Name: 핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 FINA 방법을 사용하여 HIV 전바이러스 DNA를 신속하게 추출하는 기술을. 이 종이 기반 DNA 추출법은 원심분리기 없이 2분 이내에 완료되며, 양적 PCR 진단에 활용됩니다.

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이 프로토콜 개발은 Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health 보조금 37774의 지원을 받았습니다. Real-Time PCR 시약 및 조언은 Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL에서 제공했습니다. 8E5-LAV 세포는 Rush Presbyterian의 Virology Quality Assurance Laboratory에서 제공했습니다. 세인트 루크 메디컬 센터. HIV-1 음성 혈액은 일리노이주 에반스턴에 있는 NorthShore University HealthSystems의 Core Lab에서 제공했습니다. 사진 촬영에 도움을 준 Mark Fisher에게 감사드립니다.

윤리 문 : 본 연구에 사용 된 전체 혈액 표본은 인체를 이용한 연구로 간주되지 않습니다. 시편은 만족 임상 진단 목적을 위해 수득하고,이 시험편의 나머지 부분은 FINA 연구 시험에 제공 하였다. 시편은 연구자 용이 개인의 신원을 확인할 수 없었다되도록 부호화 하였다. FINA 샘플 준비 모듈 1. 준비 <ol><li> A A 2.6 mm의 35 X 35 mm 2 두께의 100 % 코튼 패드를 절단하여 패드를 모래 바닥 준비합니다. 표본 당 하나의 패드를 잘라. </li><li> 다음 망치 중심 펀치 구멍을 사용하여 테이프의 중앙에 7.14 mm 직경의 구멍을 펀치 (50 () w mm 25 mm (H)) 파라핀 필름의 절단 조각이 용지 양면 테이프 플라스틱 파라핀 필름을 준비한다. 표본 당 하나의 테이프를 준비합니다. </li><li> 8.35 mm 직경의 원형 펀칭에 의해 결합 된 유리 혈액 분리막 (캡처 막) 디스크를 준비망치 중심 구멍 펀치를 사용하여. 표본 당 하나의 디스크를 펀치. 디스크는 2.3 ㎛의 입자 보유 능력을 갖는다. </li><li> 겸자를 이용하여 블롯 패드의 중앙에 포착 디스크를 배치하여 FINA 샘플 준비 모듈을 조립한다. 파라핀 테이프의 구멍이 노출 된 캡처 디스크의 중심 잎되도록 캡처 디스크 위에 파라핀 필름 테이프를 배치했다. </li><li> 블로 팅 패드를 충당하기 위해 약간 파라핀 테이프를 스트레칭하고 디스크의 모든 가장자리 주위에 블로 팅 패드에 붙어 단단히 파라핀 테이프를 눌러 디스크와 블로 팅 패드 사이의 최대 접촉을 확인합니다. </li><li> 나중에 사용하기 위해 실험 또는 비축에 필요한만큼 모듈을 확인합니다. </li></ol> qPCR의 튜브 (2)의 제조 <ol><li> 양면 polye의 원형 펀칭하여 형광 검출을 차단하는 멤브레인을 방지 qPCR에 튜브 측으로 세포 포획 막을 고정하는 5.1 mm 테이프 디스크를 준비테이프의 시트에서 망치 구동 펀치 진단 테이프를 오스터. 표본 당 하나의 테이프 디스크를 준비합니다. </li><li> 테이프의 스티커 라이너의 한면을 제거합니다. 한쪽에 튜브의 바닥쪽으로 튀어 나와, 200 μl의 PCR 튜브에 테이프를 넣습니다. 두 번째 스티커 라이너를 제거합니다. 튜브는 이제 디스크 제조를 수신 할 준비가되어있다. </li><li> 나중에 사용하기 위해 실험 또는 비축에 필요한만큼의 튜브를 생성합니다. </li></ol> 3. 고안 혈액 표본 참고 : 정품 시험편을 준비하는 경우, 4 단계로 진행합니다. <ol><li> 바이러스학 품질 보증 실험실에서 얻은 HIV-1 프로 바이러스의 단일 복사본을 품고 해동 8e5 - LAV 셀 (15) (VQA, 러쉬 장로교 / 세인트 루크 메디컬 센터, 시카고, IL.). 참고 : 그들은 / μL 4,000 세포의 농도로 동결 세포 펠릿으로 저장됩니다. 이전 9 바와 같이 세포 수를 확인 하였다. </li><li> 산이 준비/ μL 일 400 세포의 농도 범위로 배지 (90 % 소 태아 혈청, 10 % 디메틸 술폭 시드)를 동결 IAL 희석. </li><li> 미세 원심 튜브에 희석액에서 각각 10 μL 피펫 셀. 8e5 - LAV 복사 번호 10-4,000의 표준 곡선을 만들기 위해 각각의 튜브에 신선한 HIV-1 네거티브 EDTA 처리 된 전체 혈액 샘플 100 μl를 추가합니다. 부드럽게 튜브의 5 배를 바닥을 쓸어 넘겨 섞는다. </li></ol> 4. FINA 추출을 수행 <ol><li> 110 μL 전혈 단계 3.3에서 세포)에 1 % (11 ㎕의 10 % 트리톤 X100 최종 농도 트리톤 X100)을 첨가하여 다운 Lyse 혈구. </li><li> 부드럽게 튜브의 5 배를 바닥을 쓸어 넘겨 섞는다. 혈액은 반투명 빨간색을 설정해야합니다. </li><li> 피펫 캡처 디스크에 혈액 표본의 모든. 참고 : 파라핀 테이프 캡처 막 사이의 물이 꽉 밀봉 피가 막 흐르는 것을 보장하고, 캡처 m 사이 좋은 접촉embrane 및 블로 팅 패드 어셈블리는 빠른 샘플 위킹을 보장합니다. </li><li> 샘플 필터를 통해 흡수 할 수 있습니다. 주 : 모세관 현상에 블롯 패드에 피 파쇄 심지를 캡처 디스크 표면의 게놈 DNA를 캡쳐. 이 매트를 표시 할 때 해물 디스크에 배어있다. </li><li> 캡처 디스크에 600~1,000 ㎕의 10 mM의 NaOH를 드롭 현명한을 추가합니다. 주 : 세척 완충액은 600 μL의 대량 첨가로 첨가 할 수있다. 버퍼는 소수성 파라핀 테이프에 액 적을 형성하고, 약 20 초간의 디스크로 구멍을 통해 심지 할 것이다. 이 필터는 헤모글로빈의 흰색을 나타내는 통관에 빨간색으로 변경됩니다. </li><li> 집게와 블로 팅 패드에서 디스크를 분리하고 준비된 PCR 튜브에 테이프에 디스크를 적용합니다. 필터에 남아있는 붉은 색이있는 경우 튜브에 배치하기 전에 필터를 취소 세척 버퍼의 50 ~ 100 μl를 추가합니다. 참고 : 가끔, 초과 압력이 준비 중에 적용블로 팅 패드에서 분리 동안 멤브레인 층의 파티션에서 FINA는 모듈의 결과. 이러한 디스크를 폐기하고 새로운 샘플을 준비합니다. </li><li> 필터는 PCR 튜브에 배치 한 후, 바로 샘플을 분석 할 수 있습니다. 또한, 상자 포함 된 황산 칼슘 건조 건조 하룻밤은 다음 분석을위한 준비가 될 때까지 실리카 건조 및 저장과 호일 주머니에 모자 장소. </li></ol> 5. qPCR에 반응 <ol><li> 이전에 9,11 바와 같이 HIV는 특정 프라이머 및 프로브를 사용하여 반응 당 100 μL qPCR에 마스터 믹스를 준비합니다. 내부 증폭 제어 증폭 억제제의 존재를 모니터링하고 음의 샘플이 진정한 부정적 있는지 확인을 포함합니다. 필터가 완전히 마스터 믹스 필터 반응을 통해 튜브의 측면에 고정 된 상태를 유지하는 것이 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 이전 9 바와 같이 실시간 PCR 기기를 사용하여 증폭을 수행한다. </li></ol>

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</ol>

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빠른 치료 액세스 링크 EID 의한 HIV 감염 16 유아 사망률 감소하는 것으로 입증되었다. 때문에 유아의 혈액 모체 항체의 지속성 신속 HIV 항체 테스트는 HIV에 노출 된 유아의 상태를 결정하는 유틸리티를 제한하고있다. 보건기구 (WHO)는 HIV-1 양성 산모에게서 태어난 모든 유아는 바이러스 학적 검사 (17)를 사용하여, 연령 4 ~ 6 주에 테스트해야하는 것이 좋습니다. 우리는 (61) 남아프리카 유아 (11)의 작은 분야 평가에서 보여 100 %의 민감도와 특이 단일 복사본 검출 할 수있는 전체 혈액 표본에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 검출과 정량을위한 분석의 발전을보고했다. 백 마이크로 리터 또는 전혈 이상의 손가락 스틱 뒤꿈치를 통해 수집하고 FINA 모듈 (18, 19)를 통해 처리 될 수있다. 이러한 혈액 시료는 증폭이 방법 IDE하기 전에 적어도 한 달 동안 저장 될 수있다알 실험실에서 멀리있는 유아를 테스트합니다....

여러 보고서를 모두 사용할 수있는 절묘한 감성과 분자 진단의 특이성을 목적으로 현장 진료 (POC) 장치 1-5 사용하기 위해 종이 - 또는 멤브레인 기반 추출 방법의 개발을 논의했다. 세계 보건기구 (WHO) 성병 진단 이니셔티브는 POC의 (경제적, 민감한, 특정, 사용자 친화적 인, 신속하고 강력한 장비가없는 그것을 필요로하는 사람들 배달)을 설명하는 이상적인 특성 안심 용어를 만들어 낸 시험 6. 이 가이드 라인 중 장비가없는 특징은 분자 진단 달성하기 위해 특히 도전이다. 그러나, 필드에있는 모든 혁신은 가장 필요로하는 사람들을 도달 목표를 진행하며, 희망은 기존의 기술 (7)을 적용하여 테스트 성능을 단기적 개선이 있습니다. 여기에서 우리는 전체 혈액에서 DNA를 추출하는 간단한 프로토콜을 설명그 복잡한 화학 또는 실험실 장비를 필요로하지 않습니다. FINA (핵산 여과 분리) 시료의 제조 방법은 원래 샘플에 응답 케어 포인트 (POC)의 일부 정량적 PCR 같이 HIV-1 프로 바이러스를 검출하기 위해 전혈로부터 백혈구 DNA를 추출하기 위해 개발 된 제한된 리소스 설정 8-11에 사용 (qPCR에) 초기 유아 진단 (EID) 플랫폼입니다. FINA 추출 가역적 카오 트로픽 제 (12)의 존재 하에서 DNA 결합 실리카 막, 실리카 코팅 된 상자성 입자를 사용하는 종래의 정제 방법과 다르다. 대신, FINA 직접 전체 혈액에서 세포의 DNA를 추출하기 위해 분리막을 통해 수직 여과를 사용합니다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 PCR 튜브에 직접 배치 및 하나 이후 즉시 증폭 9 건조 PCR 반응 또는 공기를 사용할 수있다. 어떤 카오 트로픽 제, 페놀 또는 알코올이 샘플의 추출에 이용되지 않으며, elimina팅 추출 처리 (13, 14)로부터 유도 qPCR의 강력한 억제제를 제거하기 위해 필요한 광범위한 세척 단계. FINA 막을 시험편 멤브레인에 추가되기 전에 세포 용해 (11)에 의해 해방 된 세포 중 9 또는 게놈 DNA를 포착 할 수있다. 셀 캡처, 전체 피가 막에 직접 추가됩니다. 세포를이어서 10 mM의 수산화 나트륨을 첨가함으로써 막에 용해된다. 이 방법의 장점은 단지 3 단계를 포함하는 것이있다 : 1) 샘플을 첨가하는 단계; qPCR에 관 2) 세포 용해 / 세척 및 3) 필터 디스크 위치. 이 방법의 단점은 막 만의 막 디스크의 직경에 비례 셀들의 정의 된 번호를 저장할 수 있다는 것이다. EID 필요한 검출 한계에 도달하기 전혈 100 μL은 qPCR에 튜브를 배치하기에 너무 큰 필터를 수반 샘플 입력을 요구한다. 컬렉션에 추가하기 전에 샘플을 세제로 혈액 세포를 용균막을 처리하는 단계를 추가하지만 동일한 샘플 크기보다 작은 필터를 사용할 수있다. 우리는 높은 재현성, 단일 복사본 검출하고,이 테스트 구성 (11)를 사용하여 혈액 100 ㎕에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 한 작은 10 복사본의 정량을 입증 할 수 있었다. 이 보고서에서 우리는 원래 실험실 사용하기 위해 개발로 FINA 프로토콜을 설명합니다. FINA 시료 전처리 모듈로 알려진 막 / 필터 샌드위치 큰 일괄 적으로 준비하고 나중에 사용하기 위해 비축 할 수있다. 표본 경우이 과정이 2 분 소요 크기의 배치를 변화에서 수행 할 수 있습니다 추​​출 할 수 있습니다. qPCR에 바로 실행될 수 있거나 qPCR을 수행하는 것이 편리 할 때까지 삽입 된 DNA를 함유하는 필터를 저장할 수있다. 이 방법은 낮은과 높은 리소스 설정 모두에서 시료의 일상적인 분석을위한 매우 편리합니다.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 블로팅 패드</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M 양면 폴리에스테르 진단 테이프&nbsp;</td><td>3M 의료 전문</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; l qPCR 스트립 튜브</td><td>애질런트</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>광학 스트립 캡</td><td>애질런트</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCR 시스템</td><td>애질런트</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>221465</td><td>A.C.S. 시약</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td>분자</td></tr>생물학 <tr><td>태아 소 혈청, 인증, 미국 원산지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>해머 구동 작은 구멍 펀치 3/16" 구멍 직경 (5.1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>해머 구동 작은 구멍 펀치 1/4" 구멍 직경 (7.14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>해머 구동 작은 구멍 펀치 5/16" 구멍 직경 (8.35 mm)</td><td>맥마스터 카</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 dna 추출 방법

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA 핵산 여과 분리 미만에서 2 분에 전혈 세포에서 DNA를 추출 분리막 및 흡수 패드를 통해 여과에 수직을 이용하는 신규 추출법이다. 혈액 시료는 세제 혼합 간단히 처리 및 분리막을 피펫에 의해 적용된다. 해물이 분리막의 표면에, 게놈 DNA를 캡처, 모세관 현상에 의한 블롯 패드에 심지. 추출 된 DNA는 PCR 억제제 흡수 블롯 패드에 악 상기 간단한 세척 단계 동안 막에 유지된다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 추가의 정제없이 PCR 반응에 첨가된다. 이러한 간단한 방법은 실험 장비를 필요로하지 않고 쉽게 저렴 실험실 용품으로 구현 될 수있다. 여기에서 우리는 초기의 모델로 100 μL 전체 혈액에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 고감도 검출 및 정량을위한 프로토콜을 설명쉽게 다른 유전 적 목표에 적용 할 수있는 HIV의 영아 진단.

8e5 - LAV 세포 아군 전체 혈액에서 프로 바이러스 DNA를 추출하기위한 워크 플로는 그림 1과 같다. 2는 FINA 샘플 모듈을 보여주고 qPCR에 튜브를 준비 그림. 인위적인 시험편 (도 3)의 표준 곡선에 도시 된 바와 같이,이 방법은 다른 사본 번호에 8e5-LAV 세포에서 HIV-1 프로 바이러스의 효율적인 증폭을 허용한다. PCR 효율 = -1 + 10 (-1 / 경사)으로부터 계산 한 103 %의 효율을 얻었다. 라인의 방정식은 R² = 0.996의 상관 관계 = -3.25x + 27.95 Y이었다. 에이즈 프로 바이러스 DNA의 표준 곡선은 표 1에서 알 수 있듯이 또한 높은 재현성 증폭을 복제. 또한 Hydroxypyruvate 환원 효소가 다수의 독립 FINA으로 혈액을 추출 ...

우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

핵산 여과 분리법(FINA, filtration isolation of nucleic acids)의 전반적인 목표는 원심분리기와 같은 실험실 장비를 사용하지 않고, 복잡한 검체로부터 PCR 증폭을 위한 게놈 DNA를 빠르고 간단하게 분리하는 것입니다. HIV 프로바이러스 DNA를 위한 이 신속한 종이 기반 DNA 추출 방법은 정량 PCR 진단 장치에 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 시료 준비 모듈과 PCR 튜브를 미리 준비할 수 있어 DNA 추출에 2분도 걸리지 않는다는 점입니다.우리는 처음에 발뒤꿈치 채혈 혈액을 이용한 영아 조기 HIV-1 진단 테스트에 적용하기 위해 이 방법을 개발했습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 분들은 PCR 튜브 벽면에 세포 캡처 막을 고정하는 양면 테이프의 뒷면을 제거하는 과정에 숙련도가 필요하므로 다소 어려움을 겪을 수 있습니다. 해당 절차의 시연은 저희 실험실의 선임 기술자인 Jen Reed가 담당하겠습니다.FINA 시료 준비 모듈 조립에 필요한 재료를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 2.6 mm 두께의 100% 면 패드를 35 x 35 mm 정사각형으로 잘라 블로팅 패드를 준비합니다. 종이 배킹 테이프가 부착된 플라스틱 파라핀 필름을 준비하십시오.25 by 50 mm 크기의 파라핀 필름 조각을 자른 후, 펀치를 사용하여 테이프 중앙에 직경 7.14 mm의 구멍을 뚫습니다. 펀치를 사용하여 직경 8.35 mm의 원형으로 절단하여 결합된 유리 혈액 분리막 또는 캡처 디스크를 준비합니다. FINA 시료 준비 모듈을 조립하려면 핀셋을 사용하여 캡처 디스크를 블로팅 패드의 중앙에 배치합니다.파라핀 필름 테이프의 배킹지를 제거하고, 파라핀 테이프 전체가 캡처 디스크의 중심부를 노출시키도록 캡처 디스크 위에 배치합니다. 파라핀 테이프를 약간 늘려 블로팅 패드를 덮고, 디스크의 모든 가장자리 주변에서 파라핀 테이프를 단단히 눌러 블로팅 패드에 부착시켜 디스크와 블로팅 패드 사이의 접촉을 최대화합니다. 캡처 막이 실시간 PCR 장비의 형광 검출을 방해하는 것을 방지하기 위해, 5.1 mm 테이프 디스크를 사용하여 캡처 막을 qPCR 튜브의 측면에 고정해야 합니다.해머를 사용하여 시트 형태의 이중 코팅 폴리에스테르 진단용 테이프에서 원형으로 테이프 디스크를 펀칭하여 준비합니다. 핀셋을 사용하여 테이프 스티커 라이너의 한쪽 면을 제거합니다. 테이프를 200 µL PCR 튜브에 넣고, 튜브의 한쪽 벽면 하단 방향으로 부착합니다.두 번째 스티커 라이너를 제거합니다. 이제 튜브에 준비된 디스크를 넣을 수 있습니다. 본 영상에서는 8e5 LAV 세포를 첨가한 전혈에서 프로바이러스 DNA를 검출하는 과정을 보여드리겠습니다.이전에 냉동해 두었던 8e5 LAV 세포 펠렛을 얼음 위에서 해동합니다. 마이크로리터당 1~400개의 세포 농도가 되도록 동결 보존액으로 세포의 연속 희석액을 준비합니다. 각 희석액에서 10 µL의 세포를 취해 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다.표준 곡선을 작성하기 위해 각 튜브에 HIV-1 음성 EDTA 처리 전혈 샘플 100 microliters를 추가합니다. 튜브 바닥을 다섯 번 가볍게 쳐서 혼합합니다. DNA 추출 과정을 시작하려면 triton X-100을 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하여 혈구 세포를 용해합니다.튜브 바닥을 다섯 번 가볍게 쳐서 섞어줍니다. 혈액은 반투명한 붉은색으로 변해야 합니다. 혈액 시료 전체를 피펫으로 취해 캡처 디스크 위에 옮깁니다.파라핀 테이프와 캡처 막 사이의 수밀 씰링을 통해 혈액이 막을 통해 흐르도록 합니다. 또한, 접촉 막과 블로팅 패드 어셈블리 사이의 밀착된 접촉은 샘플의 신속한 흡수를 보장합니다. 샘플이 필터를 통해 충분히 스며들 때까지 기다립니다.혈액 용해물이 캡처 디스크에 흡수되어 디스크가 무광택으로 보입니다. 10 mmol 수산화나트륨 600 ~ 1,000 µL를 캡처 디스크 위에 한 방울씩 떨어뜨립니다. 필터가 붉은색에서 흰색으로 변하며, 이는 헤모글로빈이 제거되었음을 나타냅니다.다음으로 블로팅 패드에서 디스크를 분리하고, 준비된 PCR 튜브 내의 테이프에 디스크를 부착합니다. 필터를 PCR 튜브에 넣은 후 즉시 샘플을 분석합니다. 프로토콜 본문에 설명된 대로 qPCR 마스터 믹스를 준비하고, 필터가 마스터 믹스로 완전히 덮여 반응 과정 내내 튜브 벽면에 고정되어 있는지 확인하십시오.프로토콜 텍스트에 설명된 대로 실시간 PCR 장치를 사용하여 증폭을 수행합니다. 또는 qPCR을 즉시 수행할 수 없는 경우, 황산칼슘 건조제가 들어 있는 상자에서 필터를 밤새 건조하십시오. 다음 날, PCR 튜브의 캡을 닫고 실리카 건조제가 들어 있는 알루미늄 포일 파우치에 넣어 분석 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오.이 방법은 서로 다른 복제 수를 가진 8e5 LAV 세포로부터 HIV-1 프로바이러스를 효율적으로 증폭할 수 있게 합니다. 실선은 내부 대조군이 반응당 500 copies 포함된 상태에서 4,000, 400, 40 및 10 8e5 LAV 세포를 첨가한 HIV-1 음성 전혈의 4회 반복 실험에서 얻은 증폭 곡선입니다. 점선은 임계값을 나타냅니다.다음 그래프는 전혈 100 µL당 8e5 LAV 세포의 log copy number 대비 증폭 플롯에서 계산된 정량 사이클 값의 표준 곡선을 보여줍니다. 계산된 PCR 효율은 103%였습니다. HIV 프로바이러스 DNA 표준 곡선 반복 실험 또한 매우 재현성 높은 증폭 양상을 보였습니다.또한, 500 copies의 hydroxy pyruvate reductase 내부 대조군이 존재한다는 점은 HIV-1 provirus의 copy 수와 관계없이 이 방법으로 혈액을 추출했을 때 PCR 억제가 일어나지 않음을 보여줍니다. 실선은 증폭 플롯을 나타내며, 점선은 임계값을 나타냅니다. 이 절차를 따르면 다양한 검체 유형에서 PCR 타겟을 증폭하여 관심 유전자를 검출할 수 있습니다.예를 들어, 약물유전체학 스크리닝을 위한 구강 상피세포 스왑이나 동물 모델의 신속한 유전자형 분석을 위한 혈액 등이 있습니다. 혈액 매개 병원체를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 표준 주의 지침을 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

도구 및 화학 순차적으로 전기없이 샘플의 단백질이어서 핵산을 분리 설명되어 있습니다. 도구는 격리 화학은 고체 상 추출 원리에 기초하는 동안 전송 피펫 내에서 개최 sorbent 구성되어 있습니다. 격리된 macromolecules는 immuno 기반 및 PCR 기반 assays에 의해 분석할 수 있습니다.

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.

지역 사회 기반의 설정에서 획득 샘플의 신속한 분별 및 전체 혈액 성분의 분리

여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

이 연구는 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 고품질 핵을 분리하는 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜을 설명합니다.

단일 핵 염기서열분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 단일 핵을 분리하기 위한 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 추출을 가속화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 표준 스윙 버킷 플레이트 로터와 호환되는 맞춤형 3D 프린팅 랙을 활용함으로써, 연구자들은 캡이 있는 최대 48개의 스핀 컬럼 또는 캡 없이 최대 116개의 스핀 컬럼을 동시에 처리할 수 있어 수동 마이크로 원심분리기 방식에 비해 취급 시간을 크게 줄일 수 있습니다.

24웰 랙을 이용한 중간 처리량 컬럼 DNA 추출

전통적인 핵산 quantitation 방법론을 실천하고 효율적인 대안으로 NanoDrop microvolume 시스템의 사용은 두 microvolume 핵산 quantitation 프로토콜의 시범을 통해 설명합니다.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

의사 소통이 dsDNA와 단백질 quantitation에 대한 BioSpec - UV - VIS 나노 분광 광도계의 정확성과 재현성에 대한 데이터를 제공합니다. 자동 닦는 함수가 처리량과 더 정확한 결과를 위해 최소한의 carryover 결과를 개선하는 동안에도 초소형 볼륨 (1-2 패), 재현성이 우수합니다.

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

이 동영상은 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 물질로부터 DNA 추출을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이것은 조직 섹션 크실렌과 deparaffinized하는 멀티 일 절차, 에탄올과 rehydrated 이후 유전자의 특정 또는 게놈 차원의 분석을 위해 DNA를 정화하고 분리 proteinase K로 처리됩니다.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

배우세요 FINA 방법을 사용하여 HIV 전바이러스 DNA를 신속하게 추출하는 기술을. 이 종이 기반 DNA 추출법은 원심분리기 없이 2분 이내에 완료되며, 양적 PCR 진단에 활용됩니다.

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