높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

본 프로토콜의 전반적인 목적은 식물 원형질체(protoplast)를 신속하고 자동화된 고처리량 스크리닝(high-throughput screening) 방식으로 분석하는 방법을 개발하여, 특히 다수의 게놈 편집 및 유전자 억제 타겟을 조기에 스크리닝하는 과정에서 발생하는 현재의 병목 현상을 해결하는 것입니다. 이 방법은 식물 생명공학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량 자동화 원형질체 제조 및 형질전환을 가능하게 하여, 유전자 발현에서의 프로모터 기능을 신속하게 병렬 스크리닝할 수 있다는 점입니다.

이 절차는 널리 사용되는 담배 bright yellow two, 즉 BY-2 현탁 배양물을 사용하여 시연될 것입니다. 프로토콜 본문에 설명된 대로 Erlenmeyer 플라스크에서 BY-2 배양물을 배양하는 것부터 시작하십시오. 원형질체 분리 당일에는 세포가 빠르게 가라앉으므로 배양물을 충분히 혼합한 후, 배양물 6 mL를 15 mL 원추형 바닥 원심분리 튜브로 옮기십시오.

세포가 가라앉을 때까지 최소 10분 동안 둡니다. 적절한 양의 상층액을 제거하여 세포 침전물 부피를 총 부피의 50%로 조정합니다. 튜브를 반전시켜 흔든 후, 광구 파이펫(wide bore pipette)을 사용하여 6-웰 플레이트의 각 웰에 소화용 세포 현탁액 500 µL를 분주합니다.

이 절차의 첫 번째 단계는 마이크로플레이트 무버, 액체 핸들러, 멀티모드 플레이트 리더, 멀티모드 디스펜서, 플레이트 히터 또는 칠러, 그리고 컴퓨터를 포함한 로보틱스 시스템의 모든 구성 요소를 켜는 것입니다. 다음으로, 각 장비 간에 플레이트 이동이 가능하도록 마이크로플레이트 무버를 다른 장비들과 통합하는 플레이트 무버 작업 스케줄링 소프트웨어를 실행하십시오. 플레이트 무버 소프트웨어에서 프로토콜에 사용되는 실험 기구의 기술 사양을 정의하십시오.

메인 툴바에서 Setup을 클릭하고 Manage Container Types 명령을 선택합니다. 기존 Container Type 목록에서 적절한 Container Type을 선택하십시오. 플레이트 무버가 접하게 될 모든 실험 기구의 기술적 사양을 정의합니다.

다음 단계는 각 컨테이너의 시작 및 종료 위치를 정의하는 것입니다. 특정 프로토콜의 Start/End 탭을 클릭하십시오. 각 컨테이너의 시작 위치를 선택하고, 시작 및 종료 위치 모두에서 Lidded, Unlidded 확인란을 체크하십시오.

각 실험 기구의 시작 및 종료 위치를 정의한 후, 전체 워크플로를 위한 시작 위치에 모든 플레이트를 수동으로 로드합니다. 96-well 형광 스크리닝 플레이트는 호텔 2에, BY-2 세포가 담긴 6-well 플레이트는 호텔 3에, 형질전환에 사용할 96-deep well 플레이트는 플레이트 히터 또는 칠러의 네스트 2에, 그리고 효소 용액이 담긴 50 milliliter 원추형 튜브는 멀티 모드 디스펜서에 로드합니다. 프로토콜 내의 형질전환을 수행하기 위해, 96-deep well 플레이트의 각 웰에 오렌지 형광 단백질 리포터 구조체가 포함된 plasma DNA 10 microliters를 미리 분주하고, 플레이트 히터 또는 칠러에서 4 °C로 배양합니다.

모든 소모품과 플레이트를 자동 액체 핸들링 플랫폼의 지정된 위치에 배치하십시오. 1열의 각 웰에 40% polyethylene glycol 용액 200 µL가 미리 분주된 96-웰 플레이트를 배치하십시오. 8번 네스트에 피펫 팁 박스를 배치하십시오.

자동 액체 핸들링 플랫폼 소프트웨어에서 각 항목의 위치를 정의하려면, 메뉴에서 Tools를 선택하고 Labware Editor를 클릭하십시오. 드롭다운 메뉴에서 실험 기구의 유형을 선택하십시오. Main Protocol 탭을 선택하고 Configure Labware를 클릭하여 각 실험 기구의 위치를 정의하십시오.

Run을 클릭하여 프로토콜에 사용될 모든 장치를 초기화합니다. 마지막으로 Work Explorer 창에서 Add Work Unit을 클릭하여 시스템 내의 모든 실험 기구를 확인하고 자동화 프로토콜을 시작합니다. 이 절차에서 가장 민감한 부분은 원형질체 형질전환 단계입니다.

형질전환은 로봇 시스템에 의해 수행되므로, 자동화 프로토콜을 정확하게 설정하는 것이 매우 중요합니다. 본 영상에서는 자동화 프로토콜의 선택된 단계만 보여줄 것입니다. 형질전환 프로토콜 동안, 자동 액체 핸들링 플랫폼은 6-웰 플레이트에서 프로토플라스트 용액 70 µL를 흡입하여 6번 네스트의 96-딥 웰 플레이트에 분주합니다.

그 다음, 새로운 피펫 팁을 사용하여 미리 충전된 딥웰 플레이트에서 고점도의 폴리에틸렌 글리콜 용액 70 µL를 천천히 흡입하고, 이를 딥웰 플레이트의 해당 웰에 완전히 분주합니다. 이어서, 자동 액체 핸들링 플랫폼이 딥웰 플레이트를 nest six에서 nest nine로 이동시키면, 플레이트 무버가 플레이트를 집어 플레이트 쉐이커 스테이션으로 옮겨 1500 RPM에서 30초 동안 흔들어 줍니다. 원형질체(protoplasts)가 평형을 이룰 수 있도록 20분 동안 흔들지 않고 배양한 후, 플레이트 무버가 96-딥웰 플레이트를 멀티모드 디스펜서로 이동시켜 세척 프로토콜을 실행합니다.

자동화된 원형질체 분리 및 형질전환 프로토콜이 완료되면, 로봇 시스템의 첫 번째 호텔에서 형질전환된 원형질체가 담긴 플레이트를 꺼냅니다. 도립 현미경, 카메라 및 형광 램프의 전원을 켭니다. 원형질체의 초기 초점을 맞추기 위해 10X 대물렌즈를 선택합니다.

할로겐 램프를 켜고 형광 램프의 셔터를 닫습니다. 플레이트를 현미경 시스템에 로드하고 명시야(brightfield)를 사용하여 원형질체에 초점을 맞춥니다. 그다음, 할로겐 전구를 끄고 형광 램프의 셔터를 엽니다.

형질전환된 원형질체에 의해 발현된 오렌지색 형광 단백질을 시각화하기 위해 Cy3/TRITC 필터 세트를 선택하십시오. 각 웰을 스캔하여 형광 마커를 발현하는 원형질체의 수를 결정합니다. 본 프로토콜에 명시된 조건에서 원형질체의 효소 소화를 진행한 결과, 6-웰 플레이트당 2,820,000개의 원형질체가 얻어졌습니다.

프로토콜의 각 전이 단계 후 원형질체 농도의 손실을 평가하였습니다. 소화 프로토콜 이후, 96-deep well 플레이트의 각 웰에 11,500개의 원형질체를 전이하였습니다. 형질전환 프로토콜이 완료된 후, 1,230개의 원형질체를 96-well 형광 스크리닝 플레이트로 전이하였습니다.

여러 단계의 파이펫팅 과정이 프로토플라스트에 손상을 주지 않았는지 확인하기 위해, 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색을 통해 생존율을 분석하였습니다. 분석 결과, 소화 후, 96-웰 형광 스크리닝 플레이트로의 전이 후, 그리고 형질전환 프로토콜 수행 후의 생존율에서 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다. 형질전환 효율은 약 2%로 낮았으나, 오렌지 형광 단백질을 발현하는 형질전환 세포를 생성하는 데 성공하였습니다. 이는 사용된 바이너리 플라스미드의 크기가 컸고, 프로토콜이 BY-2 프로토플라스트에 특이적으로 최적화되지 않았기 때문입니다.

프로토콜의 시간 경과에 따라 얻은 측정 결과, 가장 많은 시간이 소요되는 단계는 소화 단계인 것으로 나타났습니다. 원형질체 분리 및 형질전환의 총 소요 시간은 3시간 50분 53초였으며, 작업자의 외부 개입은 필요하지 않았습니다. 적절하게 설정되면, 이 기술은 로봇에 의해 4시간 이내에 수행될 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 식물 생명공학 분야의 연구자들은 게놈 편집 및 프로모터 스크리닝과 같은 고처리량 작물 게놈 분석 절차를 수행할 수 있는 기반을 마련하게 되었습니다.