Name: 거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 학습하세요 HIV-1 Gag가 거대한 단일 층 소포(GUV) 막에 결합하는 과정을 시각화하는 방법을. 전기형성법과 YFP 표지 단백질을 활용하여 지질-단백질 상호작용을 연구하고 바이러스 조립 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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우리는 도움이 토론 모하메드 살림, 징 우 및 Krishnan Raghunathan에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 촬영하는 동안 도움을 프리 야 Begani 감사합니다. 이 작품은 (AO에) R01 AI071727 및 (SLV에) R01 GM110052은 건강의 국립 연구소에 의해 부여 지원됩니다.

주 1 : 밀 배아 해물 기반 시험 관내 전사 번역 시스템을 사용 개그 단백질의 발현 HIV-1 개그 1. 준비 <ol><li> (-20 ºC에서 다른 시약을 밀 배아 해물는 -80 ºC에서 저장된다) 냉동고에서 상업 밀 배아 CECF 키트의 모든 시약을 제거합니다. 얼음을 해동하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 성분을 혼합한다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 믹스-1 (사료 혼합) </td><td></td></tr><tr><td> 수유 솔루션 </td><td> 900 μL </td></tr><tr><td> 아미노산 </td><td> 80 μL </td></tr><tr><td> 메티오닌 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 1000 μL </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 믹스-2 (해물 믹스) </str옹&gt; </td><td></td></tr><tr><td> 맥아 해물 </td><td> 15 μL </td></tr><tr><td> 의 RNase없는 물 </td><td> 7 μL </td></tr><tr><td> 아미노산 </td><td> 4 μL </td></tr><tr><td> 메티오닌 </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> TE 버퍼의 플라스미드 DNA (1 μg의 / μL) ** </td><td> 4 μL </td></tr><tr><td> 반응 완충액 </td><td> 15 μL </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 μL </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 50 μL </td></tr></tbody></table> 표 1 : 밀 배아 반응에 필요한 혼합물의 조성물. 주 : 결합 실험 개그 멤브레인의 RNase 의해 RNA 제거의 효과를 조사하기위한 경우의 RNase가없는 물 리보 뉴 클레아 제 저해제를 교체한다. 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 불순물이 없어야한다. 그러나, Plasmids 종래 사용하여 제조하지만, 독소가없는 플라스미드 아이솔레이션 키트는 성공적으로 사용 불가. 제조업체의 지시도 클레아없는 물에 용해 DNA를 사용하는 것이 좋습니다. TE [10 mM 트리스 - 염산 1 mM의 EDTA를 포함하는 (PH 7.4)]에 현탁 DNA를 사용하는 경우, TE의 EDTA는 수율에 영향을 미칠 수 있기 때문에, DNA의 낮은 농도를 사용하지 마십시오. 0.8-1 μg의 / μL의 농도 범위에서 TE 완충액 플라스미드가 성공적으로 사용되어왔다. <ol start="2"><li> 첫 번째 반응 카세트 (투명 챔버)에 공급 혼합물 (믹스-1)를 추가합니다. 그런 다음 다른 챔버 (빨간색)에 해물 믹스 (MIX-2)를 추가합니다. 각각의 챔버에 혼합물을 추가하는 동안 그 솔루션 구성 요소의 비효율적 인 교류로 이어질 때문에 반응의 효율을 감소시킬 수 있기 때문에, 모든 거품을 소개하지 마십시오. </li><li> 키트에 제공되는 접착 필름 챔버 커버. </li><li> 카세트 홀더 incuba으로 반응 카세트를 삽입테 에펜 도르프 써모 R. 900 rpm의 일정한 흔들림 속도에서 24 ºC에서 24 시간 동안 어셈블리 </li></ol> 주 2 : 전기 주조 및 수확 밀 배아 해물로 준비 GUVs GUVs 2. 준비 <ol><li> 테플론 라이너 늘어서 및 파라 필름으로 포장 스크류 캡 유리 병에 클로로포름 클로로포름의 혼합물 및 메탄올 등의 무기 용매에 용해 나누어지는 지질. 해밀턴 형 유리 주사기와 지질을 처리하거나, 사용 가능한 경우, 클로로포름에 강한 플라스틱 팁. -20 ºC 냉동고에서 GUV의 제조에 사용되는 지질을 함유하는 유리 바이알을 꺼내어. <ol><li> 유리 병을 실온으로 평형되면, 지질 현탁액은 분명 육안 검사에 의해 확인합니다. 이러한 팔미 토일 - 올레 오일 포스파티딜 세린 (POPS) 및 PI (4,5) P 2와 지질, 특히 산성 지질의 품질, 성공적인 실험을 위해 중요하다. 있는 지질을 사용하지 마십시오이상이 2 개월 분량 씩한다. </li></ol></li><li> 원하는 온도까지 가열 블록을 미리 가온. 이 온도는 가장 높은 T의 m과 지질 (들)의 융점 (T m에서)보다 적어도 5 ºC 높아야한다. </li><li> 원하는 몰 지질 비율에 따라 필요한 지질 볼륨을 계산합니다. 표 2에 나타낸 바와 같이 여기에 결합 HIV-1 개그 공부 다음 몰비를 사용한다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 지질 믹스 </td><td> 몰비 </td><td> 볼륨 (μL에서) </td><td> 주식 농도 </td></tr><tr><td> POPC +는 + Chol을 팝 </td><td> 46.​​6 + 23.3 + (30) </td><td> 19.74 + 10.18 + 6.57 </td><td> POPC, POPS, Chol을 10 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol을 + 뇌-PI (4,5) P (2) </td><tdROWSPAN = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16.11 + 8.3 + 6.25 + 58.19 </td><td> POPC, POPS, Chol을 10 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> 뇌-PI (4,5) P 2 : 1 ㎎ / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 2 : 다른 지질 볼륨 GUVs를 얻기 위해 사용. <ol start="4"><li> 깨끗한 나사 덮인 유리 병에 지질의 원하는 볼륨을 추가합니다. </li><li> 사용 (카탈로그에 설명 된대로) 크기 25 × 50 X 1.1 mm 3, 저항 70-100 Ω을의 슬라이드를 ITO가 코팅. 클린 벤치에 두 ITO 코팅 된 슬라이드를 놓습니다. 각 전기 주조 챔버는 두 인듐 - 주석 - 산화물 (ITO) 코팅 된 유리 슬라이드를 요구한다. 유리 슬라이드의 도전 측이 멀티 미터를 사용하여 저항을 확인하여이 위를 향하도록되어 있는지 확인합니다. 그것은 약 200 Ω의 값을 표시해야합니다. 슬라이드의 표면이 부드럽게 보풀이없는 와이프를 사용하여 70 % 에탄올로 닦아 깨끗해야합니다. </li><li> RI에 의해 주사기 바늘의 외부 표면을 세정클로로포름을 nsing 및 열 블록에 주사기를 놓습니다. </li><li> 이 위를 향하도록 도전면 열 블록에 새로운 ITO 코팅 유리 슬라이드를 놓고는 일반적으로 원하는 온도를 2 ~ 3 분에 평형 수 있습니다. 유리 슬라이드에 ITO 코팅이 절차를 청소 중에 손상 될 수있는 잠재적 인 위험에 대한 ITO 코팅 유리 슬라이드를 재사용하지 말 것. </li><li> 균일 한 유리 슬라이드에 지질의 확산 아직 빠른에 대한 각각의 슬라이드에 대한 지질 혼합물의 40 ~ 50 μL의 볼륨을 사용합니다. 클로로포름 같은 적절한 유기 용매로 전체 볼륨을 조절합니다. <ol><li> 유리 슬라이드에서 지질 혼합물의 총 부피의 절반을하고 즉시 (슬라이드 걸쳐 바늘 2-3 회 이동) 균일 한 지질막을두고 세정 주사기 (단계 2.6)를 사용하여 지질 확산. 얇은 ITO 코팅의 손상을 피하기 위해 완만하게 (그러나 신속하게) 지질 막을 확산. 비 균일 한 확산 또는 차선의 원인이 확산 거친수율 또는 GUVs의 계산 이질성. </li><li> 따라서, 이후 다음 단계로 진행하기 전에 확산 지질 막을 조사하여 균일 한 확산을 보장한다. 필름의 불투명도가 과도하게 불균일 나타나면, 새로운 슬라이드를 사용하여 절차를 다시. </li></ol></li><li> 코팅 된면이 위를 향하도록 페트리 접시 내부에 코팅 된 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 반복 또 다른 ITO 코팅 된 슬라이드를 사용하여 혼합물의 나머지 부분에 대한 2.6-2.9 단계. </li><li> 유기 용매의 흔적을 제거하기 위해 60 ~ 90 분 동안 종래의 진공 탈수 챔버에 슬라이드를 모두 함유하는 페트리 접시를 배치했다. </li><li> 이 과정에서, 열 블록 (대부분의 경우 65 ° C)와 미리 따뜻한 300 mM의 인큐베이터에서 수크로오스 용액과 동일한 온도로 설정 배양기. </li><li> 건조 후, 벤치에 페트리 접시를 가져 깨끗한 표면에 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 70 % 에탄올 건조 그것을 공단을 이용하여 PDMS 개스킷 (도 1)를 청소tely. </li><li> 그림 1과 같이 조심스럽게 단단히은 개스킷 형태의 그 물이 꽉 밀봉 그래서 누를 때 지질 코팅 된 유리 슬라이드에 놓습니다. PDMS의 가스켓과 슬라이드 사이의 간격이 없음을 확인합니다. 이는 수크로오스 용액을 보유 얕은 챔버의 형성을 초래한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> 그림 1 :. 전기 주조에 사용되는 ITO 코팅 유리 슬라이드의 레이아웃 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="16"><li> 모든 거품없이 미리 예열 자당 용액으로 챔버를 입력합니다. </li><li> 꽉 도장을 만들기 위해 상단에있는 다른 코팅 된 슬라이드를 놓습니다. 기포가 없는지 확인합니다. 최종 조립체는도 2에 도시 된 바와 같이. 나타나는 챔버 날기를 고정해야g 바인더 클립. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> 그림 2 :. 전기 주조 챔버 (측면보기)의 도식 표현 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="18"><li> 흡인하여 과량의 크로스를 제거하고 보풀이없는 와이프를 사용하여 슬라이드를 청소합니다. 도전 측면이 바 균일 한 접촉이되도록 구리 막대에 슬라이드를 고정합니다. 유리 슬라이드의 한 도전 측이 하나의 구리 막대와 접촉에 있는지 확인합니다. </li><li> 악어 클립을 사용하여 함수 발생기의 출력과 구리 막대를 연결한다. 어셈블리가 원하는 온도에 평형 수 있도록 인큐베이터 내부의 어셈블리를 놓습니다. </li><li> 10 Hz의 정현파의 주파수와 90 분 동안 1 V의 전위차를 적용한다. Ensur도 3에 도시 된 바와 같이 전압이 1 V로 멀티 인 E는. 90 분 동안 처리를 계속. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> 그림 3 :. 멀티 미터에서 전극 주파수 및 전류를 측정하기 위해 배치되는 위치 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="21"><li> 90 분 후, 천천히 2 Hz로 주파수를 감소시키고 추가로 10 분 동안 전기 주조를 계속한다. 이 기간 동안, 체외 번역 반응에서 수확 (3.1-3.2 단계). </li><li> 함수 발생기를 끄고 어셈블리 (인큐베이터을 끄고 약간 열린 인큐베이터 덮개를 두어)을 서서히 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 냉각 후, 발전기에 케이블을 분리슬라이드 어셈블리에서. GUVs은 매우 취약 할 수 있으므로 매우 조심스럽게 처리해야 할 수 있습니다. 조심스럽게 벤치에 어셈블리를 가져온다. </li><li> 부드럽게 집게를 사용하여 상부 슬라이드를 제거하여 챔버를 분해한다. 깨끗한 튜브에 상처 1,000 μL 팁과 전송을 사용하여 크로스 서스펜션 포함 GUVs을 수확. GUVs의 혼란을 방지하기 위해 부드럽게 튜브를 처리합니다. </li><li> 즉시 GUVs를 사용합니다. 실온 보관시 GUVs 수확 후 적어도 90 분 동안 안정하다. </li></ol> 3. 수확 체외 번역 반응 <ol><li> 관에 마이크로 피펫을 이용하여 적색 챔버로부터 원하는 단백질을 포함하는 생체 외 번역 반응 수확. </li><li> 집계 된 단백질을 제거 탁상 원심 분리기에서 15 분 동안 16,200 XG에서 해물 스핀 조심스럽게 다른 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li></ol> 4. GUV 바인딩 분석 <ol><li> 절단 팁을 사용하여, 5를 혼합1, 번역 단백질 및 튜브 GUVs 5 μl를 함유 관내 번역 반응 L, 2-3 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 깨끗한 커버 슬립에 작은 구멍 (3-4 mm 직경)와 PDMS 시트를 부착하고 부드럽게 단단히 coverslip에 대해 그것을 눌러 단단히 밀봉을 보장합니다. </li><li> 작은 구멍으로 단계 4.1에서 10 μl의 혼합물을 놓습니다. </li><li> 이미지 실온에서 반전 에피 나 공 초점 형광 현미경 혼합물. 주 : 증발을 방지하기 위해, 촬상 챔버는 커버 슬립에 의해 커버 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

우리는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

상술 한 바와 같이 GUV 결합 분석은 다른 단백질 지질 상호 작용을 분석 자신의 한계를 가지고 시나리오에서 좋은 대안을 제공합니다. 이 분석은 우리가 지질 이중층의 맥락에서 기본 길이 아실 체인 myristoylated 전체 길이 개그 산성 지질 사이의 상호 작용을 검토하고 개그 지질의 고밀도 자당 그라디언트 또는 다른 후 바인딩 처리를 통해 긴 부상 원심 분리없이 그렇게 할 수 있습니다 단지. 또 다른 장점은 개그의 동작을 용이하게 이러한 표면 플라즈몬 공명 기반 분석과 같은 다른 실시간 기술에서 달성되지 않는다 (세포질 성분의 존재하에, 예) 복잡한 혼합물에서 검사 될 수 있다는 것이다. 따라서, 하나는 여기에 설명 된 분석의 분야에서 사용되는 다른 분석법보다 고유 컨텍스트 개그 산성 지질 상호 작용의 실시간 평가를 가능하게 할 수 있다고 주장한다. 그러나,이 방법 등과 관련된 제한이있다잘. 주어진 제조에 GUVs 서로 유사 조성 원래 혼합물에, 전기 주...

인간 면역 결핍 바이러스 타입 1 (HIV-1) 대부분의 세포 유형에에서 조립 및 플라즈마 막 (PM)에서 싹 포락선 바이러스입니다. HIV-1 바이러스 입자의 어셈블리가 Pr55 개그 (개그)라고하는 55 kDa의 바이러스 코어 단백질에 의해 구동된다. 개그는 네 개의 주요 구조 영역, 즉 매트릭스, 캡시드, 뉴 클레오 캡시드 및 P6뿐만 아니라, 두 개의 스페이서 펩티드 SP1 및 SP2로 이루어지는 전구체 폴리 단백질로서 합성된다. 조립시, 매트릭스 (MA) 도메인 어셈블리 사이트 개그 타겟팅 할 책임이 캡시드는 (CA)가 도메인 개그-개그 상호 작용을 매개하는, 뉴 클레오 캡시드 (NC) 영역은 바이러스 게놈 RNA를 모집하고 P6 모집 호스트 요인이 처치 세포막에서 바이러스 입자 분열. 개그는 또한 N 말단에 14 개의 탄소 지방산 또는 미리 스틴 산 잔기의 첨가에 의해 공동 번역 후 변형을 겪는다. 개그의 결합 멤브레인 m 이후, 바이러스 조립에 필수적인 요구 사항입니다결합 막 중의 결함 utants 바이러스 입자를 생산하지 못한다. 지질 이중층 높은 기본 영역으로 불리는 석사 도메인 내에서 기본 잔류 물의 클러스터 (과 소수성 상호 작용을 매개 N- 말단 미리 스테이트 부분 : 우리와 다른 사람은 MA 도메인 내에서 양자 신호에 의해 매개된다 개그의 결합이 막 보여 주었다 PM을 1-4 산성 지질과 상호 작용 HBR). polyphosphoinositide 5 포스 파타 아제 IV (5ptaseIV), PM-특정 산성 인지질 phosphatidylinositol-의 가수 분해를 촉매하는 효소의 자궁외 표현을 사용 개그 멤브레인의 상호 작용 연구 (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] 포스파티딜 이노시톨-4 인산로, 세포에 개그-PM 현지화가 PI (4,5) P (2) 3,5에 의해 매개되는 것을 제안했다. 그러나, 시험 관내 연구 개그-PI (4,5) P의 더 자세한 기전을 이해 목표이 상호 작용은 여러 가지 이유로 도전적 입증되었다. 에 대한예, 생화학 실험 전체 길이의 정화 myristoylated HIV-1 개그 인해 정제 동안 집계 개그의 경향에 적어도 부분적으로 기술적으로 어렵다. 따라서, 이러한 MYR-MA 또는 MYR-MA-CA 또는 비 myristoylated 형태와 같은 HIV-1 개그의 절단 된 형태는 자주 개그 정제를 필요 연구에서 사용되어왔다 (예를 들면, 핵 자기 공명, 단백질 배출량 측정 및 표면 플라즈몬 공명 6-9). 대안 적으로, 시험 관내 전사 번역 반응에 연결된 다른 생화학 연구 1,2- 전체 길이 myristoylated 개그 HIV-1을 제조하는데 사용되어왔다. 일반적으로이 시스템에서, 개그 인코딩 플라스미드는 전사하고 세포막과 메신저 RNA를 결여하지만 전사 및 번역 기계를 포함하는 진핵 세포 용 해물 (예를 들면, 토끼 망상 해물)로 변환됩니다. 반응 후, 개그를 함유하는 세포 용 해물은 나와 혼합지질과 개그의 상호 작용 분석을위한 mbranes. 개그 myristoylated 전장의 제조 용이성에 더하여, 시험 관내 전사 번역 시스템을 사용하는 방법은 개그 합성 후의 막 결합 반응이 더 생리적 조건을 나타낼 수있는 &#39;진핵 세포질 형&#39;환경에서 발생하는 장점을 갖는다. 이 속성은 MA 도메인에 바인딩 RNA 분자가 개그가 경쟁 방식으로 1,2,10-12에 산성 지질에 결합 규제 것을 보여 주었다 연구에 기여했다. 이러한 세포 용 해물에서 얻은 개그 단백질의 총량이 높지 않기 때문에, 방사성 표지 된 아미노산과 단백질의 대사 표지는 검출이 필요하다. 상기 방법에 따라하기 개그 지질 상호 작용을 측정하기 위해, 막 제제의 다양한 사용되어왔다. 각 방법은 장점과 한계가있다. 대부분 NMR 기반 분석법 짧은 아실 지질의 사용을 필요수용성 (예를 들면, C8-C4- 및 PI (4,5) P 2) 6,8-있다 체인. NMR 방법들이 개발되고있는 세포에서 발견 긴 아실 체인을 갖는 지질 개그에 결합하는 것을 테스트하는 동안, 지금까지 8, 13 만 myristoylated 또는 nonmyristoylated MA로 사용되어왔다. 대안으로, 기본 길이 아실 체인을 지질로부터 제조 된 리포솜은 리포솜 부유 형광 리포솜 비드 결합 분석 2,3,10,14-16 같은 생화학 적 방법에 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석에 사용 된 리포좀은 작은 직경을 가지며, 따라서, 이들 막은 가파른 포지티브 곡률을 갖는다. 반대로, HIV-1 감염 세포에서 입자 조립체의 초기 단계 동안, 개그 거의 개그의 규모에 평면이 상기 PM에 결합하고,이어서 신진 중에 네거티브 곡률을 유도한다. 따라서, 가파른 긍정적 인 곡률 리포솜 막은 개그 지질 상호 작용을 연구하는 이상적인 지질 이중층하지 않을 수 있습니다. 리포좀 FLOT에 관해서ATION 분석, 다른 잠재적주의해야 할 점은 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 원심 분리 동안 고장 성 자당 기울기에 개그 지질 복합체의 노출이다. 이러한 제한을 완화하고 보완 실험 시스템을 제공하기 위해, 개그가 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 결합에 대한 분석은 최근에 개발되었다. GUVs는 그 직경이 수십 마이크로 미터까지 연장 단일 지질 이중층 소포이다. 따라서, 이러한 세포막의 곡률은 개그의 규모에 PM 유사합니다. 또한, 때문에 광학 현미경 하에서 육안 검사를 할 수 있습니다 대형 크기로 막 쉽게 개그 지질 복합체의 후속 처리없이 결정할 수있다 혼합에이 소포에의 찬란 태그 또는 라벨 개그 단백질을 결합. 우리는 여기에 전기 주조 방법에서 얻은 GUVs를 사용하여 결합 HIV-1 개그 멤브레인을 연구하는 프로토콜을 설명합니다. 같은 부드러운 수화 젤 이용한 수화, 마이크 등의 다양한 방법rofluidic 분사하고, 전기 주조는 17-22 GUVs을 얻기 위해 사용되었다. 여기에 설명 된 프로토콜의 경우, 전기 주조 방법은 산성 지질 비싼 설정 없이도 사용의 비교적 쉽게 형성 GUVs 주로 때문에 효율이 사용된다. 개그의 시각화 형광 기자를 필요로하기 때문에, 노란색 형광 단백질 (YFP)는 유 전적으로 개그 (개그-YFP)의 C ​​말단에 추가됩니다. 개그-YFP 단백질 연속 교환 연속 흐름 (CECF) 기술을 기반으로 밀 배아 용해질에서 시험 관내 전사 및 번역 반응에 의해 얻어진다. 이 기술에서, 반응은 반응 기질 및 에너지 구성 요소의 공급을 억제 부산물을 모두 제거하여 투석 기반기구에서 달성된다. 이들 반응 들면, T7 프로모터의 제어하에 개그-YFP를 코딩하는 플라스미드가 사용된다. 이전과 같이 참고로, 밀 배아 해물을 추가 구성 요소 (2)를하지 않고 미리 스토 일화를 지원3,24. 이 방법을 사용하면, GUV 막 (24)의 개그 시각화 개그-YFP myristoylated 전체 길이의 충분한 양을 얻을 수있다. 여기서 우리는 HIV-1 개그가 PI에 결합되는 프로토콜을 설명 (4,5) P 2 GUV 막을 함유하는 결합 반응을 다음과이 방법은 결합 분석을 기존의 개그 멤브레인을 보완 할 수 있다는 제안 긴 후속 처리없이 검사 할 수 또한 결합 HIV-1 개그 멤브레인을 이해하는 확장.

<table><tbody><tr><td>디지털 멀티미터</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>저항과 볼트를 측정할 수 있는 일반 멀티미터가 목적에 부합합니다.</td></tr><tr><td>함수 발생기</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>10Hz 및 1V에서 사인파를 생성할 수 있는 일반 함수 발생기로 충분합니다.</td></tr><tr><td>ITO 코팅 유리 슬라이드</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Hoefer</td><td></td><td>온도를 정확하게 유지할 수 있는 인큐베이터라면 충분할 것입니다</td></tr><tr><td>진공 챔버</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Gauge 22S, 주사기 번호 702</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>실가드 엘라스토머 베이스 키트, Dow-Corning</td><td>실가드, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 밀 배아 CECF 키트</td><td>BiotechRabbit, 베를린, 독일</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, 칼즈배드, CA&nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti 극성 지방질, 알라바스터, AL&nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Brain-PI(4,5)P2&nbsp;</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

거대한 단일 층 소포 (guv) 막 바인딩 hiv-1 개그의 시각화

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

HIV-1의 구조 단백질 Pr55 개그 (또는 개그)는 바이러스 조립 과정에서 세포의 세포막에 결합한다. 개그 결합 막은 바이러스 입자 생산에 심각한 손상 개그 막 결합 결과 결함 사람 바이러스 입자 형성을위한 필수 단계이다. 개그 지질 막 상호 작용 기전 상세을 얻기 위해, 시험 관내 방법은 NMR, 단백질 배출량 측정, 표면 플라즈몬 공명, 리포솜 부유 원심 분리 또는 형광 지질 비드에 기초하여 지금까지 개발 된 바인딩. 그러나, 이러한 시험 관내 방법은 각각의 한계를 갖는다. 이러한 한계들을 극복하고 이전에 설정된 방법에 보완적인 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 HIV-1 개그 지질 세포막 사이의 상호 작용은 &quot;셀 같은&quot;환경에서 개최되는 시험 관내 (in vitro) 분석을 개발했다. 이 분석에서, 개그 지질막 결합 시각적 YFP-tagge를 사용하여 분석D 개그 밀 합성 관내 번역 시스템 및 전기 주조 기술에 의해 제조 GUVs에서 세균 계. 여기에서 우리는 배경을 설명하고 프로토콜 분석에 필요한 myristoylated 전체 길이 개그 단백질과 GUV 막을 얻고 현미경으로 결합 개그-GUV를 검색 할 수 있습니다.

<html> 상기 프로토콜을 사용하여, 우리는 POPC + + Chol을 POPS 이루어지는 GUVs 제조 (: 4.66 : 2.33 : 3 몰비). 이 조성물은 대략 오후의 PS 및 콜레스테롤 농도를 반영하기 위해 선택되었다. 뇌-PI (4,5)는 P 2는 POPC + POPS + Chol을 혼합물에 포함 된 경우 강력하고 개그의 결합을 효율적으로 만 관찰되었다 (POPC + POPS + Chol을 + 뇌-PI (4,5) P 2 몰비 4 : 2 : 3 : 1이 예에서) (도 4, A 및 C)와 패널 B 및 D를 비교한다. POPC + 이루어지는 GUVs 결합 개그-Chol을 YFP는 + + 뇌 PI (4,5) P (2)이 막 표면에 대한 형광 강도의 증가로 명백하다 나옵니다. 이러한 증가는 또한 GUV 경계 (도 4C 및 D에</stro...

여기서는 밀 배아 기반 체외 번역 시스템에서 합성된 YFP 태그 Gag와 전기 형성 기술로 준비된 GUV를 사용하여 HIV-1 Gag와 지질막 간의 상호 작용을 시각적으로 분석하는 시험관 외 막 결합 분석을 설명합니다.

거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

본 절차의 전체적인 목표는 거대 단층 소포(giant unilamellar vesicle) 막에서의 HIV-1 Gag 결합을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 생물학적 조립(Bio Assembly) 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 오스테오 체인을 가진 지질이 막 결합이나 시험관 내(in vitro) 바이러스 Gag 단백질과 같은 바이러스 구조 단백질에서 하는 역할 등이 이에 해당합니다.이 기술의 주요 장점은 Gag의 막 결합을 거대 단일층 소포(giant unilamellar vesicle) 막에서 시각적으로 검출할 수 있다는 것입니다. 혼합 직후에 이를 확인할 수 있으므로, 잠재적으로 유해할 수 있는 장시간의 혼합 후 단계들을 생략할 수 있습니다. HIV-1 Gag의 준비 과정은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있으며, GUV를 준비하기 하루 전에 미리 완료해야 합니다.냉동고에서 지질 스톡을 꺼내 실온에서 평형을 맞춥니다. 그동안 히트 블록의 온도를 사용하는 지질의 최고 융점보다 최소 5 °C 높게 설정하십시오. 본 시연에서는 사용된 지질 중 가장 높은 온도인 65 °C로 설정하였습니다.지질은 무기 용매에 용해하여 테플론 라인 스크류 캡이 있는 유리 바이알에 보관하고 파라필름(Parafilm)으로 밀봉해야 합니다. 해동 후 현탁액이 투명한지 확인하십시오. 원하는 몰/지질 비율에 따라 필요한 지질 부피를 계산하십시오.그 다음, Hamilton 타입 유리 주사기와 같이 클로로포름에 내성이 있는 장치를 사용하여 계산된 부피만큼 깨끗한 스크류 캡 유리 바이알에 분주합니다. 클로로포름과 같은 적절한 유기 용매를 사용하여 전체 부피를 조절합니다. 이어서, 각 전기 형성 챔버당 두 장의 새로운 ITO 코팅 슬라이드를 준비합니다.멀티미터를 사용하여 저항을 측정하여 슬라이드의 전도성 면이 위를 향하고 있는지 확인하십시오. 저항값은 약 200 ohms여야 합니다. 그런 다음 70% ethanol과 보풀 없는 와이프로 표면을 부드럽게 닦아냅니다. 다음으로, 시린지 바늘의 외표면을 chloroform으로 헹구어 세척한 후, 시린지를 히트 블록 위에 놓습니다.세척된 ITO 코팅 슬라이드 또한 전도성 면이 위로 오도록 히트 블록 위에 놓습니다. 몇 분 후 슬라이드가 설정 온도에 도달하면, 슬라이드 중 하나에 지질 혼합물 40~50 µL를 첨가합니다.지질은 신속하게, 하지만 가능한 한 균일하게 펴 발라야 합니다. 그다음, 지질 혼합물을 동일한 부피의 절반만큼 다른 유리 슬라이드에 추가하고, 즉시 펴 발라 균일한 지질 막을 형성합니다. 얇은 ITO 코팅이 손상되지 않도록 빠르고 부드럽게 작업하십시오.필름의 불투명도가 지나치게 불균일해 보인다면, 새 슬라이드를 사용하여 절차를 다시 수행하십시오. 다음으로, 첫 번째와 다른 지질 혼합물을 사용하여 두 번째 슬라이드 쌍을 제작하십시오. 최적의 GUV 수율과 GUV의 조성 균질성을 위해서는 지질 층이 균일해야 합니다.슬라이드를 진공 데시케이터에 60~90분 동안 보관하여 미량의 유기 용매를 제거합니다. 다음 단계를 위해, 인큐베이터를 이전 단계에서 사용한 히트 블록의 온도로 설정하고, 300 millimolar sucrose 용액 스톡을 해당 온도까지 가온합니다. 또한, PDMS 가스켓을 70% ethanol로 부드럽게 닦아낸 후 완전히 건조시켜 준비합니다.슬라이드가 마르면 깨끗한 표면에 놓고, 가스켓이 수밀 씰을 형성하도록 슬라이드 하나 위에 가스켓을 부드럽지만 단단하게 누릅니다. PDMS 가스켓과 슬라이드 사이에 기포가 없는지 확인합니다. 그 후, 가스켓 내부를 미리 데워둔 sucrose 용액으로 완전히 채웁니다.기포가 남지 않도록 하십시오. 이제 코팅된 다른 슬라이드를 가스켓 위에 올려 다른 슬라이드와 정렬하여 누릅니다. 기포가 없는지 확인하고 바인더 클립을 사용하여 챔버를 고정합니다.다음으로, 흡입법을 통해 과량의 sucrose 용액을 제거하고, 보풀 없는 와이퍼를 사용하여 슬라이드를 닦아냅니다. 계속 진행하기 위해, 각 슬라이드의 전도성 면이 구리 바와 균일하게 접촉하도록 슬라이드 어셈블리를 구리 바에 고정합니다. 그런 다음, 구리 바를 함수 발생기 출력단에 연결하고, 함수 발생기는 외부에 둔 상태로 어셈블리를 인큐베이터 내부에 넣습니다.온도가 도달하면, 함수 발생기를 설정하여 10 Hz 사인파와 1 V의 전위차를 90분 동안 가합니다. 멀티미터를 사용하여 전압이 1 V인지 확인하십시오. 90분 후, 주파수를 2 Hz까지 천천히 낮추고 전기 형성(electroformation)을 10분 더 지속합니다.이 시간 동안 전날 준비한 인 비트로(in vitro) 번역 반응으로부터 HIV-1 Gag를 수확합니다. 용해물을 원심 분리하여 불필요한 응집체를 제거하고 상층액을 다른 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 2 Hz에서 10분간 진행한 후, 함수 발생기를 끄고 인큐베이터 전원을 끈 다음, 어셈블리가 상온으로 돌아올 때까지 인큐베이터 문을 열어둡니다.냉각이 완료되면 슬라이드 어셈블리를 조심스럽게 벤치로 옮기고, 핀셋으로 상단 슬라이드를 제거하여 챔버를 부드럽게 분해합니다. 끝을 자른 1000 µL 피펫 팁을 사용하여 GUV를 새 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 조심스럽게 다루고 GUV를 90분 이내에 사용하십시오.다음으로, 이미징 챔버를 준비합니다. 작은 구멍이 있는 PDMS 시트를 깨끗한 커버슬립 위에 부착합니다. 밀봉이 잘 되도록 부드럽고 단단하게 눌러줍니다.그런 다음, 5 µL의 인 비트로(in vitro) 번역 반응액과 5 µL의 GUV를 혼합합니다. 몇 분 후, 혼합물을 이미징 챔버로 옮기고 이미징을 진행합니다. 증발을 방지하기 위해 이미징 챔버를 커버슬립으로 덮을 수 있습니다.설명된 프로토콜을 사용하여 POPC, POPS 및 콜레스테롤이 4.7 : 2.3 : 3의 몰비로 구성된 GUV를 준비했습니다. GUV 상의 Gag YFP 신호를 형광 측정으로 분석한 결과, GUV 표면에서 배경 신호 이상의 값은 검출되지 않았습니다. 그러나 지질 혼합물에 brain-PIP2를 포함시켰을 때, Gag-YFP 단백질이 GUV에 효율적으로 결합되었습니다.Gag 결합은 막 표면의 형광 강도 증가로 확인할 수 있으며, 이를 스캔하면 날카로운 피크 형태로 나타납니다. 형광 표지된 단백질이 준비되어 있다면, 이 기술을 숙달한 후 4~5시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 GUV를 조심스럽게 다루는 것이 중요하며, 가능한 한 항상 신선한 지질을 사용하십시오.이 기술을 통해 레트로바이러스 조립 분야의 연구자들은 상호작용의 잠재 상태를 변화시킬 수 있는 장시간의 혼합 후 처리 과정 없이, 레트로바이러스 Gag 단백질의 막 상호작용을 in vitro에서 조사할 수 있게 되었습니다.

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

프로토콜은 cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV - 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

이 프로토콜은 항리고적으로 중요한 G 단백질 결합 수용체의 종류 중 하나인 인간 1A 세로토닌 수용체 단백질(5-HT1AR)의 재구성을 위해 여기에 설명된 바와 같이, 일체형 막 단백질(IMP)을 거대한 유니라멜라 지질 소포(GUV)에 통합하기 위한 강력하고 일반화가능한 기술로 아가로즈 팽윤을 활용한다.

G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)를 통합 한 모델 지질 막의 건설

이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

구조와 구성의 막 지질 다양성은 세포 과정에 중요한 기여를 하며 질병의 표지자가 될 수 있습니다. 분자 역학 시뮬레이션을 통해 원자 분해능에서 멤브레인과 생체 분자와의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 여기에서는 복잡한 멤브레인 시스템을 구축, 실행 및 분석하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

시뮬레이션 연구에서 복잡한 지질 혼합물을 사용한 사실적인 막 모델링

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

학습하세요 HIV-1 Gag가 거대한 단일 층 소포(GUV) 막에 결합하는 과정을 시각화하는 방법을. 전기형성법과 YFP 표지 단백질을 활용하여 지질-단백질 상호작용을 연구하고 바이러스 조립 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화

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