높은 콘텐츠 체외 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

이 고함량 베타 세포 복제 스크리닝 플랫폼의 전반적인 목표는 베타 세포 성장을 제한하는 분자 경로의 조사를 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 베타 세포 생물학 분야의 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 베타 세포 재생을 제어하는 주요 신호 분자 및 경로 중 하나입니다.

이 기술의 주요 장점은 특정 평가에 대한 처리량 세포 내막을 증가시키고 1차 섬 세포 복제의 자동화된 데이터 분석가를 사용할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 사용은 당뇨병에 대한 재생 요법의 개발로 확장될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 우리 사회에 큰 건강과 경제적 비용을 초래하는 질병입니다.

먼저 22게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기가 장착된 췌장 소화 용액을 사용하여 낭포성 간관과 총간관의 접합부 또는 원위부에 있는 총담관을 화학화합니다. 두피 손잡이로 총담관을 지지하고 용액 10ml를 천천히 주입합니다. 콜라겐분해효소를 모두 투여한 후, 구부러진 집게와 가위를 사용하여 팽창된 췌장을 하행 결장, 장, 위 및 스플라인에서 분리합니다.

그런 다음 50ml 튜브에 최대 2개의 췌장을 5ml의 췌장 소화 용액이 들어 있는 얼음 위에 놓습니다. 췌장이 모두 모이면 소화관을 섭씨 37도의 수조에 15분 동안 넣고 3분마다 부드럽게 소용돌이치며 넣습니다. 소화가 끝나면 튜브를 수직으로 10회 세게 흔듭니다.

그리고 표본에 10ml의 차가운 세척 버퍼를 추가합니다. 튜브를 다섯 번 더 세게 흔든 다음 얼음 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 차가운 세척 버퍼로 튜브를 최종 부피 50ml까지 채우고 튜브를 5번 뒤집습니다.

그런 다음 조직을 회전시키고 상층액을 붓고 펠릿이 제거되지 않도록 주의하십시오. 조직 슬러리를 25ml의 세척 버퍼에 다시 현탁시킨 다음 부드럽게 와류화합니다. 회전 및 재서스펜션 단계를 두 번 더 반복합니다.

30 메쉬 조직 체를 통해 조직 현탁액을 멸균 된 250 밀리리터 비커에 붓습니다. 추가로 20ml의 세척 버퍼로 소화관을 헹구고 세척제를 메쉬에 부어 소화되지 않은 췌장 및 지방 조직을 제거합니다. 여과된 물질을 두 개의 새로운 50ml 튜브 사이에 나누고 원심분리로 조직을 펠릿화합니다.

그런 다음 상등액을 디캔팅하고 튜브를 뒤집어 초과 완충액을 배출합니다. 섬을 정화하려면 췌장 조직 펠릿에 20ml의 차가운 밀도 구배를 추가하고 내용물을 균일하게 다시 현탁시키기 위해 위아래로 5회 부드럽게 피펫을 주입합니다. 다음으로, 10ml의 HBSS를 각 구배 튜브의 벽 아래로 천천히 오버레이하여 날카로운 액체 계면을 유지하고 원심분리로 췌장 세포를 분리하도록 주의합니다.

10 밀리리터 피펫을 사용하여 계면의 섬 층을 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 40-50 밀리리터의 세척 버퍼로 섬을 세 번 씻으십시오. 튜브를 뒤집어 각 원심분리 사이에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

최종 세척 후 튜브를 조직 배양 후드에 넣습니다. 상층액을 흡인합니다. 그리고 펠릿을 6 밀리리터의 섬 배지에 다시 현탁시킵니다.

6개의 우물 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 있는 각 튜브의 섬을 체로 거릅니다. 그리고 접시를 소용돌이쳐 우물 중간에 있는 작은 섬을 모으십시오. 현미경으로 islet 순도를 평가합니다.

섬을 추가로 정화하려면 1ml 피펫을 사용하여 섬을 수집하고 6ml의 섬 배지를 사용하여 인접한 우물로 옮깁니다. 순도가 90% 이상에 도달할 때까지 섬 소용돌이, 채취, 이송 및 현미경 평가를 반복합니다. 다음으로, 섬을 20ml의 섬 배지를 포함하는 단일 10cm 조직 배양 접시로 옮깁니다.

모든 섬을 수확한 후 배양 접시를 조직 배양 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 그런 다음 384웰 플레이트의 웰을 40마이크로리터의 804G(웰당 조절된 매체)로 코팅하고 플레이트를 밤새 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날, 셀 스크레이퍼를 사용하여 섬을 부드럽게 분리하십시오.

그런 다음 섬을 50ml 튜브로 옮깁니다. 원심분리로 섬을 수집합니다. 그런 다음 20ml의 따뜻한 p, b, s로 씻으십시오.

1분 동안 원심분리기를 사용합니다. 상층액을 흡인합니다. 그리고 펠릿을 영점 2, 5% 트립신으로 다시 현탁시킵니다.

1밀리리터 피펫을 사용하여 섭씨 37도에서 10분 동안 섬을 배양하여 5분과 10분에 10회 흡입 및 분주합니다. 두 번째 triteration 후, 트립신화된 섬 세포의 20마이크로리터 샘플을 계수합니다. 조직이 완전히 소화되면 섬 기능 배지에서 밀리리터당 4개 세포 농도에서 해리성 섬 세포를 4점 5배 10으로 현탁시킵니다.

그런 다음 12웰 매니폴드 흡인기를 사용하여 이전에 준비된 384웰 플레이트에서 804G 상태 매체를 제거합니다. 그리고 우물당 70마이크로리터의 섬을 4열에서 21열까지의 c에서 n행으로 체질합니다. 섬이 조직 배양 인큐베이터에 48시간 동안 부착되도록 합니다.

이틀 후, 12웰 매니폴드 흡입기를 사용하여 섬 매체를 조심스럽게 제거하고 12채널 피펫을 사용하여 각 웰에 35마이크로리터의 섬 기능 배지를 추가합니다. 그런 다음 35마이크로리터의 새로 준비된 2개의 관심 x 복합 용액을 각 웰로 옮깁니다. 그리고 섬을 인큐베이터에 다시 48시간 동안 보관합니다.

48시간 후, 자동화된 고함량 이미징 플랫폼을 사용하여 복합 처리된 섬 배양물을 고정, 염색 및 분석합니다. 일반적인 실험에서 DAPI, PD-1 및 인슐린 양성 베타 세포의 복제 속도는 Ki-67을 공동 발현하는 베타 세포의 비율에 의해 결정됩니다. 알파 세포 복제는 DAPI 양성, PD 음성, 글루카곤 양성, Ki-67 공동 발현 세포의 비율로 측정됩니다.

예를 들어, 이 대표적인 실험에서 Dipryridamole은 베타 세포의 복제를 촉진하는 것으로 관찰되었지만 알파 세포의 복제는 촉진되지 않았습니다. 이 기술은 7일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 베타 세포 복제에서 화합물을 더 연구하여 작용 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

이 기술을 통해 베타 세포 생물학 분야의 연구는 베타 세포 성장을 조절하는 새로운 신호 요인과 경로를 식별할 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 베타 세포 재생을 선택적으로 자극하는 소분자의 능력을 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.