영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

이 절차의 전반적인 목표는 온전한 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하여 심장 발달 중 및 출생 후 심장에서 단일 세포 해상도에서 유전자 기능을 연구하는 것입니다. 이 방법은 유전자 기능 연구 및 심장 발달 및 애니미달 인공물 중 단일 세포 해상도에서 이미지를 돕는 것과 같은 심장 발달 중 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 온전한 배아 또는 심장에서 단일 세포 해상도로 유전자 및 단백질 기능에 대한 특수 시간 분석이라는 점에서 상대적으로 간단하고 저렴하며 프로현명하다는 것입니다.

우리는 이 시스템을 사용하여 쥐의 심장 발달을 연구하지만 근육, 뇌 및 폐와 같은 다른 장기 시스템과 다른 모델 유기체를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 여기에는 타목시프렌 처리된 R-26 Cre-RET2 색종이 댐의 형광 단백질 양성 배아가 사용됩니다. 각 파라포름알데히드 고정 배아를 48웰 플레이트의 웰에 0.1%PBST 1밀리리터에 담가 염색을 시작합니다.

조직을 투과시키기 위해 실온의 플레이트 셰이커에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 투과화 용액을 1mL의 차단 완충액으로 교체하고 실온에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 진탕과 함께 배양합니다. 다음으로, 각 웰에 대해 0.3ml의 차단 버퍼에 내피 세포 특이적 항체인 PECAM을 1-100 희석하여 준비하고 이를 배아가 들어 있는 웰에 추가합니다.

섭씨 4도에서 흔들면서 48시간 동안 배양합니다. 배양 후 조직에서 과도한 1차 항체를 제거하기 위해 매번 30분 동안 PBST로 배아를 5회 세척합니다. 다음으로, 배아를 Alexa Fluor 647 염소 항 2차 항체 용액에 담그고 빛으로부터 보호된 상태에서 섭씨 4도에서 48시간 동안 흔들면서 배양합니다.

48시간 후, 전에 세척한 후 4% PFA로 배아를 흔들면서 실온에서 1시간 동안 사후 고정합니다. 그런 다음 매번 5분 동안 PBS로 두 번 세척한 후 DAPI 핵 염색이 된 배아를 10분 동안 배양합니다. 이어서 각각 5분씩 PBS를 두 번 세척한 다음 조직 세척을 진행합니다.

조직 제거는 단일 세포 해상도에서 심장을 이미지화하기 위해 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 또한, 스케일 또는 CUBIC 중 하나의 투명화 방법을 선택하는 것도 온전한 배아 심장에서 형광 신호를 보존하기 위해 매우 중요합니다. 세척되고 염색된 배아를 알루미늄 호일로 싸인 섬광 바이알에 옮기는데, 그 안에는 1ml의 스케일 A2 용액이 들어 있습니다.

섭씨 4도에서 48시간 동안 가끔 손으로 부드럽게 흔들어 배양합니다. 스케일 A2 배양 후, 바이알의 용액을 1ml의 스케일 B4 용액으로 교체하고 섭씨 4도에서 가끔 부드럽게 흔들어 48시간 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 1밀리리터의 스케일 70으로 배아를 48시간 동안 더 배양하고 이전과 같이 가끔 부드럽게 흔듭니다.

마지막으로, 스케일에서 세척된 샘플을 1ml의 90% 글리세롤에 담그고 이미징할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 이미지를 얻기 위해 최소 90%의 글리세롤을 함유한 유리 바닥 페트리 접시에 샘플을 옮기고 두 개의 광자 기능이 있는 컨포칼 현미경으로 이미지를 만듭니다. CUBIC 투명화를 위해 각 배아를 1ml의 CUBIC 배아에 담그고 섭씨 37도에서 48시간 동안 가끔 부드럽게 흔듭니다.

48시간 후, 용액을 동일한 부피의 새로운 CUBIC 시약 1로 교체하고 이전과 같이 추가로 48시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후, PBS로 처리된 CUBIC one 처리 배아를 손으로 부드럽게 흔들어 여러번 세척하여 여분의 CUBIC one 용액을 제거합니다. 그런 다음 배아를 섭씨 37도에서 48시간 동안 CUBIC two 용액에 담그고 가끔 손으로 부드럽게 흔듭니다.

이미징 전에 지연이 있는 경우 30%50% 및 70%글리세롤과 PBS를 1ml씩 각각 30분 동안 순차적으로 배양합니다. 시리즈를 통해 이동 한 후 섭씨 4도에서 보관하기 위해 90 % 글리세롤 용액으로 옮깁니다. 준비가 되면 이전과 같이 90%글리세롤이 함유된 유리 바닥 페트리 접시에 이미지를 넣습니다.

이 동영상은 심장 표면에서 내강까지 스케일 처리된 E 8.75 심장의 광학 단면을 보여줍니다. 노란색은 PECAM 발현을 표시하고 모든 심근세포는 녹색으로 나타납니다. 깊이는 110.4미크론이며 총 93개의 슬라이스

이것은 방금 보여준 재건된 심장의 3D 표면 사진입니다. 다시 말하지만, 노란색은 PECAM 발현을 표시하고 녹색은 모든 심근 세포를 표시합니다. 이 동영상은 유출로 영역에서 비늘 처리된 E 9.5 심장의 단일 전구 클론의 단면을 보여줍니다.

노란색은 PECAM 표현식을 표시하고 클론은 녹색으로 나타납니다. 깊이는 36미크론이며 총 10개의 슬라이스가 있습니다. 이 동영상은 CUBIC 처리된 P 2 심장의 표면에서 내강까지의 단면을 보여줍니다.

깊이는 130미크론이며 섹션당 3미크론입니다. 이 동영상은 CUBIC 처리된 E 17.5 심장의 표면에서 내강까지의 단면을 보여줍니다. 깊이는 630미크론이며 섹션당 6미크론입니다.

이것은 방금 보여준 심장의 3D 표면 사진으로, 3D 재구성 소프트웨어를 통해 재구성되었습니다. 이 절차를 시도할 때 배아가 연약하고 심장 병리학이 쉽게 방해받을 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 염색을 사용하여 ost lation 및 거품 후 유전자 기능을 연구하여 다른 단백질을 실현할 수 있습니다.