핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법
2016년 8월 6일
우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.
핵산의 여과 분리를 의미하는 이 FINA 방법의 전반적인 목표는 원심분리기와 같은 실험실 기기를 사용하지 않고 복잡한 검체에서 PCR 증폭을 위해 게놈 DNA를 빠르고 간단하게 분리하는 것입니다. HIV pro viral DNA에 대한 이 신속한 종이 기반 DNA 추출 방법은 정량적 PCR 진단 장치에 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플 전처리 모듈과 PCR 튜브를 미리 준비할 수 있어 DNA 추출에 2분 미만이 소요된다는 것입니다.
우리는 발뒤꿈치 혈액에서 HIV-1에 대한 조기 유아 진단 검사에 답하기 위해 샘플에 통합하기 위해 이 방법을 처음 개발했습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 PCR 튜브 측면에 세포 포획 멤브레인을 고정하는 양면 테이프의 뒷면을 제거하는 데 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 선임 기술자인 Jen Reed입니다.
FINA 샘플 준비 모듈을 조립하는 데 필요한 재료를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 2.6mm 두께의 100% 면 패드를 35 x 35mm 정사각형으로 잘라 블로팅 패드를 준비합니다. 종이 뒷면 테이프로 플라스틱 파라핀 필름을 준비합니다.
25 x 50mm 파라핀 필름을 자른 다음 망치를 사용하여 테이프 중앙에 직경 7.14mm의 구멍을 뚫습니다. 바운드 유리 혈액 분리기 멤브레인을 준비하거나 망치를 사용하여 직경 8.35mm의 원을 펀칭하여 디스크를 캡처합니다. FINA 시료 준비 모듈을 조립하려면 집게를 사용하여 캡처 디스크를 블로팅 패드 중앙에 놓습니다.
파라핀 필름 테이프의 뒷면을 제거하고 캡처 디스크 위에 올려 놓아 파라핀 테이프 전체가 캡처 디스크의 중심을 노출하도록 합니다. 파라핀 테이프를 약간 늘려 블로팅 패드를 덮고 파라핀 테이프를 단단히 눌러 디스크의 모든 가장자리를 둘러싼 블로팅 패드에 붙임으로써 디스크와 블로팅 패드 사이의 접촉을 극대화합니다.멤브레인이 Real-Time PCR 기기의 형광 검출을 차단하는 것을 방지하기 위해 캡처 멤브레인을 qPCR 튜브 측면에 고정하려면 5.1mm 테이프 디스크가 필요합니다.
망치를 사용하여 테이프 시트에서 양면 코팅 폴리에스터 진단 테이프 원을 펀칭하여 이 테이프 디스크를 준비합니다. 집게를 사용하여 테이프 스티커 라이너의 한쪽 면을 제거합니다. 테이프를 200마이크로리터 PCR 튜브에 넣고 한쪽 면과 튜브 바닥을 향해 붙입니다.
두 번째 스티커 라이너를 제거합니다. 이제 튜브가 준비된 디스크를 받을 준비가 되었습니다. 이 비디오에서는 8e5 LAV 세포가 급증한 전혈에서 프로비랄 DNA를 검출하는 방법을 시연할 예정입니다.
이전에 얼린 8e5 LAV 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동합니다. 마이크로리터당 1 - 400개 세포 범위의 농도로 동결 매체에서 세포의 연속 희석을 준비합니다. 각 희석액에서 10마이크로리터의 세포를 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다.
100마이크로리터의 신선한 HIV-1 음성 eDTA 처리된 전혈 샘플을 각 튜브에 추가하여 표준 곡선을 만듭니다. 튜브 바닥을 부드럽게 다섯 번 튕겨 섞습니다. DNA 추출 절차를 시작하려면 트리톤 X-100을 최종 농도 1%에 첨가하여 혈액 세포를 용해합니다.
튜브 바닥을 부드럽게 다섯 번 튕겨 섞습니다. 혈액이 반투명한 빨간색으로 변해야 합니다. 전체 혈액 표본을 캡처 디스크에 피펫으로 넣습니다.
파라핀 테이프와 포획 멤브레인 사이의 방수 밀봉은 혈액이 멤브레인을 통해 흐르도록 합니다. 또한 접촉막과 블로팅 패드 어셈블리 사이의 양호한 접촉으로 신속한 시료 흡수가 보장됩니다. 샘플을 허용하십시오.amp필터를 통해 스며듭니다.
혈액 용해물은 붙잡음 원판으로 적시고 원판은 매트로 나타납니다. 붙잡음 원판에 600에서 1, 10 mmol 수산화나트륨의 000 마이크로리터를 dropwise 추가하십시오. 필터가 빨간색에서 흰색으로 바뀌어 헤모글로빈이 제거되었음을 나타냅니다.
그런 다음 블로팅 패드에서 디스크를 분리하고 준비된 PCR 튜브의 테이프에 디스크를 붙입니다. PCR 튜브에 필터를 넣은 후 즉시 샘플을 분석합니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 qPCR 마스터 믹스를 준비하고 필터가 마스터 믹스로 완전히 덮여 있고 반응 전반에 걸쳐 튜브 측면에 고정된 상태를 유지하는지 확인합니다.
프로토콜 텍스트에 설명된 대로 실시간 PCR 장치를 사용하여 증폭을 수행합니다. 또는 qPCR을 즉시 수행할 수 없는 경우 황산칼슘 건조제가 들어 있는 상자에서 필터를 밤새 건조시킵니다. 다음 날, PCR 튜브의 캡을 씌우고 실리카 건조제가 든 포일 파우치에 넣고 분석 준비가 될 때까지 실온에서 보관합니다.
이 방법을 사용하면 8e5 LAV 세포에서 HIV-1 프로바이러스를 서로 다른 복제 수로 효율적으로 증폭할 수 있습니다. 실선은 내부 대조군의 반응당 500개의 복제가 있는 4, 000, 400, 40 및 10개의 8e5 LAV 세포로 스파이크된 HIV-1 음성 전혈의 4가지 복제에서 얻은 증폭 플롯입니다. 점선은 임계값을 나타냅니다.
다음 그래프는 전혈 100마이크로리터당 8e5 LAV 세포의 증폭 플롯 vs. log 복제 수에서 계산된 정량 주기 값의 표준 곡선을 보여줍니다. 계산된 PCR 효율은 103%였으며 HIV proviral DNA 표준 곡선 복제는 재현성이 높은 증폭도 제공합니다.
또한, 500개의 하이드록시 피루베이트 환원효소의 내부 대조군의 존재는 존재하는 HIV-1 프로바이러스의 복제의 수와 무관하게 이 방법으로 혈액을 추출함으로써 발생하는 PCR 억제가 없음을 보여줍니다. 실선은 증폭 플롯을 나타내고 점선은 임계값을 나타냅니다. 이 절차에 따라 다양한 검체 유형에서 PCR target을 증폭하여 관심 유전자를 검출할 수 있습니다.
예를 들어, 약물 유전학 검사를 위한 뺨 면봉 또는 동물 모델의 신속한 유전형 분석을 위한 혈액. 혈액 매개 병원체로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보편적인 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 기사는 전혈에서 HIV 프로바이러스 DNA의 신속한 종이 기반 DNA 추출 방법을 제시하여, 정량적 PCR을 통한 검출을 용이하게 합니다. 이 기술은 실험실 장비 없이 신속한 샘플 준비를 위해 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이오 테크놀로지
- 유전체학
- 진단 방법
배경
- FINA 방법은 복잡한 시료에서 게놈 DNA를 분리합니다.
- 진단 장치에 통합하도록 설계되었습니다.
- 샘플 준비는 미리 할 수 있습니다.
- 이 방법은 특히 유아 HIV 진단에 유용합니다.
연구 목적
- HIV 검출을 위한 신속한 DNA 추출 방법을 개발합니다.
- 샘플 준비 과정을 단순화합니다.
- 정량적 PCR 진단의 효율성을 향상합니다.
사용된 방법
- 핵산의 여과 분리(FINA) 방법.
- 종이 기반 추출 기술.
- 검출을 위한 정량적 PCR.
- 샘플 준비 모듈의 미리 준비.
주요 결과
- DNA 추출 과정은 2분 이내에 완료됩니다.
- 이 방법은 HIV 프로바이러스 DNA 추출에 효과적입니다.
- 실험실 기술자에 의한 절차 시연.
- 다른 유전자 마커에 적용할 수 있는 잠재력.
결론
- 이 방법은 DNA를 신속하고 효율적으로 추출하는 방법을 제공합니다.
- 다양한 진단 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.
- 추가 연구를 통해 유전자 검사에서의 유용성을 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Rapid, equipment-free DNA extraction from whole blood using the FINA method addresses a critical bottleneck in sample preparation for molecular diagnostics and early-stage biomarker discovery. By enabling highly sensitive, quantitative detection of nucleic acids in under two minutes, this approach supports accelerated assay development and translational research workflows. Its simplicity and scalability position it as a reusable capability for diverse genetic target validation across biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of genetic targets directly from complex biological matrices.
- Supports functional validation of disease-relevant biomarkers without specialized instrumentation.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing high-quality DNA for downstream PCR analysis.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible DNA extraction suitable for quantitative PCR workflows.
- Reduces sample preparation time, increasing throughput for screening campaigns.
- Allows pre-assembled modules to streamline assay setup and minimize operator variability.
Translational & Preclinical Research
- Enables sensitive detection of low-abundance targets for early disease model validation.
- Supports continuity from discovery to preclinical studies by providing consistent nucleic acid inputs.
- Facilitates rapid genotyping and biomarker assessment in animal models and clinical specimens.
Pipeline & Workflow Integration
The FINA method integrates at the interface of sample preparation and molecular analysis, bridging early discovery, lead identification, and translational research stages.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway analysis by providing immediate access to genomic DNA.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility for high-throughput PCR-based screens.
- Analytics: Generates quantitative outputs and standard curves for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains sample integrity and biomarker alignment across preclinical and clinical workflows.
- Enterprise Reuse: Offers a platform-agnostic extraction solution adaptable to multiple genetic targets and specimen types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and scalable DNA extraction without laboratory equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by minimizing sample prep bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of genetic assays and biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise for module assembly and sample handling.
- Minimal instrumentation needs, limited to pipettes and PCR devices.
- Standardization of module preparation is essential for reproducibility across teams.
- Adaptable to various specimen types, but membrane compatibility should be validated for new targets.
- Operator training is needed for consistent membrane assembly and sample application.
