Name: 마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색 및 재관류 유도 스트로크에 대한 수술 적 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 학습하세요 마우스 중간 대뇌 동맥 폐색 및 재관류 유도 수술 방법을. Longa 기법을 활용한 뇌졸중 연구 모델로 생존율이 높고 허혈 재현성이 우수하여 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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이 연구는 국립보건원(National Institute of Health), 국립심장폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute, NIH 및 NHLBI; HL125572-01A1)와 LSUHSC-S는 F.N.E. Gavins에 창업 기금을 조성합니다.

비디오에보고 된이 프로토콜과 실험은 LSUHSC-S 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 NIH의 지침을 준수 하였다. 주 : 남자가 C57BL / 6 마우스 25 중량 - 29g이 연구에 사용되었다. 쥐 개별적으로 환기 케이지에서 12 시간 빛 / 어둠 사이클에서 물을 무료로 이용할 수있는 표준 우 펠릿 다이어트를 유지 하였다. 과정은 무균 기법 (예, 멸균 장갑, 멸균 기기)를 사용하여 멸균 조건 하에서 수행한다. 1. 수술 전 준비 <ol><li> 케타민 (150 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 조합을 사용하여 마취를 유도 복강 내 (IP)을 주입. 마취가 달성되면 5 분마다 10 분 - 처음 발 핀치 때마다 (3)에 의해 마취의 깊이를 모니터링합니다. 동물이 마취 동안, 건조를 방지하기 위해 살균 안 연고를 관리. 케타민의 초기 투여 량 / 자일 라진 보통 AB 지속30-40분 아웃. 발 핀치에 대한 동물의 반응에 의해 확인되는, 필요한 경우 추가의 투여 량으로 투여 될 수있다. </li><li> 온도 조절 열 매트에 누운 위치에 마우스를 놓고 직장 프로브를 사용하여 검증 36.5 ± 0.1 ° C,에서 체온을 유지한다. </li><li> 목 면도하고 70 %의 에틸 알코올로 피부를 소독. </li></ol> MCA 2. 폐색 (그림 1) <ol><li> 아이리스 똑바로 위를 이용한 중심선 경부 절개를하고, 혈관이 노출되도록 연조직 (견인기를 사용하여) 후퇴. </li><li> 미주 신경에 손상을주지 않고 뒤몽의 집게를 사용하여 주변 조직에서 CCA와 ECA를 해부하다. </li><li> 6-0 실크를 사용하여 CCA ​​주위에 느슨한 매듭을 묶는에 의해 임시 봉합을합니다. </li><li> ECA 주위에 영구 봉합 단단히 선박합니다 (CCA의 분기점에 말초)을 결찰하여로부터 연장 작은 혈관을합니다. </li><li> 봉합 ARO 확인CCA의 분기점에 ECA의 근위 핀클. </li><li> 내부 경동맥 (ICA)와 pterygopalatine 동맥 (PPA) 주변의 미세 혈관 클립을 배치합니다. </li><li> 봄 가위를 해부 마이크로를 사용하여 ECA에 작은 절개를하고 180 μm의 실리콘 스쳐 모노 필라멘트를 삽입합니다. 필라멘트 쉽게 조작 가능한 영구 봉합에 상처가 근접합니다. </li><li> 삽입 된 필라멘트와 ECA 주위에 임시 봉합을 강화하고 미세 혈관 클립을 제거합니다. </li><li> 영구, 말초 봉합과 봄 가위를 해부 마이크로를 사용하여 필라멘트의 엔트리 포인트 사이의 ECA를 잘라. </li><li> MCA에 -합니다 (CCA의 분기점을 넘어 10 μm의. 약 9) 저항이 느껴질 때까지 ICA를 통해 필라멘트를 안내합니다. 참고 : 필라멘트의 대부분이 여전히 표시되는 동안 너무 많은 저항이 느껴지는 경우는, 필라멘트는 PPA를 입력 할 수 있습니다. 이 경우, 부드럽게 고름, 분기점으로 다시 필라멘트를 당겨전방 ICA 사용 듀 핀셋으로 H이고, 그것이 ICA에서 가시화 될 수있을 때까지, 필라멘트를 전진. </li></ol> 3. 재관류 <ol><li> 30 분 폐색 기간 후에 다시 부드럽게 당겨 듀 핀셋을 사용하여, 필라멘트를 분리하고 ECA의 개방 단부 주위에 봉합 고정. </li><li> 조심스럽게 CCA를 통해 재개 뒤몽 포셉과 혈액 흐름을 사용하여 합자를 풀어 CCA 주위에 임시 봉합을 제거합니다. </li><li> 연속 수술 봉합과 절개를 닫습니다. 피부의 폐쇄 중 연속적 또는 중단 봉합에 의해 달성 될 수있다. 스킨 스테이플은 허용 방법입니다. </li><li> 볼륨 보충으로하고 진통제 카프로 펜과 염분 피하의 1 ml의 쥐를 주입 (5 밀리그램 / kg, 사우스 캐롤라이나) 수술, 추가로 통증이 다시 웅크 리고 앉게 등이 필요하다 표시 간판, ungroomed 코트에서 통증과 불편 완화를 위해, 감소 활동, 이상자세, 식욕 감소했다. </li><li> 온도 컨트롤러를 사용 규제 열 램프를 사용하여 가열 된 30 ° C를 케이지에 마취에서 회복에 걸쳐 쥐를 관찰하고 식습관을 장려하기 위해 새장 바닥에 페트리 접시에 으깬 우를 배치합니다. 마우스는 재관류 기간 동안 케이지에 하나씩 보관됩니다. </li></ol> 4. 위장 수술 <ol><li> 모노 필라멘트의 삽입없이 동일한 방법에 따라 마우스. </li></ol> 5. 수술 후 신경 학적 점수 (표 1, 그림 2) <ol><li> 일반 신경 학적 평가를 18 점의 점수 시스템을 사용하여 적절한 재관류 기간 후에 마우스를 평가; 모터; 감각; 감수. 높은 신경 학적 점수는 신경 기능 저하에 대응한다. 참고 : 걸을 응답과없는 판단 마우스는 안락사됩니다. 인간 안락사 다른 기준보다 큰 20 %의 중량 손실을 포함 호흡 디수술 주변 스트레스, 감염. 공동이 챔버를 경추 탈구 또는 개흉술 것 죽음을 확인 안락사 물리적 방법에 사용된다. </li></ol> 측정 뇌 경색 볼륨 6. (그림 3) <ol><li> 마취가 달성되면, 5 분 및 10 분마다 - 케타민 (150 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 밀리그램 / kg) 초기 발 핀치마다 (3)에 의해 마취 IP 모니터 깊이 주입의 조합을 사용하여 마취를 유도한다. </li><li> 부정사 위치에 마우스를 놓고 조리개를 바로 가위를 사용하여 복막 뒤에 목에 복부의 피부를 잘라. </li><li> 뒤몽의 집게를 사용하여 흉골을 들어 올려 가슴을 노출 갈비뼈를 잘라. </li><li> 심장을 노출 좌측 및 지혈 두 쌍을 이용하여 상자의 오른쪽을 연다. </li><li> 좌심실에 5 ML의 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 삽입하고 우심방를 잘라. 실온 생리 식염수 또는 포스으로 관류TE 완충 식염수 (PBS) 유체가 클리어 될 때까지 (일반적으로 3-5 분). </li><li> 아이리스에게 바로 위 및 뒤몽의 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌에서 두개골을 제거합니다. </li><li> 후각 전구 및 뇌 행렬에 맞도록 면도날을 사용하여 소뇌를 잘라. 심지어 세그먼트로 뇌를 슬라이스이 행렬을 사용합니다. 멋진 조직을 유지하기 위해 사용하기 전에 행렬을 진정. 매트릭스로 뇌를 놓고 얼음에 설정합니다. </li><li> 두 개의 면도날을 사용하여 2mm 관상 세그먼트로 뇌를 슬라이스. 위로부터 2mm 시작 면도날을 사용하여 상기 제 절단하고 대신이 면도날을 떠난다. 제 뒤에 잘라 다른 2mm를 확인합니다. 부착 된 조직과 첫 번째 면도날을 제거합니다. 모든 조직이 분리 될 때까지이 과정을 반복합니다. 참고 : 4가 있어야합니다 - 완료되면 5 세그먼트. </li><li> 다음 얕은 물 목욕 (A)에 배치되어 2 % 2,3,5- triphenyltetrazalium 클로라이드 (TTC)를 포함하는 24 웰 플레이트에 세그먼트를 배치20 분 동안 t 37 ° C를. 개별 웰에 각각의 세그먼트를 배치하는 것은 그들이 절단 된 순서에 유지하도록 돕는다. TTC의 솔루션은 완전히 조직 세그먼트를 커버 있는지 확인합니다. 10 분 모든 조각을 넘겨 후. </li><li> 새로운 24- 웰 플레이트의 웰에 10 % 포르말린 소량을 배치하고 절단 된 순서로이 플레이트 세그먼트를 전송. </li><li> (1.57 NIH 이미지 소프트웨어) 6 컴퓨터로 세그먼트를 스캔 ImageJ에 분석 소프트웨어를 이용하여 전체 뇌 조각 (6)의 비율로 경색 크기 분석. <ol><li> 면적 측정을 생성하기 위해 경색 영역을 설명합니다. 다음 지역을 결정하기 위해 전체 반대쪽 반구를 측정한다. 반대쪽 반구의 경색 면적의 영역을 분할하고, 경색 량을 결정하기 위해 100을 곱한다. </li></ol></li></ol>

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전에 20 년의 개념 때문에, 필라멘트의 삽입을 포함하는 인간의 뇌졸중에 대한 MCAO 모델은 연구의 거대한 숫자에 사용되어왔다. 이는 그 스트로크 (즉, 뇌졸중)의 가장 일반적인 형태로 임상 적으로 일어나는 모방한다는 사실에 주로있다. 선조체는 대뇌 피질의 허혈보다 더 민감하고, 같은 허혈성 시간의 길이는 선조체 및 배면 측면 피질 모두 영향하거나 선조체할지 여부로 번역된다. 두 경색 재관류 시간은 적절히 변경 될 수 있으며, 이는 본 연구자에게 더 큰 경색에 일과성 뇌허혈증 (TIAS)과 관련된 병리학 적 효과를 연구 할 수있는 능력을 제공한다. 수년 동안 변형 및 MCAO의 필라멘트에있어서의 문제는 절차의 중요성은 감염 9의 위험을 피하기 위해 무균 조건에서 수행되는 것을 도시하고있다. 결과는 다를 수 있습니다설치류 종 사이에, 스트레인 10, 11, 무게, 마취제 사용 (해부학 적 변화가 나타났다),하지만 여기에 ...

뇌졸중은 한 사람이 질병으로 매 4 분 죽어으로, 전 세계적으로 죽음의 다섯 번째 주요 원인이다. 80 만 이상의 미국인은 환자에 대한 파괴되지 않는 행정 매년, 고통뿐만 아니라 그 가족. 스트로크 성인 장애의 주요 원인이며, 세출이 가능한 것으로 매우 적은 치료법에도 불구 $ 36.5 억의 순서로 추정된다. 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)의 유일한 식품의 약국 (FDA)은 허혈성 뇌졸중에 대한 약물을 허가합니다. 뇌졸중의 발병에서 3~6시간 이내에 환자에게 투여하고, 이러한 경우에 환자 (2)의 4 % 혜택 그러나에만 효과적이다. 따라서, 선 재현성, 임상 적으로 중요한 동물 모델이 질환에 대한 잠재적 인 치료 전략 및 치료의 개발에 도움을 사용하는 것이 필수적이다. 체외에서 점에 유의하는 것이 중요하다 </EM&gt; 모델은 뇌 기능 장애의 특정 측면을 모델링에 유용한 반면, 뇌졸중 다음 뇌와 주변에서 발생하는 복잡한 생리 학적 상호 작용을 recapitulating 할 수 없습니다. 따라서, 생체 내 모델은 필수적이다. 뇌졸중의 가장 흔한 유형은 전체 뇌졸중의 87 %를 차지 기원 허혈성입니다. 다른 스트로크 뇌출혈 (9 %) 및 지주막 하 출혈 (4 %)이며, 중간 대뇌 동맥 (MCA)에 색전에 의해 가장 자주 발생한다. 이 파괴 될 수있는 뇌를 입력 층류 혈액의 흐름을 발생 MCA의 루트에있는 눈에 띄는 곡선 때문이다. MCA는 가로 세로 홈을 따라 내 경동맥 (ICA) 및 경로에서 발생하는 곳 분기 프로젝트 기저핵 및 전두엽, 정수리 일차 운동 및 감각 피질 포함 측두엽의 측면. 윌리스의 원이되는 후부 대뇌 동맥에 의해 생성된다대뇌 동맥과 후부 통신 동맥에 연결. MCAO의 관내 필라멘트 또는 봉합 모델은 가장 널리 스트로크 연구에서 사용 중 하나입니다. 그러나,이 모델의 다른 변형 몇 있으며, 이들은 미사 외부 경동맥에 삽입되는지 여부에 기반 3 (ECA를 상기 롱가 방법 지칭), 또는 그것은 (ICA에 삽입되어 있는지 고이즈미 지칭 방법) 4. 필라멘트는 CCA의 절개 출혈 방지하기 위해 제거되는 경우 롱가의 방법에서 영구적 5 연결되어야 ECA 인 반면 고이즈미 방법에있어서, 상기 수술 측의 경동맥 (CCA)을 영구적으로 연결되어야 . 우리는이 훨씬 우수하고 허혈성 뇌졸중의보다 임상 적으로 수술 모델 느낌으로 여기 론가 방법이 사용됩니다. 또한, 특히 롱가 법으로 규소로 만들어진 필라멘트의 사용은 매우 생산종종 불완전 흡장 및 / 또는 지주막 하 출혈 (6)을 생성 화염 무딘 모노 필라멘트, 반대로 재현 MCAO. 관내 필라멘트 방법은 영구적 또는 일시적인 흡장 4,6의 모델로서 사용될 수있다. 과도 모델을 수행하기 위해 필라멘트는 허혈 기간 후에 제거된다 (예를 들어, 30 분, 60 분, 2 시간), 재관류가 일어날 수있다. 이 모델은, 어느 정도는 인간에서 혈전 혈전을 용해시키기 위해 자연 또는 치료 개입 (예를 들어, tPA의 투여) 후 혈류의 복원을 시뮬레이션한다. 영구 모델 필라멘트 단순히 일정 기간 (예를 들면, 24 시간) 장소에 남아 있으므로 더 재관류가 발생하지 않는다. 관내 필라멘트 방법의 다른 장점은 개두술 두개골이 그대로 유지 될 수 있도록 두개 내 압력 및 온도의 변경을 방지하여, 수행되어야 할 필요가 없다는 점이다. <p c이 비디오에서 아가씨 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 우리는 MCAO 및 재관류를 유도 할 수있는 론가 관내 필라멘트 방법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 18 포인트 신경 학적 점수를 수행하고 2,3,5- triphenyltetrazalium 클로라이드 (TTC) 염색을 사용하여 경색 볼륨을 결정하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>수컷 C57BL/6 마우스</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME#</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>Morris & Dickson, Shreveport, LA</td><td>67457-108-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn, Inc, Lake Forest, IL</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>DC 온도 제어 시스템</td><td>FHC, Bowdoin, ME</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>미니 직장 서미스터 프로브</td><td>FHC, Bowdoin, ME</td><td>40-80-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>FHC, Bowdoin, ME</td><td>40-90-2-06</td><td></td></tr><tr><td>클리퍼</td><td>아마존, Bellevue, WA</td> <td># 64800</td><td></td></tr><tr><td>70 % 에탄올</td><td>전세계 의료 제품, Bristol, PA</td> <td># 51011023</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors (straight)</td> <td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게 (45도, 구부러진 팁)</td> <td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 용기 클립</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>18055-05</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 스프링 가위(스트레이트)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>견인기(무딘)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>18200-11 (Helen used 17022-13)</td><td></td></tr><tr><td>면 팁 애플리케이터</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지</td><td>Covidien, Mansfield, MA</td> <td># 9023</td><td></td></tr><tr><td>7-0 실크 꼰 수술 봉합</td>사 <td>Braintree Scientific, Braintree, MA</td><td>SUT-S103</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % 염화나트륨</td><td>Morris & Dickson, Lake Forest, IL</td><td>0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>6-0 중간 MCAO 봉합사(실리콘 고무 코팅 모노필라멘트)</td><td>Doccol Corporation, Sharon, MA</td><td>6023PKRe</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk 6-0 실리콘 코팅 꼰 실크</td><td>Covidien, Mansfield, MA</td><td>SUT-14-1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer, New York, NY</td><td>NADA# 141-199</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Dechra, Norwich, UK</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Physitemp 온도 컨트롤러</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>TCAT-2AC</td><td></td></tr><tr><td>열 램프</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>HL-1</td><td></td></tr><tr><td>레이저 도플러 프로브</td><td>AD Instruments, Colorado Springs, CO</td><td>MSP100XP</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA#</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>단일 가장자리 면도날</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-트리페닐테트라잘륨 클로라이드(TTC)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8877-50G</td><td></td></tr><tr><td>마우스 뇌 매트릭스 슬라이서</td><td>Braintree Scientific, Braintree, MA</td><td>BS-A 5000C</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>#182</td><td></td></tr><tr><td>10% 포르말린</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 분석 소프트웨어</td><td>NIH, Bethesda, MD</td><td>무료 다운로드</td><td></td></tr><tr><td>견인</td>기 <td>의료 기기 구매, 뉴캐슬, CA</td><td>MP-740</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색 및 재관류 유도 스트로크에 대한 수술 적 접근

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

스트로크 전세계 주요 사망 원인이며, 장기 성인 장애의 주요 원인 중 하나가되고 있습니다. 뇌졸중의 약 87 %는 원점에서 허혈성하고 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 영역에서 발생한다. 현재 전용 식품 의약품 안전청 (FDA)은이 치명적인 질환을 치료하기위한 약물을 승인 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)이다. 그러나 만톤 관리를위한 작은 치료 창이 있습니다 (3-6 시간)을, 실제로 그것을받을 환자의 4 % 만 효과가있다. 현재의 연구는 잠재적 인 치료 표적을 발견하기 위해 스트로크 기전을 이해하는데에 초점을 맞춘다. 따라서, 안정적인 모델은 매우 중요하고, MCA 폐색 (MCAO) 모델은 허혈성 뇌졸중의 가장 임상 적 수술 모델로 간주된다 (도 관내 필라멘트 또는 봉합사 모델 지칭) 및 비교적 비 침습적 쉽게 재현 할 수있다. 일반적 MCAO 모델 때문에 특히 생쥐와 설치류 사용이 종에 사용할 수있는 모든 유전 적 변화에. 여기에서 우리는 기술 (비디오에 존재하는) 성공적으로 신뢰성과 재현성 데이터를 생성하는 쥐 (재관류 포함) MCAO 모델을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

마우스는 재관류의 기간 다음에 30 분 MCAO에 의한 뇌 허혈 (그림 1) 시행 (24 시간 및 1 주당 여기에 제시,하지만 재관류의 길이는 변화 될 수있다). MCAO 동안 사망률 (약 2 %)을 최소화했다. 포스트 허혈 (제 24 시간 이내) 사망률은 약 26 %였다. 레이저 도플러 flowmetry는 전 MCAO / 재관류 후 MCA 영토에 혈액의 흐름 관류를 확인하기 위해 사용되었다. (4) 임시 CCA 넥타이는 필라멘트 제거 및 발생하는 재관류에 대한 국소 빈혈의 30 분 이후에 출시 될 때, 서지가 있음을 분명히 보여줍니다 그림 &lt;기준 관류 (즉, 이전 수술) 재관류에 5 분의 100 %에 도달 관류,있다. <p class="jo...

뇌졸중의 병태 생리를 이해하기 위해, 신뢰할 수있는 모델을 사용하는 것이 중요하다. 마우스에서 가장 자주 사용되는 뇌졸중 모델 중 하나를 설명한다 본 논문의 중간대 뇌동맥 폐색 (MCAO) 모델이라 재관류 (또한 관내 또는 필라멘트 봉합사 모델 지칭).

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Longa 방법의 전반적인 목표는 중간 뇌동맥(middle cerebral artery, MCA)의 뿌리 부분에 허혈을 재현하는 것이며, 이는 인간의 허혈성 뇌졸중이 주로 MCA 폐색으로 인해 발생하기 때문입니다. 이 방법은 이 질환의 치료를 위한 적절한 치료 표적을 찾는 방법과 같이 뇌졸중 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 다른 대체 기술과 비교했을 때 Longa 방법의 주요 장점은 생존율입니다.또한 이 기술을 사용하면 백혈구-내피 세포 상호작용과 경색 부피가 증가합니다. 이 과정은 제 실험실의 매니저인 Shantel Vital이 시연할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 수컷 C57 black six 마우스에 마취를 유도한 후, 발가락 꼬집기로 마취 깊이를 모니터링하고 안구 건조를 방지하기 위해 멸균 안연고를 도포하십시오.그 후, 동물의 목 부위를 제모합니다. 마우스를 온도 조절 매트 위에 앙와위로 눕히고, 직장 프로브를 삽입하여 체온을 36.5 ± 0.1 °C로 모니터링 및 유지합니다. 그런 다음, 70% ethyl alcohol을 사용하여 피부를 소독합니다.다음으로 Iris 직선 가위를 사용하여 정중선 절개를 하고 연조직을 견인하여 혈관을 노출시킵니다. Dumont 포셉을 사용하여 미주신경이 손상되지 않도록 주변 조직으로부터 총경동맥(CCA)과 외경동맥(ECA)을 박리합니다. 7-0 silk를 사용하여 CCA 주위에 느슨한 매듭을 지어 임시 봉합사를 만듭니다.그 다음, 외경동맥(ECA)과 여기서 뻗어 나오는 더 작은 혈관들을 단단히 결찰하여 영구 봉합합니다. 이제 총경동맥(CCA) 분지점의 근위부에서 ECA 주위를 봉합합니다. 그런 다음 내경동맥(ICA)과 익구개동맥(PPA) 주위에 미세혈관 클립을 배치합니다.미세 해부용 스프링 가위를 사용하여 영구 봉합사와 최대한 가까운 ECA 부위에 작은 절개를 넣고 180 µm 실리콘 팁 단섬유(monofilament)를 삽입합니다. 필라멘트가 삽입된 상태에서 ECA 주변의 임시 봉합사를 조이고 미세 혈관 클립을 제거합니다. 미세 해부용 스프링 가위를 사용하여 영구 원위부 봉합사와 필라멘트 삽입 지점 사이의 ECA를 절단합니다.필라멘트를 ICA를 통해 MCA에서 저항이 느껴질 때까지 삽입합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 30분간의 폐쇄 기간 후, Dumont 포셉을 사용하여 필라멘트를 조심스럽게 뒤로 당겨 제거하고, ECA의 열린 끝부분을 봉합사로 고정합니다.결찰선을 조심스럽게 풀어 CCA의 혈류가 다시 재개될 수 있도록 하여 CCA 주변의 임시 봉합사를 제거합니다. 리트랙터를 제거한 후, 연속 봉합법을 사용하여 절개 부위를 폐쇄합니다. 체액 보충을 위해 생리식염수 1 mL를 마우스의 피하에 주입하고, 수술 절차로 인한 통증과 불편함을 완화하기 위해 진통제인 carprofen을 투여합니다.30 °C로 가열된 전용 케이지에서 마우스가 마취로부터 회복되는 과정을 관찰하고, 섭식을 유도하기 위해 케이지 바닥의 페트리 접시에 으깬 사료를 놓아둡니다. 적절한 재관류 기간 후에 18점 척도 점수 체계를 사용하여 마우스의 신경학적 상태를 평가하며, 이때 일반, 운동, 감각 및 고유 수용성 감각 점수를 측정합니다. 신경학적 점수가 높을수록 신경 기능이 저하되었음을 의미합니다.뇌경색 부피를 측정하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 마취를 유도하고 마취 깊이를 모니터링한 후, 마우스를仰臥位(supine position)로 놓고 Iris straight scissors를 사용하여 복부에서 목까지 피부를 절개한 다음 복막을 절개합니다. Dumont forceps를 사용하여 흉골을 들어 올리고 갈비뼈를 절단합니다. 그 후, 두 개의 지혈 집게(hemostat)를 사용하여 흉곽의 좌우 측면을 열어 심장을 노출시킵니다.5mL 시린지에 연결된 26게이지 바늘을 좌심실에 삽입하고 우심방을 절개합니다. 그런 다음 실온의 생리식염수 또는 PBS로 액체가 투명해질 때까지 심장을 관류합니다. Iris 직선 가위와 핀셋을 사용하여 동물의 머리를 제거하고 두개골에서 뇌를 조심스럽게 적출합니다.그 다음, 뇌가 매트릭스에 들어갈 수 있도록 면도날을 사용하여 후각구와 소뇌를 잘라냅니다. 매트릭스를 냉각시킨 후, 뇌를 내부에 넣고 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 면도날로 뇌의 상단에서 2 mm 떨어진 지점에 첫 번째 절개를 하고 날을 그대로 둡니다.두 번째 면도날을 사용하여 첫 번째 절개 부위 뒤쪽에 2 mm 간격으로 다시 절개합니다. 그런 다음 조직이 붙어 있는 첫 번째 면도날을 제거합니다. 모든 조직이 슬라이스될 때까지 이 과정을 반복합니다.절단한 순서대로 각 분절을 2% triphenyltetrazolium chloride(TTC)가 담긴 24-웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 37 °C의 얕은 수조에서 20분 동안 둡니다. 10분간 배양한 후, 절편들을 뒤집어 줍니다. 그다음, 새로운 24-웰 플레이트의 웰에 10% formalin을 소량씩 넣고, 절단한 순서대로 분절들을 formalin이 담긴 웰로 옮깁니다.세그먼트를 컴퓨터로 스캔한 후, ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 경색 부위의 외곽선을 따라 영역 측정값을 생성함으로써 전체 뇌 슬라이스에 대한 경색 크기를 백분율로 분석합니다. 다음으로, 대측 반구 전체를 측정하여 면적을 결정합니다. 마지막으로, 경색 면적을 대측 반구의 면적으로 나누고 100을 곱하여 경색 부피를 산출합니다.여기에서 보는 바와 같이, MCA 재관류 전후의 MCA 영역 내 혈류 관류를 확인하기 위해 레이저 도플러 유량측정법이 사용되었습니다. 필라멘트 제거 및 재관류를 위해 30분간의 허혈 후 일시적으로 묶어두었던 CCA를 풀면, 관류량이 급증하여 재관류 5분 후에는 기저 관류량의 100% 직전까지 도달합니다. 이 표에는 일반, 감각, 운동 및 고유 수용성 결핍 평가와 관련된 신경학적 점수가 나열되어 있습니다.이 그래프는 24시간 후 27마리 생쥐의 점수가 12.56 ± 0.7였으며, 일주일 후에도 11.50 ± 1.5로 높게 유지되었음을 보여줍니다. 신경학적 점수가 높을수록 신경 기능의 저하를 나타냅니다. 경색 부피는 24시간 후의 신경학적 점수와 유사한 양상을 보였습니다.본 실험 결과, MCAo 24시간 후 마우스에서 큰 경색 부피가 관찰되었으며, 이는 뇌졸중 발생 일주일 후에 더욱 증가하였습니다. 숙련될 경우, 이 기술은 적절히 수행한다면 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 수행하는 동안 온도를 36.5 °C로 유지하는 것이 중요합니다.본 절차 이후에 맹장 결찰 및 천공과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다. 이를 통해 뇌졸중 전후의 패혈증 영향과 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 중간 뇌동맥에 모노필라멘트를 삽입하고 이를 제거하여 재관류를 유도함으로써 허혈을 유발하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.Iris 가위나 포셉과 같은 기구를 사용할 때는 위험할 수 있으므로 항상 주의를 기울여야 함을 잊지 마십시오.

surgical-approach-for-middle-cerebral-artery-occlusion-reperfusion

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

중간 대뇌 동맥의 폐색 Filamentous은 생쥐에서 허혈성 뇌졸중 공부를위한 일반적인 모델입니다.

마우스의 모델링 스트로크 - 필라멘트 모델 중간 대뇌 동맥 폐색

우리는 비디오 intraluminal monofilament를 사용하여 성인 마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색을 생산하는 방법을 보여줍니다. 또한 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC) 염색법에 의해 대뇌 경색의 범위를 평가하는 방법을 보여줍니다.

중간 대뇌 동맥 폐색의 마우스 모델

우리는 실리콘으로 코팅된 봉합사를 사용하여 중대뇌동맥의 폐색에 의해 유도된 뇌졸중의 마우스 모델을 설명합니다. 이 프로토콜은 영구적인 폐색 또는 일시적인 허혈을 유도한 후 재관류를 유도하는 데 적용할 수 있습니다.

경색 지역의 중간 동맥 폐색 기술 및 시각화를 사용하여 마우스의 허혈성 뇌졸중 및 허혈 - 재관류 유도

중간 대뇌 동맥의 Intraluminal 필 라 멘 트 폐색 설치류 실험 뇌졸중의 가장 자주 사용 된 vivo에서 모델입니다. 일반적인 경 동맥 복구를 허용 하는 다른 수술 접근 여기, 일반적인 경 동맥의 reperfusion 및 중간 대뇌 동맥 영역 전체 reperfusion 수 있습니다 수행 됩니다.

쥐에 있는 일반적인 경 동맥 수리 통해 Reperfusion를 허용 하는 중간 대뇌 동맥 폐색

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 마우스 모델 선의 이상 조사를 설립 하다. 우리는 distally 오른쪽 중간 대뇌 동맥과 바로 일반적인 경 동맥 선 하 고 국 소 빈 혈의 10 또는 40 분 후 혈액 흐름을 복원.

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 2 배 폐색 마우스 모델

상기 프로토콜은 뇌척수증-허혈성 뇌 조직의 피알 표면에 혈관 측두근 피판의 이식-모야모야 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 혈관신생 증가에 대한 접근법의 효능은 마우스에서 일시적인 중뇌 동맥 폐색 모델을 사용하여 평가됩니다.

마우스에서 중뇌동맥 폐색 유발 뇌졸중 후 뇌근육활막증 치료 모델

이 프로토콜은 중간 크기의 경색과 우수한 생존율을 가진 독특한 마우스 스트로크 모델을 보여줍니다. 이 모델을 통해 전임상 뇌졸중 연구자는 허혈 기간을 연장하고, 노령 마우스를 사용하고, 장기적인 기능적 결과를 평가할 수 있습니다.

늙은 쥐의 뇌졸중 결과를 연구하기 위해 수정된 경두개 중뇌동맥 폐색 모델

이 프로토콜은 중뇌동맥의 내강 내 폐색을 통한 마우스의 일시적인 국소 대뇌 허혈 모델을 설명합니다. 또한 자기 공명 영상 및 행동 테스트를 사용하여 결과 평가의 예를 보여줍니다.

뇌졸중의 일시적인 중뇌동맥 폐색 모델

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

이 프로토콜은 총경동맥을 통한 중뇌동맥 폐색 재관류를 준비하는 과정을 설명합니다.

중뇌동맥 폐색 재관류를 위한 수정된 모델 준비

학습하세요 마우스 중간 대뇌 동맥 폐색 및 재관류 유도 수술 방법을. Longa 기법을 활용한 뇌졸중 연구 모델로 생존율이 높고 허혈 재현성이 우수하여 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색 및 재관류 유도 스트로크에 대한 수술 적 접근

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