>D-medium, Eagles 변형 매체&nbsp;</td><td>써모피셔/GIBCO&nbsp;</td><td>공식 번호 78-5470EF</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA&nbsp;</td><td>써모피셔/GIBCO&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>성분 cat#의</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT 베이커 - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>JT 베이커 - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3819--01</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT 베이커 - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>루시퍼 옐로우 CH, 리튬 염</td><td>시그마-알드리치 화학</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>로다민-덱스트란</td><td>시그마-알드리치 화학</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>1-메틸안트라센</td><td>시그마-알드리치 화학 페</td><td></td><td></td></tr><tr><td>난트렌</td><td>시그마-알드리치 화학</td><td>P11409</td><td></td></tr><tr><td>레스베라트롤</td><td>시그마-알드리치 화학</td><td>R5010</td><td></td></tr><tr><td>D609</td><td>토크리스 바이오사이언스&nbsp;</td><td>1437</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>37% 용액 포름알데히드</td><td>JT 베이커 - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>#20 수술용 칼날</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10317-14</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 멸균 튜브</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>339652</tr><tr><td>Nikon 형광 현미경&nbsp;</td><td>니콘 -Mager 사이언티픽</td><td>이클립스 TE300</td><td></td></tr><tr><td>니콘 FITC 이색성 큐브</td><td>니콘 -Mager 사이언티픽</td><td>96107</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>니콘 -Mager 사이언티픽</td><td>니콘 쿨 스냅 EZ CCD</td><td></td></tr><tr><td>이미징 시스템</td><td>니콘 -Mager Scientific</td><td>니콘 NIS-Elements F2.2 이미징 시스템.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>국립 보건 연구소</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

이 프로토콜은 조직의 항상성을 유지하는 중요한 세포 간 과정 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 (SL-DT) 기술에 대해 설명합니다. 등 독성 물질, 독소, 약물에 의한 갭 접합부 간 통신 (GJIC)의 중단은 많은 부작용 건강에 미치는 영향에 연결되어 있습니다. 많은 유전자 기반 인간 질병 갭 정션 유전자의 돌연변이에 관련되어있다. SL-DT 방식은 셀의 커다란 집단에서 GJIC의 동시 평가를위한 간단한 분석 기능이다. 분석 간략 세포 집단을 메스 블레이드 세포막을 교란하여 형광 염료와 프리로드 셀을 포함한다. 형광 염료는 그 후 지정된 시간에 대해 인접 셀에 간극 결합 채널을 통해 통과시킨다. 분석 후, 세포에 포르말린을 첨가하여 종료한다. FLUO의 확산세포의 인구를 통해 rescent 염료는 표면 형광 현미경으로 평가되고 이미지가 공개 도메인에서 발견 무료 소프트웨어 패키지를 포함하여 사용할 수있는 형태 계측 학적 소프트웨어 패키지의 수와 분석된다. 이 분석은 또한 처리 된 동물의 다양한 기관에서 조직 조각을 사용하여 생체 내 연구에 적용되고있다. 전반적으로, SL-DT 분석은 시험 관내 약리학 및 독성 요구의 넓은 범위를 제공 할 수 있으며, 잠재적으로 더 짧은 시간에 더 많은 샘플을 명료하게 자동 형광 현미경 영상 분석 높은 처리량 설정 시스템에 적용될 수있다.

GJIC의 중단 광범위하게 불리한 건강에 미치는 영향 (14)을 유도하는 유전자 조절의 nongenotoxic, 후생 유전 학적 수준에서 독성 화합물을 식별하기위한 바이오 마커로 사용되어왔다. 예를 들어, 다환 방향족 탄화수소 (PAHs의)는 환경의 유비쿼터스 오염 물질은하지만 그들의 분자 구조 (15)의 함수로서 자신의 후생 유전 학적 독성에 따라 다릅니다. 저 분자량의 PAHs는 일반적으로 담배 연기 15,16의 오염 된 하천 퇴적물 많은 다양한 환경에서 고 분자량 PAHs에 비해 상대적으로 높은 농도로 발견된다. 페난 트렌은 베이 지역이라는 각 포켓 세 개의 벤젠 고리를 갖는다 저분자 PAH의 일례이다. 도 2는 페난 트렌의 용량 증가 처리 WB-F344 쥐 간 상피 세포 SL-DT의 일련의 이미지이다. 이주 오의 감소를 참고증가 용량과 형광 염료, 루시퍼 노란색, F. 스캔...

이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

전반적인 목표는 광범위한 체외 약리학 및 독성학적 요구에 부응할 수 있는 포유류 세포 집단을 통해 간연접 세포 간 통신을 측정하는 간단한 분석을 제공하는 것입니다. 이 방법은 간극연접 세포간 통신을 조절하지 않음으로써 화합물이 조직의 발달 또는 유지에 영향을 미치는지 여부와 같은 독성학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 독성 물질과 독소에 반응하는 많은 세포 집단에서 간극 접합 기능을 간단하고 빠르게 평가할 수 있다는 것입니다.절차를 시연하는 것은 제 연구실의 학부 연구 조교인 Ajna Uzuni가 맡을 것입니다. 실험을 시작하려면 Eagle's modified medium과 5% fetal-bovine serum을 포함하는 35mm 직경의 배양판에 다섯 번째 WB-F344 쥐 간 상피 세포를 10번 3번 파종합니다. 100% confluence에 도달할 때까지 인큐베이터에서 세포를 배양하고 세포의 실험적 처리를 계속합니다.용량 반응 실험으로 계속하기 위하여는, 이전에 준비된, 100%acetonitrile에 있는 phenanthrene의 2 millimolar 재고 해결책의 10 microliters 및 20 microliters를 추가하고, 100%acetonitrile에 있는 phenanthrene의 20 millimolar 재고 해결책의 4 microliters, 6 microliters 및 8 microliters를 원액의 각 추가한 양을 위한 성장 매체의 2 milliliter를 포함하는 세포의 3개의 격판덮개에 추가하십시오. 다음으로, 4 마이크로 리터, 6 마이크로 리터, 8 마이크로 리터, 10 마이크로 리터 및 20 마이크로 리터의 100 % 아세토 니트릴 용액을 2 밀리리터의 성장 배지를 포함하는 3 개의 세포 플레이트에 추가하여 차량 제어 역할을합니다. 아세토니트릴을 첨가한 후 플레이트를 배양합니다.시간 응답 실험을 수행하려면 100% 아세토니트릴에 함유된 페난트렌의 20밀리몰 스톡 용액 7마이크로리터를 각 시점에 2밀리리터의 성장 배지를 포함하는 3개의 세포 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 각 시점에 대해 2밀리리터의 성장 배지를 포함하는 3개의 세포 플레이트에 100% 아세토니트릴 7마이크로리터를 추가하여 차량 제어 역할을 합니다. 지정된 각 시점에 대해 플레이트를 배양합니다.배지를 부드럽게 부어 배양 배지를 버리십시오. 3ml의 PBS로

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하고 몇 가지 유용한 팁을 제공하는 방법을 여기에 대해 설명합니다. 우리는이 논문으로 인해 기능 갭 접합에 세포 결합의 정도를 평가하기 위해 모두 도움이 될 것으로 기대하고있다. 여기에 설명 된 모든 1,000 달톤 이하의 분자량을 가진 다른 형광 염료에 적응 원칙적으로 될 수있다.

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

이 프레젠테이션은 세포간 접합 통신 연구에 부착 배양된 세포의 전기천공법이 사용되는 방법을 보여주며, 세포는 전도성 및 투명 인듐-주석 산화물로 코팅된 슬라이드에서 성장합니다.

갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)

개선된 체외 신경독성 분석은 새로운 신경보호 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 신경 세포주에서 세포 독성 및 세포 보호를 결정하고 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하여 신경 보호 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위한 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 제시합니다.

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

조기 내피 세포(EEC) 이동에 대한 조사는 특정 질병의 병태생리학을 이해하고 잠재적으로 치료 개입을 위한 새로운 전략을 식별하는 데 중요합니다. 다음 프로토콜은 EEC 조사에 맞게 조정된 세포 이동을 평가하는 기술을 설명합니다.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.

요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 분석 결과

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

stereomicroscope 이하 성인 마우스에서 이가있는 이랑의 제거를위한 해부 기술이 비디오 녹화 프로토콜에서 시연되었다.

성인 마우스 Hippocampal 이가있는 이랑의 해부

최적의 절삭 온도 매체 (OCT)에 포함 된 고정되지 않은 냉동 조직 샘플은 숨겨진 점액 자연 유통 및 글리코 실화를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법 조직 처리에 최소한이며, glycolipids, mucins 및 glycan - epitopes의 자연 프리젠 테이션는 보존됩니다. 조직 섹션은 형광 또는 chromogenic 검색을 사용하여 immunohistochemistry에 의해 분석 할 수 있습니다.

자연 점액 배포를 공부하기 위해 떼어 낸, 냉동 조직을 사용하여

학습하세요 갭 접합부 세포 간 통신 측정 방법을 WB-F344 쥐 간 상피 세포를 이용하여 독성 물질이 세포 신호 전달에 미치는 영향을 평가하는 데 활용합니다. 이 기술은 조직 항상성 연구에 필수적입니다.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

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