직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영

이 직접 혈전 이미징 기술의 전반적인 목표는 금 나노 입자, 컴퓨터 단층 촬영 및 근적외선 형광 이미징을 사용하여 생체 내 및 생체 외 형광 표지된 대뇌 혈전색증을 정량적으로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 조직 플라스미노겐 활성제 또는 연구 중인 새로운 혈전용해제에 대한 대뇌 혈전색전의 시간 또는 용량 의존적이고 심각한 정형외과적 반응과 같은 지혈 및 혈전증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 금 나노 입자의 정맥 주사 후 고해상도 마이크로 CT를 통해 생체 내에서 위치와 부담을 정량적으로 시각화한 다음 생체 외 근적외선 형광 혈전 이미징으로 확증함으로써 대뇌 혈전색전의 동적 진화를 포착할 수 있다는 것입니다.

시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 김정연(Jeong-Yeon Kim)이 담당할 예정입니다. 심장 빵꾸에 의하여 동맥 혈액의 300에서 1, 000 마이크로리터를 모은 후에, 적합한 활성화된 응고 계수, 13의 중재된 섬유소 교차 연결 활동 과민한 형광성 조사의 30 마이크로리터에 표본의 70 마이크로리터를 추가하고, 유래하는 혼합물로 23 계기 바늘 장비된 3 밀리리터 주사기를, 적재하십시오. 다음으로, 라벨이 부착된 혈액을 20cm 길이의 폴리에틸렌 튜브에 주입하고 혈액이 실온에서 응고되도록 합니다.

2시간 후 튜브를 섭씨 4도에서 22시간 동안 옮긴 다음 튜브를 1.5cm 조각으로 자릅니다. PBS로 채워진 3밀리리터 주사기를 사용하여 각 튜브 조각의 혈전을 PBS가 포함된 6웰 플레이트의 개별 웰로 배출합니다. PBS로 혈전을 3회 세척한 다음 30게이지 바늘이 장착된 식염수가 채워진 1ml 주사기를 15cm PE10 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 세척된 혈전 1개를 튜브의 반대쪽 끝에 조심스럽게 뽑습니다.

그런 다음 혈전이 로드된 PE10 튜브를 직경 200미크론의 끝이 가늘어지는 3cm 길이의 PE50 튜브에 연결합니다. 발가락 꼬집음에 반응이 없어 마취를 확인한 후 베타딘과 70% 알코올로 수술 부위를 소독하고 메스를 사용하여 왼쪽 귀와 눈 사이를 1cm 수직 절개합니다. 레이저 도플러 유량계의 광섬유 말단부를 브레그마 왼쪽 1mm, 아래 4mm의 노출된 왼쪽 측두골 표면에 붙이고 도플러 모니터링을 시작합니다.

그런 다음 혈관 주위 연조직을 통해 3cm 수직 정중선을 절개하여 왼쪽 경동맥 구근 부위를 노출시킵니다. 멸균 6-0 흑실크 봉합사를 사용하여 좌측 근위 총경동맥을 결찰한 다음 좌측 내부 경동맥과 좌측 익상구개 동맥을 멸균 7-0 흑색 실크 봉합사로 결찰합니다. 단극성 전기 소작기를 사용하여 좌측 상갑상선 동맥을 소작한 다음 멸균 7-0 검은색 실크 봉합사를 사용하여 좌측 근위 외부 경동맥을 느슨하게 결찰하고 혈관의 원위 끝을 단단히 결찰합니다.

마이크로 가위를 사용하여 외부 경동맥의 결찰 부위 사이에 0.2-0.25 미크론의 구멍을 만들고 근위 외부 경동맥 결찰을 느슨하게 하면서 카테터가 들어있는 혈전을 구멍에 삽입합니다. 카테터를 총경동맥으로 전진시켜 카테터를 제자리에 끼우고 근위 외부 경동맥 결찰을 다시 조입니다. 소작으로 외부 경동맥의 말단부를 절단하고 외부 경동맥의 자유 근위부를 시계 방향으로 회전시켜 카테터를 빼내면서 혈관을 내부 경동맥과 정렬합니다.

그런 다음 내부 경동맥 결찰을 풀고 즉시 카테터를 약 9mm 전방으로 전진시킵니다. 이제 카테터 주위의 내부 경동맥 봉합사를 다시 조이고 주사기를 부드럽게 눌러 분기 부위에 혈전을 주입합니다. 도플러에서 기준선보다 크거나 30% 낮은 혈류가 관찰되면 카테터를 제거하고 즉시 외부 경동맥의 근위부 끝을 결찰합니다.

적절한 실험 시점에서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영으로 혈전을 이미지화하기 위해 피브린을 표적으로 한 금 나노 입자를 10 밀리 그램 당 10 밀리 몰 PBS 농도로 희석하고 혈전 이미징 에이전트를 30 분 동안 초음파 처리하여 나노 입자의 균일 한 현탁액을 보장합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 피브린 표적 입자를 실험 동물의 음경 정맥에 주입합니다. 동물을 마이크로 CT 이미저의 침대로 옮기고 핀에 부착된 끈을 사용하여 위쪽 앞니를 부드럽게 당겨 목을 곧게 펴줍니다.

금 나노 입자를 주입한 후 5분 후에 이미징을 시작합니다. 체외 근적외선 영상으로 혈전을 시각화하려면 절제된 뇌 조직을 베이스가 위를 향하도록 하여 이미징 장치에 배치합니다. Willis의 서클 동맥에서 형광으로 표지된 트롬보엠볼리의 이미지를 얻습니다.

그런 다음 꼭짓점이 위를 향하도록 조직을 배치하고 피질 혈전색전을 이미지화합니다. 식염수 몇 방울로 조직에 수분을 공급한 다음 제조업체의 지침에 따라 뇌 매트릭스 장치를 사용하여 2mm 두께의 관상 뇌 절편 6개를 빠르게 얻습니다. 슬라이스를 식염수로 수화한 상태로 유지하면 섹션의 앞면과 뒷면 모두에 대한 추가 근적외선 이미지를 얻을 수 있습니다.

마이크로 CT 이미징 후 혈전 영역을 정량화하려면 이미지 시퀀스 파일을 열고 이미지, 유형, 8비트를 차례로 선택하여 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환합니다. CT 이미지 파일의 1픽셀이 0.053mm에 해당하는 경우 Analyze Set Scale을 사용하여 Distance in pixels, Known distance, Unit of length에 각각 1, 0.053, 밀리미터를 입력합니다. 그런 다음 Edit(편집)에서 Selection(선택)과 Select(지정)를 차례로 선택하여 혈전 또는 뼈 관련 초고밀도 영역이 없는 뇌 실질 영역에 관심 영역을 배치합니다.

지정된 관심 영역이 스택의 모든 조각에 적용되기 때문에 영역이 조각의 초고밀도 영역과 겹치지 않는지 확인합니다. 그런 다음 Plugin(플러그인)에서 Region of Interest(관심 영역) 및 Background Subtraction(배경 제외)을 선택하고 Number of standard deviations from the mean(평균에서 표준 편차의 수)에 2를 입력합니다. 혈전색전증 관련 고밀도 병변을 찾고 병변 부위를 확대합니다.

이제 Image(이미지)를 선택한 다음 Adjust(조정) 및 Threshold(임계값)를 선택하고 Lower Threshold Level(하한 임계값 레벨) 22와 Upper Threshold Level(상한 임계값 레벨) 255를 입력합니다. Over/Under(초과/미만)를 선택하여 하한 임계값 미만의 픽셀은 파란색으로, 임계값이 설정된 픽셀은 회색 음영으로, 상한 임계값보다 높은 픽셀은 녹색으로 표시합니다. 그런 다음 Freehand selection 도구를 사용하여 뼈 영역이 없는 혈전색본 관련 고밀도 병변 주변의 관심 영역을 그립니다.

Analyze(분석), Set Measurements(측정 설정)를 사용하여 Area(면적), Mean gray value(평균 회색 값) 및 Integrated density area times mean(통합 밀도 면적 시간 평균)을 선택합니다. Limit to threshold(임계값 제한) 및 Display label(레이블 표시) 옵션을 선택합니다. Analyze Measure(측정값 분석)를 사용하여 정량화된 데이터를 가져온 다음 결과를 저장합니다.

이러한 기준선 마이크로 CT 이미지는 마우스에서 색전 뇌졸중 후 1시간 후에 피브린 표적 금 나노 입자를 주입한 후 5분 후에 생체 내에서 획득되었습니다. 대뇌 혈전은 원위 내부 경동맥의 중간 대뇌 전방 대뇌 동맥 분기 영역에서 명확하게 시각화할 수 있습니다. 후속 마이크로 CT 영상은 식염수 처리된 동물에서 윌리스 혈전의 원에 변화가 없음을 보여주지만, 조직 플라스미노겐 활성제 투여된 동물은 시간이 지남에 따라 파란색 화살촉으로 표시된 윌리스 혈전의 원이 점진적으로 용해되는 것을 보여줍니다.

24시간 후 잔류 혈전색전증에 대한 in vivo CT 밀도와 ex vivo 근적외선 이미징 사이에는 강한 상관관계가 있습니다. 예를 들어, 이러한 이미지에서 피브린을 표적으로 하는 금 입자에 의해 시각화된 초고밀도 마이크로 CT 영역은 사전 형성된 응고 성숙 과정에서 혈전에 결합하는 응고 인자 13A 매개 피브린 가교 활성 민감성 형광 프로브에 의해 식별된 근적외선 신호 영역과 직접 일치합니다. 또한, 이러한 이미지에서 시각화된 바와 같이, TTC 염색은 조직 플라스미노겐 활성제 투여동물과 비교하여 대조 식염수에서 허혈성 뇌 손상에 대한 혈전용해의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

일단 숙달되면, 생체 내 마이크로 CT 이미징 및 생체 외 근적외선 형광 혈전 이미징을 위한 이 기술은 적절하게 수행되고 이미징 프로브를 사용할 수 있을 때 약 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 마이크로 CT 기반 직접 대뇌 혈전 이미징을 위해 응집되지 않은 피브린 표적 금 나노입자를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 전자 현미경 또는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법인 ICPMS와 같은 다른 방법을 수행하여 금 나노 입자의 조직 분포 및 혈액 동역학과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 뇌졸중 또는 심혈관 연구 분야의 연구자들이 관상 동맥 혈전증 또는 색전성 뇌 침해에 대한 동물 모델의 혈전색전증을 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 마우스에서 혈전색전성 뇌졸중을 위한 형광 표지 혈전을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 생체 내 및 생체 외 대뇌 혈전색전의 연속 이미징 및 정량화를 수행하여 혈전의 진화를 모니터링할 수 있습니다.