2016년 9월 27일
높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 식물 원형질체의 빠르고 자동화된 고처리량 스크리닝을 위한 방법을 개발하고, 특히 많은 수의 게놈 편집 및 유전자 침묵 표적에 대한 조기 스크리닝에서 현재 병목 현상을 해결하는 것입니다. 이 방법은 식물 생명 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 발현에서 프로모터 기능의 신속한 병렬 스크리닝을 위해 고처리량 자동 원형질체 생산 및 형질전환을 가능하게 한다는 것입니다.
이 절차는 널리 사용되는 담배 브라이트 옐로우 2 또는 BY-2 현탁액 배양을 사용하여 시연됩니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 삼각 플라스크에서 BY-2 배양을 성장시키는 것으로 시작합니다. 원형질체를 분리하는 날, 세포가 빠르게 정착할 수 있도록 배양액을 철저히 혼합하고 배양액 6ml를 15ml 원뿔형 바닥 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
세포가 최소 10분 동안 가라앉도록 합니다. 적절한 부피의 상등액을 제거하여 패킹된 세포 부피를 전체 부피의 50%로 조정합니다. 튜브를 뒤집어 흔든 다음 광역 피펫을 사용하여 500마이크로리터의 세포 현탁액을 분해를 위해 6웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 주입합니다.
이 절차의 첫 번째 단계는 마이크로플레이트 무버, 액체 처리기, 다중 모드 플레이트 리더, 다중 모드 디스펜서, 플레이트 히터 또는 냉각기 및 컴퓨터인 로봇 시스템의 모든 구성 요소를 켜는 것입니다. 다음으로, 마이크로플레이트 무버를 다른 장비와 통합하여 각 장비 간에 플레이트를 전송할 수 있도록 하는 플레이트 무버 작업 스케줄링 소프트웨어를 엽니다. plate mover 소프트웨어에서 프로토콜에 사용되는 실험기구에 대한 기술 사양을 정의합니다.
기본 도구 모음에서 설정을 클릭하고 컨테이너 유형 관리 명령을 선택합니다. 기존 컨테이너 유형 목록에서 적절한 컨테이너 유형을 선택합니다. 플레이트 무버가 마주치게 될 모든 실험기구에 대한 기술 사양을 정의합니다.
다음 단계는 각 컨테이너의 시작 및 끝 위치를 정의하는 것입니다. 특정 프로토콜에서 Start/End(시작/종료) 탭을 클릭합니다. 각 컨테이너의 시작 위치를 선택하고 시작 및 종료 위치 모두에서 Lidded, Unlidded 확인란을 선택합니다.
각 실험기구의 시작 및 종료 위치를 정의한 후 전체 워크플로우의 시작 위치에 모든 플레이트를 수동으로 로드합니다. 96웰 형광 스크리닝 플레이트를 호텔 2에, BY-2 세포가 있는 6웰 플레이트를 호텔 3에, 플레이트 히터 또는 냉각기의 둥지 2에 변형하는 데 사용할 96웰 플레이트, 효소 용액을 포함하는 50ml 원뿔형 튜브를 다중 모드 디스펜서에 로드합니다. 프로토콜에서 변형을 수행하려면 주황색 형광 단백질 리포터 구조를 포함하는 10마이크로리터의 혈장 DNA를 96개 깊이의 웰 플레이트의 각 웰에 사전 로드하고 플레이트 히터 또는 냉각기에서 섭씨 4도의 온도에서 배양합니다.
모든 소모품과 플레이트를 지정된 위치에 있는 자동 액체 취급 플랫폼에 적재합니다. 웰당 200마이크로리터의 40% 폴리에틸렌 글리콜 용액이 사전 로드된 96웰 플레이트를 컬럼 1에 로드합니다. 둥지 8에 피펫 팁 상자를 적재합니다.
자동 Liquid Handling 플랫폼 소프트웨어에서 각 항목의 위치를 정의하려면 메뉴에서 Tools를 선택하고 Labware Editor를 클릭합니다. 풀다운 메뉴에서 실험기구 유형을 선택합니다. Main Protocol(주 프로토콜) 탭을 선택하고 Configure Labware(Labware 구성)를 클릭하여 각 Labware의 위치를 정의합니다.
실행을 클릭하여 프로토콜에 사용할 모든 장치를 초기화합니다. 마지막으로 Work Explorer 창에서 Add Work Unit을 클릭하여 시스템의 모든 실험기구를 확인하고 자동화된 프로토콜을 시작합니다. 절차에서 가장 민감한 부분은 원형질체(protoplast) 형질전환(transformation)입니다.
변환은 로보틱스 시스템에 의해 수행되므로 자동화된 프로토콜이 올바르게 설정되는 것이 중요합니다. 이 비디오에서는 자동화된 프로토콜에서 선택한 단계만 표시됩니다. 변형 프로토콜 중에 자동화된 액체 취급 플랫폼은 6웰 플레이트에서 70마이크로리터의 프로토플라스트 용액을 흡입하고 nest six의 96개 깊이 웰 플레이트로 분배합니다.
그런 다음 새로운 피펫 팁을 사용하여 사전 로드된 딥 웰 플레이트에서 70마이크로리터의 고점도 폴리에틸렌 글리콜 용액을 천천히 흡입하고 딥 웰 플레이트의 해당 웰로 용액을 완전히 분주합니다. 다음으로, 자동 액체 취급 플랫폼은 딥 웰 플레이트를 다음 6에서 네스 9로 이동하고, 플레이트 이동기는 플레이트를 집어 플레이트 셰이커 스테이션으로 이동하여 1500RPM으로 30초 동안 흔듭니다. 원형질체의 평형을 허용하기 위해 흔들지 않고 20분 동안 배양한 후, 플레이트 무버는 96-deep 웰 플레이트를 다중 모드 디스펜서로 이동하고 세척 프로토콜을 트리거합니다.
자동화된 원형질체 분리 및 형질전환 프로토콜이 완료되면 로봇 시스템 중 하나인 호텔에서 형질전환된 원형질체가 있는 플레이트를 제거합니다. 도립 현미경, 카메라, 형광등을 켭니다. 프로톱플라스트에 대한 초기 초점을 맞추기 위해 10X 대물렌즈를 선택합니다.
할로겐 램프를 켜고 형광램프의 셔터를 닫습니다. 플레이트를 현미경 시스템에 로드하고 명시야를 사용하여 원형질체에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 할로겐 전구를 끄고 형광등의 셔터를 엽니다.
형질전환 원형질체에 의해 발현된 주황색 형광 단백질의 시각화를 위해 Cy3/TRITC 필터 세트를 선택합니다. 각 웰을 스캔하여 형광 마커를 발현하는 원형질체의 수를 확인합니다. 이 프로토콜에 명시된 조건에서 프로토플라스트의 효소 분해는 6웰 플레이트당 2, 820, 000개의 프로토플라스트를 생성했습니다.
프로토콜의 각 전달 단계 후 protoplast 농도의 손실을 평가했습니다. 분해 프로토콜 후, 11,500개의 프로토플라스트를 96개 깊이의 웰 플레이트의 각 웰로 옮겼습니다. transformation protocol이 완료되면 1,230개의 protoplast를 96-well 형광 스크리닝 플레이트로 옮겼습니다.
여러 피펫팅 단계가 프로토플라스트를 손상시키지 않도록 하기 위해 프로피듐 요오드화물 염색으로 생존력을 분석했습니다. 그 결과, 분해 후, 96웰 형광 스크리닝 플레이트로 옮긴 후, 그리고 형질 전환 프로토콜 후에 생존력에 큰 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 형질전환 프로토콜은 형질전환 효율이 낮았음에도 불구하고 주황색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 세포를 생성하는 데 성공했는데, 이는 약 2%에 불과했는데, 이는 사용된 대형 이진 플라즈믹과 프로토콜이 BY-2 원형질체에 대해 특별히 최적화되지 않았기 때문입니다.
프로토콜의 시간 경과에 대해 얻은 메트릭은 소화 단계에서 주요 시간 투자가 소비된다는 것을 보여주었습니다. 원형질체 분리 및 형질전환의 전체 소요 시간은 3시간 50분 53초였으며 작업자의 외부 입력이 필요하지 않았습니다. 적절하게 설정되면 로봇이 이 기술을 4시간 이내에 수행할 수 있습니다.
개발 후 이 기술은 식물 생명 공학 분야의 연구자들이 게놈 편집 및 프로모터 스크리닝과 같은 고처리량 작물 게놈 절차를 수행할 수 있는 길을 닦고 있습니다.
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이 기사는 담배 원형질체 생산 및 형질전환을 위한 고처리량, 자동화된 방법론을 설명합니다. 이 로보틱 시스템은 BY-2 모델 시스템에서 대규모 병렬 유전자 발현 및 발견을 용이하게 하며, 비모델 작물에 잠재적 적용 가능성이 있습니다.
High-throughput protoplast isolation and transformation addresses a critical bottleneck in early-stage plant biotechnology screening, enabling rapid parallel evaluation of genome editing and gene silencing targets. The robotic platform reduces operator dependence and accelerates discovery timelines for promoter function analysis and trait validation. This capability supports predictive confidence in target selection and portfolio prioritization for crop improvement programs.
The method integrates into the discovery workflow from target hypothesis testing through lead identification, enabling rapid protoplast-based screening prior to stable line generation.