소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

이 발색 분석의 전반적인 목표는 다양한 발색 기질의 선택에 대해 고처리량 형식으로 다양한 효소를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 바이오 매스 분해를 위한 새로운 효소 활성을 찾는 것과 같은 효소 발견 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 발색 기질이 4가지 색상으로 제공되어 이 기술을 높은 처리량, 매우 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 것으로 만든다는 것입니다.

먼저 각 웰에 200마이크로리터의 활성화 용액을 추가하여 96웰 필터 분석 키트 플레이트를 활성화합니다. 실온에서 10분 동안 흔들지 않고 배양합니다. 수거를 위해 원심분리기와 표준 96웰 플레이트를 사용하십시오.

현존하는 활성화 용액을 스핀다운하려면 발색 폴리머 하이드로겔 또는 CPH 기질에 100마이크로리터의 멸균수를 추가하고 진공 또는 스핀을 적용하여 안정제를 제거합니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다. 효소 반응을 준비하기 위해 150마이크로리터의 100mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 4.5 및 5마이크로리터의 3가지 농도의 엔도셀룰라아제 용액을 분석 키트 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

진탕하는 동안 반응 플레이트에서 잠재적인 누출을 수집하기 위해 분석 키트 플레이트 아래에 제품 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 100rpm의 수평 셰이커에서 30분 동안 실온의 분석 키트 플레이트를 배양합니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 받으려면 배양 중에 반응 혼합물을 교반해야 합니다.

제품 플레이트가 아래에 있는 분석 키트 플레이트를 원심분리기에 놓고 2, 700 x g에서 10분 동안 스핀다운합니다. 반응 생성물을 제품 플레이트의 우물로 옮깁니다. 스핀 후 제품 플레이트를 육안으로 검사하여 각 웰의 액체 부피가 거의 같은지 확인합니다.

플레이트 리더를 사용하여 다양한 녹색 CPH 기판에 대한 630nm에서 수집 플레이트의 흡광도를 읽습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하고 플로팅합니다. 적색 불용성 발색 바이오매스 또는 ICB-밀짚으로 발색 분석을 수행하려면 먼저 분석 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 활성화 용액을 추가합니다.

그런 다음 10분 동안 교반 없이 실온에서 플레이트를 배양합니다. 100마이크로리터의 멸균수를 사용하여 우물을 세 번 세척하여 안정제를 제거합니다. 다음, 100 mM 나트륨 아세테이트 완충액 PH 4.5의 150 마이크로리터 및 다른 엔도 xylanase 해결책의 밀리리터 당 10 단위의 5 마이크로리터를 추가하십시오.

제품 플레이트를 기판 플레이트 아래에 배치하여 쉐이킹 중에 기판 플레이트에서 잠재적인 누출을 수집합니다. 실온에서 100rpm으로 2시간 동안 반응을 배양합니다. 배양 후 제품 플레이트가 아래에 있는 분석 키트 플레이트를 원심분리기에 놓고 2, 700 x g에서 10분 동안 스핀다운하여 반응 생성물을 제품 플레이트의 웰로 옮깁니다.

각 웰의 액체 부피가 거의 같은지 확인하십시오. 그런 다음 플레이트 리더를 사용하여 빨간색 ICB-밀짚에 대한 517nm에서 수집 플레이트의 흡광도를 읽습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행합니다.

여기에서 보이는 것은 감소하는 효소 농도가 시각적으로 관찰될 수 있는 효소의 다른 농도에 xylanase에 CPH arabinoxylan의 복용량 반응의 보기입니다. 보다 자세한 분광광도계 정량화는 효소 농도에 대한 흡광도를 표시하는 데 사용됩니다. 신호로 강도는 효소 활성에 해당합니다.

효소 스크리닝에 사용된 이 분석법의 예에서, 엔도셀룰라아제는 서로 다른 CPH 기질에 대해 세 가지 농도로 테스트되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 셀룰라아제에 추가되는 활성은 CPH-glucan, CPH-xylan, CPH-xyloglucan에 대해 나타났고, CPH-galactomannan에 대해서는 낮은 활성이 관찰되었다. 동일한 CPH 기질을 동일한 조건에서 양성 대조군으로 사용되는 상업적으로 이용 가능한 효소로 절단했습니다.

여기서의 결과는 모든 기질이 효소 농도가 증가함에 따라 증가한 수준에서 분해되었음을 보여줍니다. 이 실험에서는 3가지 다른 pH 조건에서 Phanerochaete chrysosporium의 분비 효소를 분석하기 위해 19개의 CPH 기질과 함께 5개의 ICB 기질을 포함시켰습니다. P.chrysosporium 효소는 다양한 글루칸, 전분 및 자일란을 분해했습니다.

헤미셀룰로오스 아라비난(hemicelluloses arabinan)과 펙틱 갈락탄(pectic galactan)과 RGI에 대한 더 낮은 신호를 감지할 수 있었습니다. 생성된 효소는 중성 또는 약염기성 조건보다 산성 조건에서 더 활성이었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행한다면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 배양 중에 반응을 혼합하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 고처리량 스크리닝 분야의 연구자들이 생명 공학을 위한 새로운 효소 활성을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 스크리닝 키트 사용 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.