Name: 영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 학습하세요 심장 발달 연구를 위한 단일 세분해상도 형광 단백질 세포 이미징 방법. 조직 투명화 기술을 활용하여 배아 및 출생 후 심장의 유전자 기능을 정밀 분석할 수 있습니다.

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과학적 토론을 해주신 M.W. 연구실 회원들에게 감사드립니다. 이 작업은 M.W.에 대한 AHA [13SDG16920099]와 M.W.에 대한 National Heart, Lung, and Blood Institute 보조금[R01HL121700]의 지원을 받았습니다. 이미지는 Albany Medical College의 Imaging Core Facility에서 캡처되었습니다.

모든 동물 실험은 관리에 대한 NIH 가이드에와 실험 동물의 사용에 따라 올 버니 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 수행 하였다. 1. 솔루션의 준비 참고 : Rosa26Cre ERT2 15 R26R - 색종이 (16)는, αMHC-Cre 호텔 (17), 및 Rosa26-mTmG (mTmG)는 20 마우스 라인은 시중에서 구입 한 cTnT를-Cre 호텔 (18)는 알라바마 대학에서 박사 지아오에서 선물했다 Nfatc1-Cre 호텔.. 의학 (19)의 알버트 아인슈타인 대학에서 박사 빈 저우에서 선물했다. 마우스는 양측 개흉술, 잘린 또는 자궁 전위에 의해 사망 ​​검증의 물리적 수단 다음에 적어도 60 초 동안 밀폐 된 챔버 내에서 이산화탄소 흡입에 의해 안락사시켰다. <ol><li> 타목시펜을 준비합니다. 해바라기 씨 OI 10ml에 타목시펜 10 ㎎을 용해엘. -20 ℃로 완전 용해 후, 분액 저장. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 나 2 HPO 4 (1.41960 g), KH 2 PO 4 (0.24496 g), 염화나트륨 (8.0669 g) 및 증류수 1 L에의 KCl (0.20129 g)을 녹이고 7.4로 pH를 조정합니다. </li><li> PBST 준비 : 0.1 % 트윈 20 용액을 PBS에서 PBS 100 ㎖의 트윈 20 100 ㎕를 용해. </li><li> 버퍼를 차단 준비합니다. 0.2 % 트윈 -20을 함유하는 PBST 100 ml의 BSA 3 g을 용해시켜 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 블로킹 용액을 만든다. </li><li> CUBIC-1 (시약 1)을 준비합니다. 25 중량 % 우레아, 25 중량 %의 N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 키스 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민 및 15 중량 %를 혼합 DH 2 O. 트리톤 X-100 </li><li> CUBIC-2 (시약 2)을 준비합니다. 50 중량 % 수 크로즈, 25 중량 % 우레아, 10 중량 %, 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;믹스 - nitrilotriethanol 0.1 % (절 / V) DH (2) O. 트리톤 X-100 </li><li> 무서 제작 A2 준비 : 4 M 우레아, w 10 % / V 글리세롤 및 / 트리톤 V X-10 w 0.1 %DH 2 O. 0 7.7로 pH를 조정합니다. </li><li> 무서 제작 : B4 준비 : 8 M 요소 및 / 트리톤 V X-100w 0.1 % DH 2 O.에서 8.7로 pH를 조정합니다. </li><li> 준비 무서 제작 : 70 : 4 M 우레아, 70 % w / v를 글리세롤과 DH 2 O.에서 / 트리톤 V X-100 w 0.1 % </li></ol> 2. 타목시펜 유도, 배아 분리 및 고정 <ol><li> 타목시펜 유도와 배아 분리 <ol><li> 배아 발달 하루 E7.75 (33)에서 타목시펜의 10 μg의 / g으로 (R26Cre ERT2 수컷 마우스에 의해 연결) 곡선 공급 튜브 승인 프로토콜 (ACUP 13-12007), 위관 여성 R26Cre ERT2 색종이 마우스를 사용. 배아 일 9.5 (E9.5) 또는 E10.5에서, CO 2, 자궁 경부 전위와 여성의 쥐를 안락사. </li><li> 마우스 사망 확인 후, 가위 마우스 복강을 열고 자궁 경적을 해부, (제 1 주 참조) 가위와 핀셋, 다시의 도움으로 자궁 튜브 층을 제거자궁 관 (23, 24)에서 배아를 임대. <ol><li> PBS (산도 7.4)를 포함하는 페트리 접시에 배아를 전송합니다. 해부 현미경, 핀셋의 도움으로 비 배아 층 (융모막, 난황과 양막)를 제거합니다. </li></ol></li><li> 이전에 22을보고 집게와 가위를 사용하여 유전자형의 여성 마우스와 배아의 꼬리 샘플을 수집합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여, 1X PBS 1 ㎖를 함유하는 48 웰 플레이트의 각 웰에 배아를 옮긴다. </li><li> 형광 현미경, 카메라와 거꾸로 현미경을 통해 GFP / RFP / CFP 긍정적 인 배아를 식별합니다. 멀리 껍질 핀셋을 사용하여 심낭과는 GFP / RFP / CFP 필터와 심장의 양쪽에 형광 클론의 수를 결정하는 곡선 핀셋의 도움으로 마음 / 배아를 돌립니다. 어떤 컷은 필요하지 않습니다. </li></ol></li><li> GFP / RFP / CFP 긍정적 인 배아를 식별 한 후, 신속하게 일에 1X PBS로 두 번 (2 분 각각) 배아를 씻어전자 48 실온 (RT)에서 판 쉐이커에 잘 판. 이 여분의 혈액을 제거합니다. </li><li> RT에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 태아 / 배아의 마음을 수정합니다. 고정 시간은 배아 나이와 조직의 크기에 따라 달라집니다. E9.5의 경우 실온에서 2 시간 동안 배아를 수정합니다. 늦은 배아 단계의 배아도 출생 후 심장에 대한 24 시간으로 연장 할 수 있습니다 더 이상 고정 시간을 필요로합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성, 피부, 눈 및 점막과의 접촉을 피하십시오. </li><li> 고정 후, 실온에서 접시 쉐이커에 두 번 48 잘 접시에 1X PBS로 (10 분 각각) 배아 / 마음을 씻는다. 이 배아 / 마음에서 과잉 PFA를 제거합니다. 배아는 또한 전체 마운트 염색 및 조직 청산을 위해 처리됩니다. </li></ol> 3. 전체 마운트 얼룩 참고 : 다음과 같이 PFA 고정 후 배아 / 마음은 전체 마운트 염색을 실시한다. <ol><li> 1m를 사용하여 48 잘 플레이트에서 배아 / 마음을 Permeabilize 하시려면실온에서 플레이트 통에 2 시간 동안 0.1 % PBST의 리터. </li><li> permeabilization 후, 4 ºC에서 접시 통에 2 시간 또는 밤새 차단 버퍼 1 ml의 배아 / 마음을 몰입. </li><li> 4 ºC에서 판 통에 48 시간 동안 버퍼를 차단 0.3 ml의 : (100 1) 희석 내피 세포 특이 적 항체 PECAM (CD31)에 배아 / 마음을 담가. </li><li> 판 통에 실온에서 PBST 5 회, 30 분 각각을 사용하여 배아 / 마음을 씻으십시오. 이 조직에서 과량의 비 특이 결합 된 차 항체를 제거합니다. </li><li> 4 ºC에서 판 통에 48 시간 동안 버퍼를 차단 1 ㎖에 (1000 1) 희석 알렉사 플 루어 647 염소 항 - 쥐 이차 항체에 배아 / 마음을 담가. </li><li> 단계를 반복 3.4 이차 항체를 씻어. </li><li> 판 통에 실온에서 1 시간 동안 4 % PFA와 배아 / 마음을 포스트 - 수정하고 PBS 5 분마다 두 번 씻는다. </li><li> 승낙에 PBST에 희석 핵 얼룩 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (와 배아 / 마음을 얼룩실온에서 플레이트 통에 10 분 동안 0.01 ㎎ / ㎖)의 배급. 5 분 각각 두 PBS 세척에 따릅니다. </li></ol> 4. 배아 / 무서 리터 e 또는 CUBIC 방법 심장 지우기 참고 : 전체 마운트 염색 한 후, 배아 / 마음이 무서 제작 또는 CUBIC 조직 청소 방법 중 하나를 실시한다. 방법의 선택은 티슈 크기 및 배아 나이에 따라 달라진다. E11.5 이전 연령의 배아를 사용 무서 리터 전자 조직 청소 방법에 대해서는 이전의 배아 또는 출생 후의 마음의 CUBIC 조직 청소 방법이 선호된다. <ol><li> 규모의 조직 지우기 방법 <ol><li> 부드러운 가끔 4 ℃에서 48 시간 동안 (손으로) 진탕 (알루미늄 호일에 싸서) 섬광 유리 병에 무서 리터 전자 A2 용액 1 ml의 배아 / 마음을 품어. </li><li> 무서 리터 전자의 A2 배양 한 후, 가끔 부드러운 anot 진탕와 같은 병에 4 ° C에서 무서 리터 전자 B4 용액 1 mL로 배아 / 마음을 품어그녀의 48 시간. </li><li> 가끔 부드러운 흔들림 4 ° C에서 1 ml의 무서 리터 전자 (70)와 또 다른 48 시간 동안 배아 / 마음을 품어. 90 % 글리세롤을 사용하여 마운트 배아 (5.1 절 참조). </li></ol></li><li> CUBIC 조직 지우기 방법 <ol><li> 전체 배아 / 마음 CUBIC 지우기를 들어, 부드러운 가끔 37 ºC 7에서 48 시간 동안 진탕 CUBIC-1의 1 ml의 각 배아 / 마음을 몰입. 48 시간 후, 신선한 CUBIC 시약 (1)의 동일한 양을 가진 용액을 교체하고 가끔 손으로 진탕하면서 37 ℃에서 추가로 48 시간 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 부드러운 손으로 흔들어 실온에서 1X PBS 여러 번 함께 CUBIC-1 처리 심장 / 배아를 씻으십시오. 이것은 과잉 CUBIC-1 솔루션을 제거합니다. </li><li> PBS로 CUBIC-1을 세척 한 후, 가끔 부드러운 손으로 흔들어 37 ºC에서 48 시간 동안 CUBIC-2 용액 (배아 / 심장 당 1g)에 배아 / 마음을 몰입. 이 글리세롤을 이용하여 장착 배아 / 마음을 다음 (섹션 5 참조0.2). </li></ol></li></ol> 5. 샘플 장착 및 이미지 참고 무서 리터 예 70 CUBIC-2 용액의 클리어 배아 또는 기관 각각 촬상 매체로서 스케일 70 CUBIC-2 용액으로 직접 영상화 할 수있다. 샘플 아래의 프로토콜 다음 90 % 글리세롤의 샘플을 저장하는 즉시 촬상하지만, 장기간 저장되지 않은 경우에는 클리어 시약 배아 샘플의 취약성을 고려하여. <ol><li> 직접 무서 르 이미징 때까지 4 ℃에서 90 % 글리세롤 및 저장 1 ml의 샘플을 삭제 몰입. </li><li> 회 1X PBS로 5 분간 각각 입방 처리 된 샘플을 세척하고, 30 분 동안 연속적으로 30 %, 50 %, 70 %, 90 % 글리세롤 용액을 각각 1ml의 시료를 배양한다. </li><li> 이미징을위한 두 개의 광자 기능을 구비 한 공 초점 현미경으로 90 % 글리세롤 및 화상 클론 최소량 유리 바닥 페트리 접시에 시료를 옮긴다. </li><li> 이미지 심장이나 배 10 배 / 0.3 NA와 글리세롤에서, 25X / 0.8 NA 침지, 또는 40X / 1.2 NA 물 교정 대물 렌즈. 이미지 DAPI는 일관된 티타늄에서 2 광자 여기를 사용하여 : 사파이어 카멜레온 레이저를. 현미경 대물 렌즈의 선택 초해 예 : 실험의 목적에 의존한다, 광 시트 형광 현미경이 이용 될 수있다. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

배아 분리는 매우 중요한 단계입니다. E9.5의 배아 때문에 각별한주의가 분리 동안 배아 / 심장 구조 손상되지 않도록주의해야한다, 크기가 매우 깨지기 쉬운 작은 있습니다. 전체 배아를 이미징 할 때 배아 / 마음을 포위 비 배아 여분의 층은 신중하게, 특히 제거해야합니다. 이 배아 조직 내부에 깊은 항체 및 청산 혼합물의 침투를 허용하고, 또한 이미징 때 배경 신호를 제거하는 데 도움이됩니다. PECAM에 대한 항체, 아세틸 화 α-튜 불린과 인테그린 β1 등 다양한 항체를 검사하고, 모든 성공적으로 33 (데이터는 도시하지 않음) 검출되었다. 이 분자의 무결성은 무결성 세포 항원 호환성이 소거 과정에서 교란되지 않았 음을 보여준다. 넓은 입 전송 피펫 (팁을 절단)를 사용하여 배아 / 마음을 전송합니다. 이 취급 중에 손상을 방지 할 수 있습니다. GFP / YFP / RFP / CFP 발현 패턴 및 n-클론의 암갈색 신중하게 한 마음에 따라 복제하거나...

심장 형태 형성은 심장의 별개 섹터로 심장 전구 세포의 네 가지 유형의 시공간 구성을 필요로하는 일련의 이벤트이며, 또한 기능성 심장 1,2-을 형성하는이 과정을 조율하기 위해 여러 유전자 조절 네트워크를 필요로한다. 심장 사양, 차별화, 패턴, 챔버의 성숙은 심장 성 전사 인자 (3)에 의해 조절된다. 유전자 돌연변이 또는 심장 전구 세포에서 이러한 요인의 전사 후 수차는 배아 치사 또는 선천성 심장 결함 (CHD) 4 중 발생할 수 있습니다. 심장 형태 형성의 연구는 심장 형태 형성에 대한 이해를 촉진 심장 개발하는 동안 추적을 세 가지 차원 (3D) 고유의 세부 구조 및 단일 레이블 심장 전구 세포 계보의 이해를 필요로한다. 고해상도 부 기초 단층 다수의 방법 일 개발되어왔다이미지 기관 구조 5,6에 수십 년 과거 전자; 그러나, 이러한 방법은 고가의 특화된 장비 광범위한 노동력을 필요로하고, 최종 부피 화상 7,8 재구성 단일 셀 해상도의 상세한 구성 조직이 부족하다. 단일 세포 수준에서 3D 용적 촬상 생체 7 전구 세포 분화 및 세포의 거동을 연구하기위한 수단을 제공한다. 그러나 조직 광 산란 깊은 그대로 마음 안에 3D로 세포 구조를 이미징에 주요 장애물이 남아있다. 조직 투명성 8 증가 가능성 접근법 지질 광산란의 주요 원인, 지질 및 / 또는 지질 및 그 주변 영역 사이의 굴절률 차의 조정 제거되어있다. 지난 몇 년 동안, 조직 청산 방법의 수는 조직의 불투명도 및 빛의 산란을 줄일 수있는 개발되었다 BABB (벤질 알코올, 벤질 benzoat 등전자 혼합물)과 DBE (테트라 히드로 푸란 dibenzylether); 그러나이 방법에서, 형광 소광 문제 8-10 남아있다. 용매, 예를 SeeDB (과당 / 티오 글리세롤) 및 3DISCO (디클로로 메탄 / dibenzylether)와 같은 친수성 방법을 기반으로 형광 신호를 보존하지만, 7,8,11 투명 전체 기관을 렌더링하지 않습니다. 이에 비해 선명도 조직 소거 방법은 장기 투명 렌더링, 또한 하이드로 겔 7,13 매립 필요 PACT (수동 명확성 기법)처럼 그 지질 8,12을 제거 전문 전기 영동 장치를 필요로한다. 사용 가능한 모든 조직 삭제 방법에 대한 자세한 내용 등 리처드슨과 Lichtman, 표 1을 참조하십시오. 7. 2011 년, 하마는 등. serendipitously 친수성 혼합물 &#39;무서 르를&#39;발견 (우레아, 글리세롤 및 트리톤 X-100 혼합물) 마우스 뇌와 배아 transpar를 렌더링하는천만에 완전히 표시 클론 (14)로부터 형광 신호를 보존하면서. 이는 세포 내 해상도 밀리미터 및 신경 집단과 돌기의 대규모 개조의 깊이에서 뇌 손상의 이미징을 허용한다. 사키 등. 또한 아미노 알코올을 첨가하여 제작 무서에게 개선 및 인지질 용해를 증가 &#39;CUBIC&#39;(일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 조직 청소 방법, 감소 청소 시간을 개발하고, 여러 가지 빛깔의 형광 이미징 8 허용했다. 본 연구에서는 cardiogenesis 동안 심장 내부의 무서 제작의 장점과 CUBIC 조직 청소 기술과 고해상도 3D 광학 절편, 각각의 클론을 복용 Rosa26Cre ERT2 15 R26R - 색종이 (16), αMHC-Cre 호텔 17, cTnT를-Cre 호텔을 사용하여 추적했다 18 일 </strong&gt; Nfatc1-Cre 호텔 (19), 및 Rosa26-mTmG (mTmG) 20 마우스 라인. 전체 마운트 염색 (WMS) 방법의 조합은 이전에 (21, 22)를 더 표시 클론의 다른 단백질의 염색과 3 차원 체적 맥락에서 자신의 행동의 연구에 허용 조직 청산 방법과를 개발했다. 조직 및 정화 WMS의 조합은 심장 개발시 다른 유전자와 단백질의 역할을 이해하고, 선천성 심장 결함의 원인을 허용한다. 이 프로토콜 개발시 다른 전구 세포의 분화, 세포의 행동 및 장기 형태 발생 이벤트 연구에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>2,2&프라임;,2&프라임; '-니트릴로트리에탄올&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr>PBS <td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td>BSA Fischer Scientific<td>의 4% 파라포름알데히드</td></tr><tr><td></td><td>;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충액 식염</td>수 <td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마 알드리치</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>알드리</td>치 <td>84097</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>타목시펜</td><td>시그마 알드리치</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>해바라기씨 오일</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마 알드리치</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD 파밍겐&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 핵 염색</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC 인큐베이터</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, 소형 미생물 인큐베이터</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 컨포칼 현미경</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 유리 구슬 살균기</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>광원</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>쌍 파인 사이언스 도구</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPP 테크노 플라스틱 제품 AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>록커 II&nbsp; 플랫폼 로커</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>신틸레이팅 튜브</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

전체 심장 수준에서 단일 클론 추적 및 분석 심장 개발하는 동안 심장 전구 세포의 행동과 분화를 결정하고, 정상 및 비정상 심장 형태 형성의 세포 및 분자 기초 연구를 허용 할 수 있습니다. 회고전 단일 클론 분석 최근 새로운 기술은 단일 세포 해상도에서 심장 형태 형성의 연구가 가능합니다. 그러나 조직의 불투명도 및 이미징 깊이와 마음의 빛 산란은 단일 셀 해상도을 방해 전체 심장 이미징 증가한다. 이러한 장애, 개발해야 조명 및 검출 모두 매우 투명 마음을 렌더링 할 수있는 전체 배아 청산 시스템을 극복하기 위해. 다행히 지난 몇 년 동안, 같은 CLARITY으로 전체 유기체의 청산 시스템, 무서 제작, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB 및 PACT위한 많은 방법들이보고되었다. 이 연구소는 카드의 세포 및 분자 메커니즘에 관심IAC의 형태 형성. 최근에, 우리는 ROSA26-Cre 호텔 ERT2를 통해 추적 단일 세포 계보를 설립, 드문 드문 라벨 세포에 ROSA26 - 색종이 시스템을 심장 개발하는 동안. 우리는 마음 안에 이미지 단일 클론에 전체 마운트 얼룩과 함께 배아을 취소 무서 제작 및 CUBIC (일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 등 여러 전체 배아 삭제 방법을 적용. 심장은 성공적 단세포 해상도로 촬상 하였다. 우리는 CUBIC 출생 후의 마음을 지울 수 있습니다 동안 무서 르가, 배아 심장을 취소 할 수 있지만, 효과적으로 출생 마음을 지울 수 없습니다 것을 발견하지만, 손상 조직을 용해하여 배아 마음입니다. 여기에 설명 된 방법은 차례로, 선천성 심장병의 세포 및 분자 기초를 밝힐 수 심장 형태 형성 중에 단일 클론 해상도 유전자 기능 연구를 허용한다.

지워진 배아 심장 이미징 척추 심장 형성은 시공간 규제 형태 형성 과정과 네 개의 다른 소스 (1)로부터의 조직 및 전구 세포의 분화에 따라 달라진다. 심장 초승달 제 심장 분야에서 세포 선형 심장 튜브를 형성하기 위해 복부 정중선을 향해 접어 것이다. 처음에 첫 번째 심장 필드에 dorsomedially 거주하는 두 번째 심장 필드에서 세포는, 이후 그들은 선형 심장 튜브의 기존 발판으로 마이그레이션 곳에서, 인두 및 내장의 중배엽으로 이동시키다. 두 번째 심장 필드의 세포는 우심실, 유출 관 (OFT) 심근에 어떤 내막 25-28에 기여할 것입니다. 심장 신경 능선 세포 (CNCC) postotic rhombomeres 6, 7, 8에서, 원래는 꼬리 인두로 마이그레이션 및 signifi을 기여OFT가있는 평활근 층과...

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 단백질이 표지된 세포를 온전한 심장 내부 깊은 곳에서 입체적으로 촬영하여, 심장 발달 과정 및 출생 후 심장에서 단일 세포 해상도로 유전자 기능을 연구하는 것입니다. 이 방법은 유전자 기능 연구 및 심장 발달 과정 중 단일 세포 해상도에서의 이미지 촬영과 동물 모델의 인위적 결과물(artifacts) 분석과 같은 심장 발달 과정의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 상대적으로 간단하고 비용이 저렴하며, 온전한 배아 또는 심장에서 단일 세포 해상도로 유전자 및 단백질 기능에 대한 특수한 시간적 분석이 가능하다는 점에 있습니다.본 연구에서는 이 시스템을 사용하여 생쥐의 심장 발달을 연구하지만, 근육, 뇌, 폐와 같은 다른 장기 체계나 다른 모델 생물 연구에도 동일하게 활용할 수 있습니다. 여기서는 Tamoxifren을 처리한 R-26 Cre-RET2 confetti 모체로부터 얻은 형광 단백질 양성 배아를 사용합니다. 파라포름알데히드로 고정한 각 배아를 48웰 플레이트의 웰에 담긴 1 mL의 0.1% PBST에 침전시켜 염색을 시작하십시오.조직을 투과성 있게 만들기 위해 상온의 플레이트 쉐이커에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 투과화 용액을 1 mL의 블로킹 버퍼로 교체하고 상온에서 2시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 쉐이킹하며 배양합니다. 다음으로, 각 웰당 0.3 mL의 블로킹 버퍼에 혈관 내피세포 특이적 항체인 PECAM을 1:100 비율로 희석하여 준비한 후, 배아가 들어 있는 웰에 첨가합니다.4°C에서 48시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 배양 후, 조직에서 과량의 1차 항체를 제거하기 위해 PBST로 배아를 5회 세척하며, 각 세척 시간은 30분으로 합니다. 다음으로, 배아를 Alexa Fluor 647 goat antivat 2차 항체 용액에 담그고, 빛을 차단한 상태에서 4°C로 48시간 동안 흔들어주며 배양합니다.48시간 후, 이전 세척 단계를 거친 다음, 4% PFA로 실온에서 1시간 동안 흔들어주며 배아를 후고정합니다. 그 후, PBS로 5분씩 두 번 세척하고, DAPI 핵 염색액으로 배아를 10분 동안 배양합니다. 이어서 5분씩 두 번의 PBS 세척을 수행한 후, 조직 투명화 단계로 진행합니다.단일 세포 해상도로 심장을 이미지화하기 위해서는 조직 투명화가 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 또한, 온전한 배아 심장의 형광 신호를 보존하기 위해서는 scale 또는 CUBIC 중 적절한 투명화 방법을 선택하는 것 역시 매우 중요합니다. 세척 및 염색된 배아를 1 mL의 scale A2 용액이 담겨 있고 알루미늄 호일로 감싸인 신틸레이션 바이알로 옮깁니다.4°C에서 때때로 손으로 부드럽게 흔들어주며 48시간 동안 배양합니다. scale A2 배양이 끝나면 바이알 내의 용액을 1 mL의 scale B4 용액으로 교체하고, 4°C에서 때때로 부드럽게 흔들어주며 다시 48시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 4°C에서 때때로 부드럽게 흔들어주며 1 mL의 scale 70 용액과 함께 배아를 추가로 48시간 동안 배양합니다.마지막으로, scale clearing 처리된 시료를 1 mL의 90% glycerol에 담가 이미지 촬영 시까지 4 °C에서 보관합니다. 이미징을 위해 시료를 최소량의 90% glycerol이 담긴 유리 바닥 페트리 접시로 옮긴 후, 이광자 여기 능력을 갖춘 공초점 현미경으로 촬영합니다. CUBIC clearing의 경우, 각 배아를 1 mL의 CUBIC 1에 담그고 37 °C에서 48시간 동안 가끔씩 부드럽게 흔들어 줍니다.48시간 후, 용액을 동일한 부피의 신선한 CUBIC reagent one으로 교체하고 이전과 같이 샘플을 48시간 동안 추가로 배양합니다. 배양이 끝나면, 과잉의 CUBIC one 용액을 제거하기 위해 CUBIC one 처리된 배아를 PBS로 여러 번 가볍게 흔들어 세척합니다. 그런 다음, 배아를 CUBIC two 용액에 담그고 37 °C에서 가끔씩 가볍게 흔들어주며 48시간 동안 유지합니다.이미징 전까지 시간이 지체될 경우, 30%, 50%, 70% 글리세롤과 PBS를 순차적으로 1 mL씩 사용하여 각각 30분 동안 샘플을 배양하십시오. 일련의 과정을 거친 후, 4 °C에서 보관하기 위해 90% 글리세롤 용액으로 옮깁니다. 이미징 준비가 되면, 이전과 동일하게 90% 글리세롤이 담긴 유리 바닥 페트리 접시에서 이미징을 수행하십시오.이 영상은 scale 처리를 거친 E 8.75 배아 심장의 표면부터 내강까지의 광학 단면을 보여줍니다. 노란색은 PECAM 발현을 나타내며, 모든 심근세포는 녹색으로 나타납니다. 깊이는 110.4 microns이며 총 93개의 슬라이스로 구성되어 있습니다.방금 보여드린 재구성된 심장의 3D 표면 이미지입니다. 다시 한번 설명드리자면, 노란색은 PECAM 발현을 나타내며, 초록색은 모든 심근세포를 표시합니다. 이 영상은 scale 처리된 E 9.5 심장의 유출로 부위에서 단일 전구세포 클론의 단면들을 보여줍니다.노란색은 PECAM 발현을 나타내며 클론은 녹색으로 보입니다. 깊이는 36 microns이며 총 10개의 슬라이스가 있습니다. 이 영상은 CUBIC 처리된 P two 심장의 표면부터 루멘까지의 단면을 보여줍니다.깊이는 130 µm이며 섹션당 3 µm입니다. 이 영상은 CUBIC으로 처리된 E 17.5 심장의 표면부터 내강까지의 섹션을 보여줍니다. 깊이는 630 µm이며 섹션당 6 µm입니다.이것은 3D 재구성 소프트웨어를 통해 재구성한, 방금 보여드린 심장의 3D 표면 사진입니다. 이 절차를 시도할 때, 배아는 취약하며 심장 병변이 쉽게 손상될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 염색법을 사용하여 포스트-오스틀레이션(post-ost lation) 및 그 이후 단계에서 유전자 기능을 연구함으로써 다른 단백질을 확인할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

우리는 광 클리어런스 및 초점 현미경이어서 표준 면역 염색 방법을 이용하여, E15.5까지 온 뮤린 배아 하트 관상 혈관의 분석 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 직렬 섹션 시간 소모 분석 할 필요없이 전체에 걸쳐 심장 혈관의 시각화를 가능하게한다.

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

상해 다음 심근 세포 증식은 비 근세포 세포 집단에서 세포 외 단서의 교향곡을 요구하는 동적 프로세스입니다. 계보 추적, 수동 선명도 및 3차원 전체 마운트 공초점 현미경 기술을 활용하여 다양한 세포 유형이 심장 수리 및 재생에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다.

클리어 심장 3 차원 이미징을 통해 표적 세포 집단의 심장 손상 반응을 캡처

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

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우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

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설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

이 프로토콜은 광시트 형광 현미경을 사용하여 정량적 전체 마운트 3차원 혈관 이미징을 위한 신속한 방법을 소개합니다. 이 방법의 효능은 전산 유체 역학을 통해 정량화된 혈역학적 힘과 함께 병아리 배아 모델의 인두 궁 동맥 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

정량적 연구를 위한 소동물 혈관 구조의 신속한 전체 마운트 고해상도 이미징

학습하세요 심장 발달 연구를 위한 단일 세분해상도 형광 단백질 세포 이미징 방법. 조직 투명화 기술을 활용하여 배아 및 출생 후 심장의 유전자 기능을 정밀 분석할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

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