핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

핵산 여과 분리법(FINA, filtration isolation of nucleic acids)의 전반적인 목표는 원심분리기와 같은 실험실 장비를 사용하지 않고, 복잡한 검체로부터 PCR 증폭을 위한 게놈 DNA를 빠르고 간단하게 분리하는 것입니다. HIV 프로바이러스 DNA를 위한 이 신속한 종이 기반 DNA 추출 방법은 정량 PCR 진단 장치에 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 시료 준비 모듈과 PCR 튜브를 미리 준비할 수 있어 DNA 추출에 2분도 걸리지 않는다는 점입니다.

우리는 처음에 발뒤꿈치 채혈 혈액을 이용한 영아 조기 HIV-1 진단 테스트에 적용하기 위해 이 방법을 개발했습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 분들은 PCR 튜브 벽면에 세포 캡처 막을 고정하는 양면 테이프의 뒷면을 제거하는 과정에 숙련도가 필요하므로 다소 어려움을 겪을 수 있습니다. 해당 절차의 시연은 저희 실험실의 선임 기술자인 Jen Reed가 담당하겠습니다.

FINA 시료 준비 모듈 조립에 필요한 재료를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 2.6 mm 두께의 100% 면 패드를 35 x 35 mm 정사각형으로 잘라 블로팅 패드를 준비합니다. 종이 배킹 테이프가 부착된 플라스틱 파라핀 필름을 준비하십시오.

25 by 50 mm 크기의 파라핀 필름 조각을 자른 후, 펀치를 사용하여 테이프 중앙에 직경 7.14 mm의 구멍을 뚫습니다. 펀치를 사용하여 직경 8.35 mm의 원형으로 절단하여 결합된 유리 혈액 분리막 또는 캡처 디스크를 준비합니다. FINA 시료 준비 모듈을 조립하려면 핀셋을 사용하여 캡처 디스크를 블로팅 패드의 중앙에 배치합니다.

파라핀 필름 테이프의 배킹지를 제거하고, 파라핀 테이프 전체가 캡처 디스크의 중심부를 노출시키도록 캡처 디스크 위에 배치합니다. 파라핀 테이프를 약간 늘려 블로팅 패드를 덮고, 디스크의 모든 가장자리 주변에서 파라핀 테이프를 단단히 눌러 블로팅 패드에 부착시켜 디스크와 블로팅 패드 사이의 접촉을 최대화합니다. 캡처 막이 실시간 PCR 장비의 형광 검출을 방해하는 것을 방지하기 위해, 5.1 mm 테이프 디스크를 사용하여 캡처 막을 qPCR 튜브의 측면에 고정해야 합니다.

해머를 사용하여 시트 형태의 이중 코팅 폴리에스테르 진단용 테이프에서 원형으로 테이프 디스크를 펀칭하여 준비합니다. 핀셋을 사용하여 테이프 스티커 라이너의 한쪽 면을 제거합니다. 테이프를 200 µL PCR 튜브에 넣고, 튜브의 한쪽 벽면 하단 방향으로 부착합니다.

두 번째 스티커 라이너를 제거합니다. 이제 튜브에 준비된 디스크를 넣을 수 있습니다. 본 영상에서는 8e5 LAV 세포를 첨가한 전혈에서 프로바이러스 DNA를 검출하는 과정을 보여드리겠습니다.

이전에 냉동해 두었던 8e5 LAV 세포 펠렛을 얼음 위에서 해동합니다. 마이크로리터당 1~400개의 세포 농도가 되도록 동결 보존액으로 세포의 연속 희석액을 준비합니다. 각 희석액에서 10 µL의 세포를 취해 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다.

표준 곡선을 작성하기 위해 각 튜브에 HIV-1 음성 EDTA 처리 전혈 샘플 100 microliters를 추가합니다. 튜브 바닥을 다섯 번 가볍게 쳐서 혼합합니다. DNA 추출 과정을 시작하려면 triton X-100을 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하여 혈구 세포를 용해합니다.

튜브 바닥을 다섯 번 가볍게 쳐서 섞어줍니다. 혈액은 반투명한 붉은색으로 변해야 합니다. 혈액 시료 전체를 피펫으로 취해 캡처 디스크 위에 옮깁니다.

파라핀 테이프와 캡처 막 사이의 수밀 씰링을 통해 혈액이 막을 통해 흐르도록 합니다. 또한, 접촉 막과 블로팅 패드 어셈블리 사이의 밀착된 접촉은 샘플의 신속한 흡수를 보장합니다. 샘플이 필터를 통해 충분히 스며들 때까지 기다립니다.

혈액 용해물이 캡처 디스크에 흡수되어 디스크가 무광택으로 보입니다. 10 mmol 수산화나트륨 600 ~ 1,000 µL를 캡처 디스크 위에 한 방울씩 떨어뜨립니다. 필터가 붉은색에서 흰색으로 변하며, 이는 헤모글로빈이 제거되었음을 나타냅니다.

다음으로 블로팅 패드에서 디스크를 분리하고, 준비된 PCR 튜브 내의 테이프에 디스크를 부착합니다. 필터를 PCR 튜브에 넣은 후 즉시 샘플을 분석합니다. 프로토콜 본문에 설명된 대로 qPCR 마스터 믹스를 준비하고, 필터가 마스터 믹스로 완전히 덮여 반응 과정 내내 튜브 벽면에 고정되어 있는지 확인하십시오.

프로토콜 텍스트에 설명된 대로 실시간 PCR 장치를 사용하여 증폭을 수행합니다. 또는 qPCR을 즉시 수행할 수 없는 경우, 황산칼슘 건조제가 들어 있는 상자에서 필터를 밤새 건조하십시오. 다음 날, PCR 튜브의 캡을 닫고 실리카 건조제가 들어 있는 알루미늄 포일 파우치에 넣어 분석 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오.

이 방법은 서로 다른 복제 수를 가진 8e5 LAV 세포로부터 HIV-1 프로바이러스를 효율적으로 증폭할 수 있게 합니다. 실선은 내부 대조군이 반응당 500 copies 포함된 상태에서 4,000, 400, 40 및 10 8e5 LAV 세포를 첨가한 HIV-1 음성 전혈의 4회 반복 실험에서 얻은 증폭 곡선입니다. 점선은 임계값을 나타냅니다.

다음 그래프는 전혈 100 µL당 8e5 LAV 세포의 log copy number 대비 증폭 플롯에서 계산된 정량 사이클 값의 표준 곡선을 보여줍니다. 계산된 PCR 효율은 103%였습니다. HIV 프로바이러스 DNA 표준 곡선 반복 실험 또한 매우 재현성 높은 증폭 양상을 보였습니다.

또한, 500 copies의 hydroxy pyruvate reductase 내부 대조군이 존재한다는 점은 HIV-1 provirus의 copy 수와 관계없이 이 방법으로 혈액을 추출했을 때 PCR 억제가 일어나지 않음을 보여줍니다. 실선은 증폭 플롯을 나타내며, 점선은 임계값을 나타냅니다. 이 절차를 따르면 다양한 검체 유형에서 PCR 타겟을 증폭하여 관심 유전자를 검출할 수 있습니다.

예를 들어, 약물유전체학 스크리닝을 위한 구강 상피세포 스왑이나 동물 모델의 신속한 유전자형 분석을 위한 혈액 등이 있습니다. 혈액 매개 병원체를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 표준 주의 지침을 준수해야 함을 잊지 마십시오.