Name: 높은 콘텐츠 체외 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 췌장 작은 섬 β 세포 복제를 촉진하는 고콘텐츠 스크리닝 방법을 통해 당뇨병 재생 치료 연구의 핵심 신호 경로를 규명하는 기술을 익히세요.

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이 작업은 NIH(JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute(CHRI) 및 SPARK(UL1 TR001085, JPA)의 NIDDK 보조금 DK098143 및 DK101530의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 의학 스탠포드 대학의 기관 동물 보호 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행 하였다. 섬 세포 복제 평가를위한 384 웰 플레이트 228 우물을 생성하기에 충분하다 - (9 주 이전 8) 남성 스프 라그 돌리 쥐, 300g - 기술 된 프로토콜은 여섯 250 섬의 격리를 위해 조정됩니다. 1. 재료 준비 <ol><li> 15cm 조직 배양 접시 (28)에서 3 일간 합류 유지 804G 래트 방광 종양 세포의 조절 매체 (RPMI1640 20 mL)을 수집하여 아일렛 분리를 개시하기 전에 피복 매체를 준비한다. 살균 필터 저장소 (-20 ° C) 나중에 사용하기 위해 조정 배지. </li><li> 수술 도구를 소독 (한 12cm 톱니 조직 포셉, 하나 11.5 cm 미세 가위, 하나 14.5 cm 수술 가위, 두 개의 16 cm 곡선 집게, 한 12cm 곡선 지혈, 하나의 12cm 메스 핸들) 및 초기화하기 전에 한 30 메쉬 조직 체섬 격리를 iating. </li><li> 60 %를 용해하여 췌장 소화 솔루션을 준비 : 정제 클래스 I의 40 % 혼합물 : 클래스 II 콜라게나 (300,000의 총 콜라게나 제 활성 - 40 단위) 칼슘, 마그네슘 보충 1X 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS) 60 ㎖에. 로드 얼음에 1 &quot;22 G 바늘과 장소 10 ml의 주사기 (육)으로 췌장 소화 버퍼 10 ㎖. 주 : 소화 용액 10 ml를 래트 당 주입된다. 이에 따라 확장 할 수 있습니다. </li><li> 케타민 1.3 ㎖ (100 ㎎ / ㎖), 자일 라진, 0.2 ㎖ (100 ㎎ / ㎖) 및 3 ㎖의 PBS를 혼합하여 환기 후드 마취 칵테일 4.5 ml의 준비. 섬 격리를 개시 1 시간 이내에 마취 칵테일을 준비합니다. </li><li> 500ml의 HBSS에 신생 송아지 혈청을 25 ㎖를 첨가하여 세척 완충액을 준비한다. 나중에 사용하기 위해 얼음에 세척 버퍼를 놓습니다. </li><li> 낮은 혈당 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), (5)의 500 ml의 인 섬 매체의 1 병을 준비합니다0 ㎖의 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린의 5000 단위 / ml의 스트렙토 마이신 및 5000 ㎍ / ㎖의. </li><li> 2 % FBS, 2 mM의 글루타민, 5 mM의 포도당 페니실린의 5000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 5,000 ㎍ / mL를 기능 / 생존력 용액 (500 ㎖)에서 췌장 기능 매체를 준비한다. 나중에 사용하기 위해 섬의 기능 매체 (4 °에 C)를 저장합니다. </li><li> 1X 인산 완충 식염수의 37.38 ㎖ (PBS)에 2.5 ml의 당나귀 혈청 및 0.12 ml의 트리톤 X-100을 추가하여 버퍼를 차단 40 ml의를 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 저장 차단 버퍼 (4 °의 C). </li><li> 프로토콜을 시작하기 전에 필요한 항체를 얻습니다. 참고 : PDX-1 (TRITC)와 기-67 (FITC) 공동 염색은 기본 β 세포 복제 검사에 사용됩니다. 핵 (DAPI), PDX (Cy5에) 및 기-67 (FITC) 염색과 함께, 혈통 특정 복제 분석을 위해 추가 셀 식별 마커 (TRITC 인슐린, 글루카곤, 멘틴 또는 소마토스타틴 (somatostatin))에 대한 면역 형광 염색을 수행합니다. 대체 담당자lication 마커, 예, PCNA도 사용될 수있다. </li><li> 4 번씩 수행 각 처리 조건에 228 웰 치료 계획을 준비한다. (: 666 희석 DMSO 1) 웰 포지티브 (5 Iodotubercidin [1 μM] 또는 디피 리다 몰 [15 μM]) 및 차량 컨트롤을 포함합니다. </li></ol> 췌장의 2 관류 <ol><li> 희석 마취 칵테일 용액 (0.30 ㎖ / 100g 체중)의 IP 주사에 의해 래트를 마취. 쥐가 완전히 마취 및 유해 자극에 응답하지되면, 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 종이 타월의 스택에 앙와위 (두개골 - 꼬리 방향)에서 안락사 쥐를 넣고 70 % 에탄올로 복부 영역을 스프레이. </li><li> U 자 절개 (음부에서베이스)로 복강을 열고 복강을 노출하는 가슴을 통해 주동이의 방향으로 피부를 철회. </li><li> 조심 곡선 포셉 두 쌍을 사용 십이지장 잡아 공통 B의 십이지장 항목을 찾아ILE 덕트 (오디 괄약근) 및 곡선 지혈과 유두에서 십이지장 개방 클램프. </li><li> 담관 유두 클램프 및 곡선 집게를 사용하여 간 부근 담관 잡아 사용 만곡 지혈 리프트. 분리 및 담관을 노출 곡선 집게와 무딘 절개를 사용합니다. </li><li> 헤드 근위 및 원위 다리에 쥐 위치를 조정합니다. </li><li> 췌장 소화 용액으로 낭성 일반적인 간 덕트의 교차점에 일반적인 담즙의 덕트 (CBD)하거나 말단을 Cannulate 10 ML의 주사기를 -loaded 천천히 췌장 소화 용액 10 ㎖를 주입. 주입하는 동안, 메스 핸들과 CBD를 지원합니다. 덕트 및 췌장 팽창하지 않을 경우 바늘 위치를 조정합니다. </li><li> 하행 결장, 창자, 위장과 비장에서 분리하기 위해 곡선 포셉 및 고급 가위를 사용하여 팽창 췌장을 제거합니다. 5 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 얼음 팽창 된 췌장을 배치 <em&gt; 췌장 소화 솔루션입니다. 참고 : 최대 섬 수율은 각 50 ㎖ 소화 관에서 30 분 장소 만 1 또는 2 pancreata 내의 모든 pancreata를 수집합니다. </li></ol> 췌장 3 해리 <ol><li> 일단 모든 pancreata는 수집 된 15 분 동안 37 ° C를 물 목욕으로 소화 튜브를 배치하고 있습니다. 부드럽게 튜브 매 3 분 소용돌이 친다. </li><li> 15 분 후, 적극적으로 튜브를 (수직) 10 회 흔들어 차가운 세척 버퍼 10 ㎖를 추가합니다. 적극적으로 튜브를 추가로 5 번 흔들어 얼음에 배치합니다. </li><li> 튜브 5 번 반전 차가운 세척 버퍼와 믹스 50ml로 소화 튜브를 입력합니다. </li><li> 1 분 동안 4 ° C에서 97 XG에 튜브를 원심 분리기 상층 액을 붓는다. 펠렛 조직을 제거하지 않도록주의하십시오. </li><li> 25 ml의 세척 버퍼를 추가하고 부드럽게 텍싱하여 조직을 다시 일시 중지합니다. 반복 두 번 더 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다. </li><li> 보안 목표 명세서를 통해 30 메쉬 조직 체를 배치250 ml의 비이커를 erile하고 체에 조직 현탁액을 붓는다. 세척 버퍼의 추가 20 ㎖로 소화 튜브를 씻어 메시에 붓는다. 소화되지 않은 췌장과 지방 조직은이 단계에서 제거된다. </li><li> 두 신선한 50 ㎖ 튜브에 여과 재료를 붓고 4 ° C에서 1 분 97 XG에서 회전하여 조직 펠렛. 가만히 따르다 뜨는 및 반전 튜브 초과 버퍼를 배출합니다. </li></ol> 독도 4. 정제 <ol><li> 펠렛 췌장 조직 감기 polysucrose / diatrizoate 나트륨 수용액 20 ㎖ (1.119 g / mL의 농도)를 추가한다. 균일 부드럽게 피펫 팅하여 5 배 아래 각 튜브의 내용물을 다시 일시. </li><li> 조심스럽게 10 ㎖의 HBSS로 polysucrose / 나트륨 용액 diatrizoate 오버레이. 천천히 튜브 벽을 따라 HBSS를 첨가하여 날카로운 액체 계면을 유지한다. </li><li> 천천히 가속없이 브레이크와 15 분 (4 ° C)에 대한 560 XG에 소화 pancreata을 원심 분리기. </li><li> 공동신선한 50 ㎖ 튜브에서 10 ㎖ 피펫 장소 아일렛을 사용하여 인터페이스에서 섬 층 llect. 이 단계에서 독도를 풀하지 마십시오. </li><li> 4 ° C에서 140 XG에 1 분 동안 각각 50 ㎖ 튜브와 스핀에 세척 버퍼의 40 ML을 추가합니다. </li><li> 상층 액을 붓고 튜브를 여러 번 반전 세척 버퍼의 50 ㎖에서 풀링 된 섬을 다시 일시 중지합니다. 펠렛에 독도를 수집하기 위해 4 ° C에서 97 XG에서 1 분 튜브를 원심 분리기. </li><li> 세척 버퍼를 붓고 세척을 반복합니다. 조직 문화 후드에 독도를 가져오고 뜨는을 대기음. </li><li> 아일렛 배지 6 ㎖에 섬의 각 튜브를 다시 일시. </li><li> 여섯 잘 조직 배양 접시의 우물에 각 50 ML 튜브에서 독도를 전송합니다. 잘의 중앙으로 독도를 수집하고 현미경으로 섬의 품질과 순도를 관찰하기 위해 6 잘 접시를 소용돌이 친다. </li><li> 수동으로 1 ml를 피펫을 사용하여 독도를 수집하고 이웃에 집어 독도를 전송또한 섬 미디어 6 ml를 함유. 반복 섬의 소용돌이 90&gt;까지 %의 순도를 따기가 달성된다. </li><li> 아일렛 배지 20 ㎖를 포함하는 10cm 조직 배양 접시로 정제 아일렛 전송. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에 배치 섬 (37 ° C, 5 % CO 2) 하룻밤 (그림 1A). </li><li> 섬 세포, 코트 당 잘 804G 에어컨 미디어의 40 μL와 384 웰 플레이트 도금의 준비를합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션. </li></ol> 5. 분산과 작은 섬 세포의 도금 <ol><li> 다음 날, 부드럽게 세포 스크레이퍼와 10cm 접시에서 독도를 분리하고 50 ㎖ 튜브에 독도를 전송합니다. </li><li> 실온에서 22 XG에서 1 분 동안 원심 분리에 의해 펠렛 아일렛. 뜨는을 대기음. </li><li> 따뜻한 PBS의 20 ㎖로 독도를 씻고 위와 같이 가만히 따르다. </li><li> 0.25 % 트립신의 섬 (쥐의 췌장 당 150 μl를 다시 일시 중지10 분 동안 37 ℃에서) 및 부화. 피펫 최대 섬 아래로 10 시간 배양의 5, 10 분 후 1 ml를 피펫을 사용하여. </li><li> 10 분 후, 완전 소화를 보장하고 혈구를 이용한 섬세포를 계산하기 위해 현미경 트립신 아일렛의 20 μl의 샘플을 평가한다. 5 분 피펫 위아래로 10 회 이상 - 소화되지 않은 섬이 남아있는 경우, 추가로 3 배양을 계속합니다. 필요한만큼 반복합니다. 참고 : 일반적인 수율은 ~ 125,000이다 - 쥐 당 15 만 섬 세포. </li><li> 인큐베이터에서 804G 에어컨 미디어 코팅 된 384 웰 플레이트를 제거하고 12 웰 매니 폴드 흡입기를 사용하여 용지를 제거합니다. </li><li> 아일렛 함수 매체 용액 당 45,000 세포의 밀도로 섬 세포를 중단하고 멀티 채널 피펫 (도 1b)를 웰 당 70 μL (3150 셀) 접시. 참고 : 외부 우물에있는 β 세포가 N과 열 4 판을 사용 행 C의 주변으로 마이그레이션하는 경향이 있기 때문에(21)에 6 쥐에서 고립 된 섬 세포와 228 우물을 판입니다. </li><li> 세포 부착을 허용하기 위해 48 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 놓는다. </li></ol> 6. 작은 섬 세포 문화 치료, 고정 및 염색 <ol><li> 작은 섬 기능 매체의 2 배 농도 (처리 조건을 4 번씩 수행) 차량 및 화합물의 200 μl를 준비합니다. 멀티 웰에 피펫 팅을 용이하게 멸균 96- 웰 플레이트에서 화합물을 배열. </li><li> 조심스럽게 12도 매니 폴드 흡입기와 섬 매체를 제거하고 12 웰 피펫을 사용하여 섬의 기능 매체 (35 μL / 웰)로 교체합니다. 제거하고 (도 1C)를 건조시키는 위험을 제한하기 위해 한 번에 하나의 행에서 미디어를 교체한다. </li><li> 35 μL / 전송 웰의 2 배 화합물 솔루션에 의해 치료를 시작합니다. 48 시간 치료 기간 동안 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 처리 48 시간 후, 플레이트를 반전하여 처리 매체를 가만히 따르다. &lt;/ 리&gt; <li> 부드럽게 1X PBS (1 분)을 잘 당 50 μL와 섬 세포를 씻는다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 PBS를 추가합니다. </li><li> PBS를 경사 분리하고 1X PBS에 희석 차가운 4 % 파라 포름 알데히드의 웰 당 50 μL 첨가하여 세포를 고정한다. 4 ℃에서 15 분 동안 세포를 품어. </li><li> 재정법을 제거 판을 반전 부드럽게 이상으로 잘 당 PBS의 60 μl를 추가하여 세포를 세 번 (5 분마다)를 씻으십시오. </li><li> 포름 아미드 14.25 mL 및 0.75 ml의 0.15 M 구연산 나트륨 (산도 6)을 혼합하여 15 ml의 항원 검색 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 즉시 항원 검색 솔루션을합니다. </li><li> 접시를 반전 우물에서 PBS를 제거하고 각 웰에 60 μl의 항원 검색 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 45 분 동안 70 ℃로 물을 욕조에 접시를 가열한다. 멀티 웰 플레이트의 휘어짐을 방지하기 위해이 배양 중에 플레이트의 상단에 가열 블록을 배치합니다. 참고 : 물이 반까지 잘 판 스커트해야한다; 플레이트는 침수되지 않아야한다. </li><l난&gt; 수조에서 플레이트를 제거하고 실온에서 20 분 동안 냉각 할 수 있습니다. 플레이트는 육안 검사에 의해 뒤틀린되지 않았는지 확인합니다. </li><li> 1X PBS 3 회 잘 당 60 μL (5 분 각각)로 세포를 씻으십시오. 멀티 채널 피펫 PBS를 첨가하고, 플레이트를 PBS 반전 캔트. </li><li> 블로킹 완충액 웰 당 40 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양하여 멀티 채널 피펫을 사용한다. 반전 판과 경사에 의해 차단 버퍼를 제거합니다. </li><li> 염소 항 - 인간 PDX-1 (1 : 100) : 마우스 기-67 (200 1) 항 - 인간의 40 μl를 추가 각 웰에 버퍼를 차단에 희석 항체를 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 그 다음날, 상기와 같이 세 번 (5 분마다)을 방지 체 용액을 디 캔트 및 1X PBS로 세포를 세척 하였다. PBS를을 가만히 따르다. </li><li> 버퍼를 차단에 : (200 일) 바이오틴 당나귀 항 - 마우스 IgG와 로다 민 - 복합 당나귀 방지 염소 IgG의 희석을 잘 당 40 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 품어실온에서 첨가 하였다. </li><li> 1X PBS로 세 번 5 분 각각의 세포를 씻으십시오. 각 웰에 형광 접합 된 스트렙 타비 딘 (버퍼를 차단 400 1) 희석 40 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 1X PBS로 세 번 5 분 각각의 세포를 씻으십시오. DAPI의 웰 (블로킹 완충액 300 ㎚) 40 μl를 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 1X PBS로 두 번 세포를 씻고 PBS 1X 40 μl의 세포를 둡니다. 판은 분석 준비가 완료된다. </li></ol> 7. β - 세포 복제 분석 주 : 분석 프로토콜 β 세포 복제를 측정하기 위해 사용 된 고 함량 검사 현미경 확립되어야한다. 가장 간단한 구성에서,이 프로토콜은 식별 마커 β 세포를 정의하는데 사용되는 2 색 분석은 (PDX-1 + β- 세포) 및 복제 마커 (기-67) 세포 분열 이벤트를 정의하는 데 사용된다. <ol><li> 결과 평균에 기반하여 객체 (β 세포)를 식별β 세포 ​​핵 (도 2a)의 예상되는 화소 영역 내 (폭 &lt;1.6 길이)의 대략 원 안에 PDX-1 염색 (549 nm 인 필터)의 예를 형광 강도. </li><li> 다음으로, PDX-1 + 영역 (그림 2B) 내에서 평균 형광 강도 (485 나노 필터)에 따라 복제 이벤트 (기-67 양성)를 식별하는 설정을 설정합니다. 주 : 노출 시간에 걸쳐 이미지 픽셀 강도 비교를 허용하도록 수정되어야한다. 분석 프로토콜 파라미터는 시스템 호출 지속적 데이터 품질에 부정적인 영향을 미칠 수있는 비특이적 염색, 파편 및 세포 응집물을 배제되도록 조정된다. </li><li> 정확도 한계 다양성을 최대화하기 웰당 500 β 세포의 최소 분석. 참고 : 마우스 아일렛 배양 기저 β 세포 복제 인덱스가 0.5이 될 것으로 예상된다 - 3 %. 일반적으로,도 40의 이미지는 500 β 세포를 식별하기에 충분한 것보다 더 많은 것이다. </li><li> 를 분석하기 전에전체 플레이트, 네거티브 선택 (DMSO - 처리) 및 양성 통제를 분석 (5- iodotubercidin [1 μM] 또는 디피 리다 몰 [15 μM]를) 분석 프로토콜의 유효성을 평가하기 위해 처리 한 웰. 분석이 정확하게 설정되는 경우, 양성 대조군 화합물은 β 세포 복제의 비율에서 적어도 두 배 증가를 유도한다. </li><li> 분석 프로토콜이 확인되면 전체 판을 읽어보십시오. </li></ol>

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<li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li>
<li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion%3A+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li>
<li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+%28GSK3beta%29+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+%28Dyrk1A%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li>
<li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K%2B+channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li>
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<li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+IPF-1%2FSTF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).</li>
<li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1%2Finsulin+dual-reporter+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li>
<li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry%2C+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

β 세포의 성장과 재생을 제어하는​​ 분자 경로를 연구하기위한 실험 방법은 당뇨병 연구를위한 중요한 도구입니다. 여기서, 쥐 작은 섬 기반 스크리닝 플랫폼을 제시 β 세포 복제의 작은 분자 자극을 식별하고 특성화합니다. 이 프로토콜의 대부분의 측면 쉽게 경험이 풍부한 연구자들에 의해 수행되는 동안, 몇 가지 단계가 특정 기술을 필요로한다. 첫째, 섬 격리하는 동안, 무결성을 방해하지 않고 담즙 덕트의 삽관 연습이 필요합니다. 유용한 전략은 최소한 완전히 췌장 소화 용액을 분배하기 전에 바늘의 적절한 포지셔닝을 보장하기 위해 담관 팽창한다. 둘째, 외분비 조직에서 효율적으로 섬 격리는 소화 기간 및 적절한 교반에 세심한주의를 필요로한다. 케어는 간헐적으로 소용돌이를 통해 다이제스트에 걸쳐에도 난방을 보장하기 위해주의해야한다. 셋째, 실험의 성공은 따라 달라집니다독도 및 수동 섬 따기 동안 외분비 파편 사이에 실력 차별시의; 이 기술은 연습이 향상됩니다. 넷째, 아일렛 분산 도금...

당뇨병은 포도당 항상성 교란의 공통 종점 공유 질환의 컬렉션을 포함한다. 당뇨병 아형의 병원성 메카니즘은 구별이기는하지만 감소 β 세포 질량, 즉 인슐린 생산 능력 1,2- 손실의 결과를 공유한다. 현재 당뇨병 치료 전략은 외인성 인슐린, 인슐린 생산, 인슐린 감수성 증강 약물 자극 만성 투여에 의존하고, 거의, 췌장 또는 전부를 3,4- 췌장 이식. 유감스럽게도, 이러한 전략의 성공은 짧은 수명 및 / 또는 충분히 내인성 인슐린 생산 기능을 요점을 되풀이하는 데 실패합니다. β 세포의 재생을 촉진하는 방법을 개발의 유용성에도 불구하고, 이러한 접근 방식은 존재하지 않는다. 따라서, 당뇨병의 주요 연구의 목표는 새로운 β 세포를 생성하거나 내인성 β 세포 5 질량 확장 방법을 개발하는 것이다 </sup&gt;. 이러한 배아 줄기 세포와 같은 재생 에너지 원 β - 세포 재생이 진행되고 있지만, 안전과 효율 우려가 성숙 β 세포의 확장, 우선 순위 6,7를 포함하여 다른 전략을 추구합니다. 중요한 생체 내에서 새로운 β 세포의 주된 소스는 기존의 β 세포보다는 특수 전구 세포 8,9이다. β 세포가 제한된 복제 능력 β 세포 질량의 작은 증가를 갖는 것처럼 보이지만 (~ 30 %)이 많은 당뇨 환자의 혈당 항상성을 복원하기에 충분할 수있다. 또한, β 세포 질량의 동일계 약물 자극 잠재적 인 저렴하고 확장 치료 전략이다. 여기서 β 세포의 성장을 자극하는 작은 분자를 확인하고 특성화하기위한 고급 컨텐츠 스크리닝 방법이 제공된다. 시험 관내 실험 방법의 다양한 유전자 생성물 및 / 또는 분자 그쪽을 식별하기 위해 사용될 수있다t 차 β 세포 복제를 추진하고 있습니다. β 세포 ​​복제 유도를 측정하기위한 초기의 노력은, 특정 처리 조건 (10)에 응답하여 알데히드 - 티오 닌 또는 인슐린 염색 모집단 내에서 [3 H] 티미 딘 혼입 BrdU의 혼입 또는 유사 분열 체를 측정하는 태아 설치류 pancreata 배양 또는 그대로 고립 섬 배양 물을 사용하여 11. 이 체외 접근법과 유사 검색어는 그 몇 가지 제한이 있습니다. 눈에 띄는 결함 성숙한 β 세포와 달리, 높은 기저 β 세포 복제 속도를 표시하고 명료하게 12 규제 증가하고, 태아 세포 (1)의 사용을 포함한다; (2) β 세포 복제 이벤트의 실험자에 의존 판결의 주관적 성격 (3) β 세포 복제 이벤트의 실험자에 의존하는 계산의 노동과 시간 집약적 인 특성은 실험 처리량을 지연시킨다; 핵 혼입 / 얼룩 / 외관 (4)를 사용하더라도 복제 식별TS 및 β 세포를 식별하기 위해 비 중복 세포질 염색-β 세포에 근접한 비 β 세포 복제 사건 misattribution 리드. 보다 최근 성숙한 차 β 세포가 β 세포 복제 13-16의 과발현 유전자의 영향뿐만 아니라 유전자 생성물 또는 화합물을 치료를 평가하기 위해 사용되었다. 그러나, 이들 연구는 또한 복제 이벤트, β 세포의 식별 및 / 또는 처리량을 제한하는 노동 집약적 인 단계, 예를 들어, 세포 또는 본래 췌장의 개별 슬라이드 웰 도금 세포질 staining- 또는 비특이적 방법 주관적 계수에 의존 파라핀 매립 및 처리 17. 특히, 본 명세서에서 비슷한 이미지 기반 인간의 β 세포 복제 심사 방법론은, 18 게시 된; FEA 그러나 이러한 분석의 성공적인 사용은 입증되지 않은 일차 스크리닝 인간의 아일렛의 사용은 광범위하지 않을sible. 복제 - 증진 물질을 식별하기위한 다른 전략은 β 세포주의 성장 유도를 평가하는 것이다. 초기 노력은 형질 전환 된 β 세포 라인을 같은 MIN6 세포 또는 INS 13분의 832 세포 14,19-21을 사용했다. 그러나, 이러한 세포 라인은 무제한 성장을 보여 주 잘 차별화 된 β 세포 (22)에 약간의 유사성. 따라서, 성장 유도 용량은 최소 불분명 관련성 및 요점을 되풀이하는 것이 때로는 곤란하다. 세포주 기반 스크리닝 개선 전략은 테트라 사이클린 (독시사이클린)의 부재하에 성장 체포 의존적 SV40 T 항원의 발현 23,24있는 세포 &quot;가역적으로 변환&quot;이용한다. 그러나, 이러한 세포가 독시 싸이클린 제거시 &quot;일반적인&quot;β 세포와 같은 상태로 되돌아 여부를 명확하지 않다. 불행하게도,이 세포의 사용은 즉시 유틸리티가 표시되지 않는 일반화 된 성장 촉진 화합물을 수득했다24. 전반적으로, 최소한의 자발적인 복제 작업을 표시하는 세포 유형의 성장 조절을 연구 세포 라인의 사용은 제한된 적용 가능성을 가질 수도있다. 여기에 제시된 β 세포 복제 심사 플랫폼은 가능한 한, 혈통 제한 성장 촉진 활동의 식별을 가능하게 혼합 세포 형 조성물의 섬 - 세포 배양, 멀티에게 생체 내 성장 조절에 유지하는 성숙한 기본 쥐의 β 세포를 활용 - 음 처리량 및 자동 분석을 최대화하기 위해 포맷하면 바이어스를 제거하고 처리량을 용이. 이 플랫폼의 성공적인 사용은 β 세포 복제 25, 26을 촉진 몇 가지 화합물을 식별 할 수있게되었습니다. 또한, 분석은 β 세포 복제 분자 조절 기전에 대한 통찰력을 제공하는 구조 - 활성 관계 연구 및 화학 상위 성 실험을 위해 사용되었다. 제시된 플랫폼이 성공적으로 fo를 적응했다β 세포 ​​복제 연구 렌티 바이러스의 RNAi 기반 조사 (25) 경로. 분석의 한계 (일차 전지의 사용) 확장 성을 제한 포함, 오히려 항체 기반 이미징 및 주요 섬의 사용, 사용과 관련된 (분석 인간 섬의 연구에 적용 할 수 있지만) 인간의 섬 세포, 비용보다 설치류의 사용 이미지 획득 및 분석 기능을 가진 자동 현미경의 가용성에 따라 자동화 된 이미지 획득 및 의존성을 용이하게 분산 된 섬 (파쇄 섬 구조)의. 유전자 제품이나 현장에서의 β 세포 재생을 자극하는 화합물을 식별하기위한 손쉬운 생체 검사 방법이 이상적 일 것이다하지만, 이러한 플랫폼은 아직 27 사용할 수 없습니다. 따라서, 설명 된 플랫폼은 β 세포 복제의 대부분의 측면을 조사 연구에 관심이 적합하다.

<table><tbody><tr><td>250g 남성 Sprague Dawly 쥐</td><td>찰스 강</td><td>얼룩 # 400</td><td></td></tr><tr><td>12cm 치아 tisuue 집게</td><td>파인 사이</td>언스 도구 <td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm 파인 사이</td>언스 도구 파인 사이언스 <td>도구</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm 수술 용 가위</td><td>파인 사이</td>언스 도구 <td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16cm 곡선 겸자</td><td>파인 사이</td>언스 도구 <td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12cm 곡선 hepostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12cm 메스 손잡이</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue sieve-30 mesh</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 CDA units</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>케타민 HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP 제약</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>을 사용하여 마취 칵테일을 만드는 방법&nbsp;</td></tr><tr><td>자일라진 (5 g/50 ml)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>마취 칵테일을 만들기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td> to <td>make histopaque 1100</td></tr><tr><td>신생아 송아지 세럼 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>기능성/실행 가능성 솔루션&nbsp;</td><td>미디어테크</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 미디어&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>은 조절된 매체</td></tr><tr><td>804G 쥐 방광 암종 세포주</td>를 만들기 위해 <td>요청</td><td></td> 시 제공됩니다. 조절 <td>가능한 매체</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 자격이 있는</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드 500ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>항원 마스크 해제 용액 250ml(pH 6.0)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>0.15M 시트르산나트륨 용액</td></tr><tr><td>만들기 포도당, 무수</td><td>EMD 화학 물질</td><td>DX0145-1</td><td>1M 포도당 용액</td></tr><tr><td>만들기 Nomal Donkey Serum (Powder)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항인간 Ki67 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>염소 항인간 PDX-1 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>폴리클론 기니피그 항인슐린 항체</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>폴리클론 토끼 항글루카곤 항체</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>폴리클론 토끼 항소마토스타틴 항체</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>폴리클론 닭 항비멘틴 항체</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-SP-접합, 동키 안티-마우스 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>로다민-접합 당나귀 안티-염소 IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>로다민-활용 당나귀 항기니피그 IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>로다민-활용 당나귀 항-토끼 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-활용 당나귀 항-기니피그 IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-활용 당나귀 항염소 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-활용 당나귀 항토끼 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-활용 당나귀 항닭 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>일회용 시약 저장소 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 웰, 블랙/클리어, 조직 배양 처리 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 웰, 블랙/클리어, 조직 배양 처리 플레이트</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 피펫터</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12채널 진공 흡입기</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크래퍼</td><td>팔콘</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 수조 모델 2223&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-content 스크리닝 기기: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

인슐린 생산 β세포의 손실은 당뇨병의 주요 특징입니다. 다양한 잠재적 대체 요법이 연구되고 있지만, 내인성 인슐린 생산 췌장도 β세포의 확장은 여전히 매력적인 전략으로 남아 있습니다. β세포는 자발적 재생 활동이 제한되어 있습니다. 따라서 중요한 연구 노력은 β세포 성장을 억제하는 분자 경로에 대한 정확한 이해를 개발하고 이러한 억제를 극복할 수 있는 약물을 식별하는 것입니다. 본 명세서에서는 β세포 복제를 촉진하는 소분자를 식별하기 위한 자동화된 고함량 이미지 기반 일차 세포 스크리닝 방법을 제시합니다. 이전 방법론의 몇 가지 한계가 극복되었습니다. 첫째, 불멸화된 세포주가 아닌 1차 섬 세포를 사용하면 생체 내 성장 억제 물질의 보유를 극대화할 수 있습니다. 둘째, β세포주가 아닌 혼합 구성의 섬 세포 배양을 사용하면 계통 제한 및 일반 성장 자극제를 모두 식별할 수 있습니다. 셋째, 이 기술은 384개의 우물 형식을 사용하여 제한 자원인 1차 섬의 사용을 실용화합니다. 넷째, 불규칙한 섬 양식 품질과 관련된 해로운 실험 변동성은 분리, 분산, 도금 및 배양 매개변수의 최적화를 통해 극복됩니다. 다섯째, 섬 내분비 세포의 낮은 기저 복제율을 정확하고 일관되게 측정하는 데 따르는 어려움은 최적화된 면역염색 매개변수, 자동화된 데이터 수집 및 데이터 분석을 통해 극복됩니다. 자동화는 처리량을 향상시키는 동시에 실험자 편향을 제한합니다. 이 분석의 주목할 만한 한계는 섬 구조를 방해하는 분산된 섬 배양물의 사용, 인간 섬이 아닌 설치류의 사용, 일차 세포의 사용과 관련된 처리량 및 비용의 내재적 한계입니다. 중요한 것은 이 전략이 인간 섬 복제 연구에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 이 분석법은 β 세포에 대한 물질의 유사분열 효과와 β세포 성장을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 매우 적합합니다.

β-α 세포 또는 세포 복제를 평가하기 위해, 4 색 분석 프로토콜이 요구된다. 첫째, 객체는 DAPI 염색 (채널 1, 386 ㎚)로 식별됩니다. 다음으로, β 세포 (이벤트 1) 계산됩니다 : 개체 PDX-1 + (채널 2, 650 ㎚) 및 근교 핵 인슐린 (채널 3, 549 nm의) 협력을-표현한다. 그 후, 복제 β 세포 (이벤트 2) 계산됩니다 : (이벤트 1)이 공동 명시 기-67 (채널 4, 485 ㎚) (그림 3) 세포를 β. β 세포를 복제의 비율이 계산됩니다 (이벤트 2 / 이벤트 1) α 세포 복제를 정량화하기 (100)를 X, 총 개체가 DAPI 염색에 의해 식별됩니다 (채널 1) 다음 α 세포 (이벤트 1)에 의해 열거 PDX-1 염색 부재 (채널 2) 및 핵 주변 글루카곤 염색의 존재 (채널 3). 복제 α 세포 (이벤트 2) 기-67 (채널 4) (그림 <stro...

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

이 고내용 베타 세포 복제 스크리닝 플랫폼의 전반적인 목표는 베타 세포의 성장을 제한하는 분자 경로의 연구를 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 베타 세포 재생을 조절하는 주요 신호 분자 및 경로와 같이, 베타 세포 생물학 분야의 중요한 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 특정 평가에 대한 세포 라인의 처리량을 증가시킬 수 있고, 일차 췌도 세포 복제의 자동화된 데이터 분석이 가능하다는 점입니다. 이 기술의 활용은 우리 사회에 막대한 건강 및 경제적 비용을 초래하는 질병인 당뇨병의 재생 치료제 개발로 확장될 가능성이 있습니다.먼저 22 gauge 바늘이 장착된 췌장 소화액이 충전된 10 milliliter 주사기를 사용하여 담낭관과 총간관의 접합부 또는 그 바로 원위부에서 총담관을 캐뉼라화합니다. 메스 핸들로 총담관을 지지하면서 10 milliliters의 용액을 천천히 주입합니다. 모든 콜라게나제 주입이 완료되면, 곡선 핀셋과 가위를 사용하여 팽창된 췌장을 하행 결장, 장, 위 및 비장에서 분리합니다.그런 다음 5 mL의 췌장 소화 용액이 들어있는 얼음 위의 50 mL 튜브에 최대 2개의 췌장을 넣습니다. 모든 췌장이 수집되면, 소화 튜브를 37 °C 워터배스에 넣고 3분마다 가볍게 회전시키며 15분 동안 둡니다. 소화가 끝나면 튜브를 수직으로 10회 강하게 흔듭니다.그리고 시료에 차가운 세척 버퍼 10 milliliters를 추가합니다. 튜브를 5회 더 강하게 흔든 후 얼음에 둡니다. 다음으로 차가운 세척 버퍼를 사용하여 튜브의 최종 부피가 50 milliliters가 되도록 채우고 튜브를 5회 뒤집어 섞습니다.그런 다음 조직을 원심 분리하고 펠릿이 떨어지지 않도록 주의하며 상층액을 따라 버립니다. 조직 슬러리를 25 milliliters의 세척 완충액에 다시 현탁시킨 후 부드럽게 볼텍싱합니다. 원심 분리와 재현탁 단계를 두 번 더 반복합니다.조직 현탁액을 30 mesh 조직 체를 통해 멸균된 250 milliliter 비커에 붓습니다. 소화 튜브를 20 milliliters의 세척 완충액으로 추가 린스하고, 소화되지 않은 췌장 및 지방 조직을 제거하기 위해 세척액을 체 위에 붓습니다. 여과된 물질을 두 개의 새로운 50 milliliter 튜브에 나누어 담고 원심분리를 통해 조직을 펠렛화합니다.그런 다음 상층액을 따라내고 튜브를 뒤집어 과잉 버퍼를 제거합니다. 섬세포를 정제하기 위해 췌장 조직 펠렛에 차가운 밀도 구배 용액 20 milliliters를 첨가하고, 파이펫으로 다섯 번 부드럽게 상하로 섞어 내용물을 균질하게 재부유시킵니다. 다음으로 액체 계면이 뚜렷하게 유지되도록 주의하며 각 구배 튜브의 벽면을 따라 HBSS 10 milliliters를 천천히 층이 지게 얹은 후, 원심분리를 통해 췌장 세포를 분리합니다.10 milliliter 피펫을 사용하여 인터페이스에서 소도층을 새로운 50 milliliter 원심 분리관으로 옮깁니다. 그런 다음 40에서 50 milliliter의 세척 완충액으로 소도를 3회 세척합니다. 각 원심 분리 단계 사이에는 튜브를 뒤집어 펠릿을 재현탁시킵니다.마지막 세척 후, 튜브를 조직 배양 후드로 옮깁니다. 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그리고 펠릿을 6 mL의 islet medium으로 재부유합니다.각 튜브의 islet을 6-well 조직 배양 플레이트의 개별 well에 체로 걸러 넣습니다. 그리고 플레이트를 흔들어 islet이 well 중앙에 모이도록 합니다. 현미경으로 islet의 순도를 평가합니다.섬세포를 추가로 정제하려면, 1 mL 피펫을 사용하여 섬세포를 수집하고 6 mL의 섬세포 배지를 사용하여 인접한 웰로 옮깁니다. 순도가 90% 이상이 될 때까지 섬세포 회전, 수집, 이동 및 현미경 평가 과정을 반복합니다. 다음으로, 섬세포를 20 mL의 섬세포 배지가 담긴 단일 10 cm 조직 배양 접시로 옮깁니다.모든 아일렛(islets)을 수확한 후, 배양 접시를 조직 배양 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 그다음 384 웰 플레이트의 각 웰에 40 µL의 804G 조건화 배지(conditioned medium)를 코팅하고, 플레이트를 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 세포 스크래퍼를 사용하여 아일렛을 조심스럽게 분리합니다.그런 다음 이질(islets)을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 이질을 수집합니다. 그다음 20 milliliters의 따뜻한 p, b, s로 세척합니다.1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그리고 펠릿을 0.25% Trypsin에 재현탁합니다.1 mL 피펫을 사용하여 5분과 10분 시점에 췌도 조직을 10회 흡입 및 분주하며 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 두 번째 트리터레이션(trituration) 후, 트립신 처리된 췌도 세포의 20 µL 샘플을 계수합니다. 조직이 완전히 분해되었다면, 해리된 췌도 세포를 췌도 기능 배지(islet function medium)에 4.5 × 10⁴ cells/mL 농도로 부유시킵니다.그런 다음 12웰 매니폴드 흡입기를 사용하여 이전에 준비한 384웰 플레이트에서 804G 배양액을 제거합니다. 그리고 웰당 70 µL의 islet을 4~21번 열의 c~n행에 걸쳐 분주합니다. 조직 배양 배양기에서 48시간 동안 islet이 부착되도록 둡니다.이틀 후, 12웰 매니폴드 흡입기를 사용하여 islet 배지를 조심스럽게 제거하고, 12채널 피펫을 사용하여 각 웰에 35 µL의 islet 기능 배지를 추가합니다. 그런 다음, 갓 조제한 2x 농도의 대상 화합물 용액 35 µL를 각 웰에 옮깁니다. 이후 islet을 인큐베이터에 넣고 48시간 동안 더 배양합니다.48시간 후, 자동 고해상도 이미징 플랫폼(automated high content imaging platform)을 사용하여 화합물 처리된 islet 배양물을 고정, 염색 및 분석합니다. 일반적인 실험에서 DAPI, PD-1 및 insulin 양성 베타 세포의 복제율은 Ki-67을 공동 발현하는 베타 세포의 백분율로 결정합니다. 알파 세포의 복제는 DAPI 양성, PD 음성, Glucagon 양성이면서 Ki-67을 공동 발현하는 세포의 백분율로 측정합니다.예를 들어, 이 대표적인 실험에서 Dipryridamole은 alpha 세포가 아닌 beta 세포의 복제를 촉진하는 것으로 관찰되었습니다. 이 기술은 7일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 통해 beta 세포 복제를 촉진하는 화합물을 선별하여 그 작용 기전을 추가로 연구할 수 있습니다.이 기술을 통해 베타 세포 생물학 분야의 연구자들은 베타 세포 성장을 조절하는 새로운 신호 인자와 경로를 식별할 수 있었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 소분자가 베타 세포 재생을 선택적으로 자극하는 능력을 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

a-high-content-vitro-pancreatic-islet-cell-replication-discovery

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

분리하는 프로토콜은, 인간 태아의 췌장 세포에서 파생 된 문화, 이미지 섬 세포 클러스터 (ICCS)를 설명한다. 이 방법은 조직, 문화, 단일 층으로 또는 집계 등의 현탁액 및 확산 마커와 췌장 세포의 운명 결정에 대한 이미지에서 ICCS을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

단일 셀 RNA 시퀀싱 뒤 미 발달, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포의 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하면 분석 췌 장 내 분 비 계보 개발의 셀이 transcriptomic 역학.

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

배우세요 췌장 작은 섬 β 세포 복제를 촉진하는 고콘텐츠 스크리닝 방법을 통해 당뇨병 재생 치료 연구의 핵심 신호 경로를 규명하는 기술을 익히세요.

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