Name: 자질 체외 ATP 아제 활동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 정제된 단백질의 체외 ATPase 활성을 정량화하는 생화학적 방법을 통해 효소 기능을 특성화하고 잠재적 활성제 또는 억제제를 평가하는 기술을.

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저자는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 RO1AI049294(M. S.에게)의 자금 지원에 감사를 표합니다.

1. 정제 된 단백질과 ATP 가수 분해 반응을 수행 <ol><li> 정제 된 단백질과 부화에 필요한 모든 시약의 주식을 준비합니다. <ol><li> 100 mM의 HEPES pH가 8.5, 65 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤 (또는 다른 분석 완충액 적절한)을 함유하는 배 HEPES / 염화나트륨 / 글리세롤 (HNG) 버퍼를 준비한다. </li><li> 물 (ATP 아제 금속에 의존하는 경우, 또는 다른 금속) 100 밀리미터의 MgCl 2를 준비합니다. </li><li> 고순도 ATP를 사용 (추가하여 pH를 조정하지 않음) 200 mM 트리스 자료에서 신선한 100 mM의 ATP를 준비합니다. 나누어지는이 ATP가 시간이 지남에 따라 분해되므로, 몇 주 이상 더 이상 -20 ° C에서 ATP 재고를 저장하고, 동결 및 ATP 재고를 해동을 삼가합니다. </li><li> 1에서 프리믹스의 MgCl 2, ATP : 1의 비율로 바로 ATP의 가수 분해 반응을 설정하기 전에. </li></ol></li><li> 조제 및 반응에 걸쳐 일정한 간격으로 샘플을 수집하는 1.5 ㎖의 튜브 라벨. 시간 0 시간 15, 30에서 샘플을 수집하기 위해 튜브를 준비,45 및 60 분. 참고 : 다른 방법으로, 유일한 시간 0 엔드 포인트에서 샘플을 수집합니다. <ol><li> ATP에 가수 분해 반응은 1:50에서 수집 한 샘플을 희석하기 위해 각 튜브에 245 μL의 1X HNG 버퍼를 추가한다. </li></ol></li><li> 신속하게 반응을 정지 샘플을 동결을 위해 드라이 아이스와 에탄올의 목욕을 준비합니다. 고무 얼음 양동이 또는 다른 안전 (비 플라스틱) 용기에 드라이 아이스의 여러 조각을 추가하고 조심스럽게 드라이 아이스를 커버하기에 충분한 70 ~ 100 에탄올을 부어. </li><li> 적절한 (일반적으로 5 ~ 10 μM)로, 1 배 HNG 버퍼에 정제 된 단백질을 희석하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> ATP에 가수 분해 반응을 설정합니다. <ol><li> 각 샘플에 대해 별도의 0.5 ml의 튜브에서, (순서대로) 다음과 같은 시약을 추가, 6 μl의 5 배 HNG 또는 다른 버퍼, 3 μL 100 밀리미터의 MgCl 2 -ATP 혼합물 (최종 30 μL의 볼륨까지) H 2 O, 및 0.25-5 μm의 단백질. </li><li> 어떤 단백질을 첨가하지 않은 버퍼 전용 대조군 조건을 포함한다.</li></ol></li><li> 시간 0에서 반응 5 μL를 제거 HNG 245 μL의 버퍼를 포함하는 제조 1.5 ㎖의 튜브에 1:50로 희석하고, 즉시 드라이 아이스 / 에탄올 욕에서 샘플을 동결. </li><li> 37 ° C에서 반응은 ATP 가수 분해는 1 시간 동안 발생할 수 있도록 인큐베이션. 각각의 구간 (15, 30, 45, 60 분), 반응을 5 ㎕의 분취 액을 제거하고, 단계 160에서와 같이 HNG 버퍼를 함유하는 표지 된 샘플 튜브에 추가. </li><li> ATP에 가수 분해 반응의 끝에서, 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 희석 샘플을 이동. 모든 샘플이 완전히 고정되어 있는지 확인하려면 계속하기 전에 적어도 10 분을 기다립니다. </li></ol> 검출 시약과 무료 파이를 포함하는 2 품어 샘플 <ol><li> 각 시점에서의 ATP 가수 분해 반응의 분취 량을 함유하는 희석 된 샘플 녹여 실온에서 (단계 1.6 및 1.7에서 수득). </li><li> 샘플 및 포스페이트 표준을 함유하는 96 웰 플레이트를 설치했다. <ol><li> 0.5 ml의 TU에서800 μM 표준 104.5 μL에 HNG 완충액 5.5 μl를 첨가하여 800 μM 40 μM 내지 (PI 검출 시약으로 제공됨) 포스페이트 표준 희석 될. 잘 혼합하고, 96 웰 플레이트의 웰에 A1을이 40 μM 파이 표준의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 1 우물 B1-H1에 50 μL의 HNG 버퍼를 추가 파이 표준의 1 직렬 희석. </li><li> 잘 A1에서 40 μM 파이의 50 μl를 제거하고 잘 B1에 50 μl를 분석 버퍼에 추가, 혼합, 잘 B1에서 50 μl를 제거하고 잘 G1을 통해 잘 C1에 계속 희석을 추가합니다. 각 웰은 동일한 볼륨이 보장하는 혼합하여 잘 G1 50 μl를 폐기하십시오. 잘 H1 40 0​​ μM에 파이 표준을 만들 수있는 유일한 버퍼를 포함해야합니다. 참고 : 추가 요소 (예 : 억제제 등) 샘플에 추가 된 경우, 그 조건 하에서 인산 릴리스 또는 흡광도의 변화를 제어하는​​ 요소를 포함하는 표준 곡선을 작성합니다. </li><li> 각 SAMP의 50 μl를 추가접시에 중복으로 제작. 서로 다른 시점 수평, 열에서 같은 시점 ​​수직 (샘플 2 시간 0 = B2, B3 샘플 1 시간 0 = A2, A3가)에서 샘플을 추가합니다. 이는 최대 8 샘플 및 플레이트 당 5 시간 지점 수 있습니다. </li></ol></li><li> 시료와 표준을 포함​​하는 웰 (시약 필요 (㎖) = 시료와 표준의 0.1 × 번호) 각 100 μl를 추가하기에 충분한 말라카이트 그린 / 몰리브덴 파이 검출 시약을 제거하기 위해 멸균 피펫을 사용하여 쉽게 피펫 팅에 대한 접시에 추가 멀티 채널 피펫을 사용. 파이 오염이 발생하기 쉽다 같이 접시에 직접 검출 시약을 부어 마십시오. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 처음 포인트 전회 점에서 바람직 위해 도입 거품 않고 조심스럽게 피펫으로 시간과 일관된 번호 아래 각 웰에 파이 검출 시약 100 μL를 추가 혼합한다. </li><li> 실온에서 25 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 또는 MA에 따라nufacturer의 방향. </li></ol> 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 3. 정량 결과 <ol><li> 흡광도 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 650 nm에서 시료의 흡광도를 참조하십시오. </li><li> 파이 표준 곡선을 확인합니다. 그래프 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 인산의 양에 대해 해결하기 위해 사용 된 식을 찾기 위해 농도 대 파이 표준 샘플에 대한 흡광도 값을 그래프. </li><li> 포스페이트 표준을 교정하여 각 샘플에 대한 ATP 아제 활성을 계산한다. 인산 출시 = (OD 650 - Y 절편) / 경사. <ol><li> 각 샘플의 중복에서 전체 파이를 평균. 이 번호에서 버퍼 전용 컨트롤의 흡광도 판독 값을 뺍니다. 희석 인자 (예에서는 50)를 곱하면. </li><li> μmol 단백질 당 발표 nmol의 파이를 결정합니다. 역학적 분석에서 각 시점에 대한 이들 값을 그래프로하여 적어도 R = 0.99 (도 1)의 선형 ​​발작을 수득한다; N 경우OT는 분석은 더 많거나 적은 단백질 또는 길거나 짧은 배양 시간이 조정될 수있다. </li></ol></li><li> nmol의 PI / 단백질 μmol / min으로 같은 결과를 원하는 경우, 또는 nmol의 PI / μg의 단백질 / 분 (3,도 2 등)를 나타낸다. </li></ol>

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</ol>

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이 생화학 적 특성에 대한 정제 된 단백질의 생체 외 ATP 아제 활동 측정하는 일반적인 프로토콜입니다. 이 방법은 쉽게 최적화되어 있습니다; 예를 들어, 단백질, 완충 염 및 조성물, 온도, 및 상기 분석과 다양한 길이 (간격의 총 개수를 증가 포함) 간격의 양을 조절하는 활성을 정량을 향상시킬 수있다. 시판 말라카이트 그린 기반의 시약은 매우 민감, 무료 인산 소량 검출 할 수있다 (~ 100 μl의 50 pmol의). 따라서 분석의 민감도, 일회용 플라스틱 제품, 초순수, 완충제, 인산염 오염없는 시약을 사용하는 것이 중요하다. 단백질 정제 후, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토 그래피는 단백질의 순도를 향상시키고 불순물을 제거하기 위해 권고된다. 시험관 ATP 아제 활성이 약한 표시 단백질, 각성제 전자를 향상시키기 위해 반응에 첨가 될 수있다nzymatic 활동. ATP 아제 활성을 자극하는 많은 요소...

ATPase는 모든 생명계의 많은 과정에서 필수적인 효소입니다. ATPase는 ATP 가수분해 에너지를 사용하여 단백질 이동, 풀림 및 조립과 같은 다양한 반응에 동력을 공급하는 분자 모터 역할을 합니다. 복제 및 전사; 세포 대사; 근육 움직임; 세포 운동성; 및 이온 펌핑1-3. 일부 ATPase는 막을 가로질러 용질을 운반하는 데 관여하는 막관통 단백질이고, 다른 ATPase는 세포질이며 원형질막(plasma membrane) 또는 소기관(organelle)과 같은 생물학적 막과 관련될 수 있습니다.
AAA+ ATPases (다양한 세포 활동과 관련된 ATPases)는 일부 서열 및 구조적 보존을 공유하는 큰 ATPase 그룹을 구성합니다. 이러한 단백질은 Walker-A 및 -B box와 같은 보존된 뉴클레오티드 결합 모티프를 포함하고 활성 상태에서 올리고머(일반적으로 헥사머)를 형성합니다1. 뉴클레오티드 결합에 대한 이러한 단백질의 큰 구조적 변화는 AAA+ 계열의 다양한 구성원 사이에서 특성화되었습니다. EpsE는 AAA+ ATPase이며 NTPase4-6의 박테리아 Type II/IV 분비 아과에 속합니다. EpsE는 콜레라의 원인 병원체인 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에서 제2형 분비(Type II Secretion, T2S)를 촉진합니다. T2S 시스템은 V. cholerae가 인간의 소장에 서식할 때 다량의 수성 설사를 유발하는 독성 인자인 콜레라 독소와 같은 다양한 단백질의 분비를 담당합니다7. 
체외 ATPase 활성을 정량화하는 기술은 다양하지만 일반적으로 비색, 형광 또는 방사성 기질을 사용하여 인산염 방출을 측정합니다8-11. 우리는 유리된 무기 인산염(Pi)을 측정하는 상업적으로 이용 가능한 공작석 녹색 함유 기질을 기반으로 한 비색 분석을 사용하여 정제된 단백질의 체외 ATPase 활성을 결정하는 기본 방법을 설명합니다. 낮은 pH에서 공작석 녹색 몰리브덴 산염은 Pi와 복합체를 형성하며 복합체 형성 수준은 650nm에서 측정 할 수 있습니다. 이 간단하고 민감한 분석법은 새로운 ATPase를 기능적으로 특성화하고, 잠재적인 활성제 또는 억제제의 역할을 평가하고, 도메인 및/또는 특정 잔류물의 중요성을 결정하거나, 효소 활성에 대한 특정 처리의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES 완충액</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 삼인산(ATP)</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트(투명, 평면 바닥)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>선호 인산염 검출 시약. 주의: 자극성.</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td></td><td></td><td>BioTek Synergy 또는 유사한</td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; atp 아제 활동

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

아데노신 삼인산 가수 분해 효소, 또는 -ATPase를는 세포 기능의 다양한 배열에 중요한 역할을한다. 이러한 동적 단백질은 단백질 인신 매매 및 저하, 용질 수송, 및 세포의 움직임과 같은 기계적인 작업을위한 에너지를 생성 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 기능적 특성화 -ATPase를 정제의 시험 관내 활성을 측정하기위한 기본적인 분석이다. 단백질은 무기 포스페이트 방출을 초래 반응의 ATP 가수 분해 및 유리 된 인산의 양은 다음 비색 정량 분석​​법을 사용한다. 이것은 고도로 적응 프로토콜 운동 또는 엔드 포인트 분석에서 ATP 아제 활성을 측정하기 위해 조정될 수있다. 대표적인 프로토콜이 활동과 EPSE의 요구 사항에 따라 여기에 제공되면, AAA + ATP 아제는 박테리아 비브리오 콜레라를 입력 II 분비에 관여. 활성을 측정하기 위해 필요로 정제 된 단백질의 양을 분석의 길이와 SA의 타이밍 및 횟수mpling 간격, 버퍼 소금 조성, 온도, 공동 요인, 각성제 (있는 경우) 등이 여기에 설명하는 것과 다를 수 있습니다, 따라서 약간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 특성 -ATPase를위한 기본 틀을 제공하고 신속하게 수행하고 쉽게 필요한 조절 될 수있다.

T2S ATP 아제 EPSE의 생체 외 활동은 세포질 EpsL (EPSE-cytoEpsL)의 도메인과 산성 인지질 카디오 리핀 (12)의 추가와 함께 EPSE의 copurification에 의해 자극 될 수있다. 또한이 분석을 사용하여 단백질의 변이체 형태를 야생형 (WT)의 활성을 비교함으로써 ATP 가수 분해에 EPSE 특정 잔기의 역할을 결정하는 것도 가능하다. 여기서, EPSE 아연 결합 도메인에 두 개의 리신 잔기로 치환하는 효과가 K417AK419A EPSE-cytoEpsL 변이체를 정제 WT EPSE-cytoEpsL의 ATP 아제 활성을 비교함으로써 측정된다. 도 1에서, 포스페이트 방출은 1 시간 역학적 분석, 운동 ATP 아제 활성의 정확한 정량을위한 요구 사항에 걸쳐 선형 진행한다. 이중으로 세 번 분석하고 정량화 된도 1과 같은 정제 된 단백질 시료 <s...

체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

이 절차의 전반적인 목적은 기능적 특성 분석을 위해 정제된 단백질의 in vitro ATPase 활성을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 새로운 추정 ATPase를 특성화하고, 효과적인 잠재적 활성제 또는 억제제를 평가하며, 특정 도메인이나 잔기가 ATPase 활성에 기여하는 정도를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 in vitro ATPase 활성을 측정하는 단순하고 민감한 방법이며 쉽게 최적화할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 안내된 대로 정제된 단백질과 함께 배양하는 데 필요한 모든 시약의 스톡을 준비하십시오. ATP 가수분해 반응을 설정하기 직전에 100 millimolar 염화마그네슘과 100 millimolar ATP를 1:1 비율로 미리 혼합하십시오. 반응 전 과정 동안 정해진 간격으로 샘플을 수집하기 위해 1.5 milliliter 튜브를 준비하고 라벨을 부착하십시오.0분 및 15, 30, 45, 60분 시점에 샘플을 수집할 튜브를 준비합니다. ATP 가수분해 반응에서 수집한 샘플을 1:50으로 희석하기 위해 각 튜브에 1x HNG 버퍼 245 µL를 첨가합니다. 다음으로, 반응을 중단시키기 위해 샘플을 빠르게 급속 냉동할 수 있도록 드라이아이스와 에탄올 혼합 조를 준비합니다.고무 얼음 버킷 또는 기타 안전한 용기에 드라이아이스 몇 조각을 넣고, 드라이아이스가 잠길 정도로 70%~100% 에탄올을 조심스럽게 붓습니다. 정제된 단백질을 1X HNG 완충액으로 희석하여 얼음 위에 보관합니다. 준비된 0.5 mL 튜브에 최종 반응 부피가 30 µL가 되도록 미리 계산된 양의 증류수를 첨가하여 ATP 가수분해 반응을 설정합니다.이어서 6 µL의 5X HNG 또는 다른 버퍼, 3 µL의 100 mM 염화마그네슘 ATP 혼합물, 그리고 0.25~5 µM의 단백질을 첨가합니다. 단백질을 첨가하지 않은 버퍼 전용 음성 대조군 조건을 함께 배양합니다. 다음으로, 0시점에 반응액에서 5 µL를 취합니다.그 다음, 245 µL의 HNG 버퍼가 들어있는 준비된 1.5 mL 튜브에 분취액을 1:50으로 희석합니다. 시료를 드라이아이스 에탄올 배스(bath)에서 즉시 급속 냉동합니다. ATP 가수분해가 일어나도록 37 °C에서 1시간 동안 반응물을 배양합니다.각 간격마다 반응물에서 5 µL의 분량을 취하여 이전과 동일하게 HNG 완충액이 들어 있는 라벨이 부착된 샘플 튜브에 추가합니다. ATP 가수분해 반응이 끝나면, 희석된 샘플을 보관을 위해 80 °C 냉동고로 옮깁니다. 모든 샘플이 완전히 냉동되었는지 확인하기 위해, 다음 단계로 진행하기 전 최소 10분 동안 기다립니다.각 시간대별 ATP 가수분해 반응 분주액이 포함된 희석 시료를 상온에서 해동합니다. 그다음, 시료와 인산 표준물질이 포함된 96웰 플레이트를 준비합니다. 0.5밀리리터 튜브에 인산 표준물질 5.5µL를 HNG 버퍼 104.5µL에 첨가하여 인산 표준물질을 800µM에서 40µM로 희석합니다.잘 섞은 후, 40 µM 인산염 표준 용액 100 µL를 96-웰 플레이트의 A1 웰에 넣습니다. 인산염 표준 용액의 1:1 연속 희석을 위해 B1부터 H1 웰까지 HNG 버퍼 50 µL를 각각 넣습니다. A1 웰에서 40 µM 인산염 용액 50 µL를 취해 B1 웰의 분석 버퍼 50 µL에 넣고 섞습니다.그런 다음 B1 웰에서 50 µL를 취해 C1 웰에 넣고, G1 웰까지 희석 과정을 계속합니다. 혼합 후 각 웰의 부피를 동일하게 맞추기 위해 G1 웰에서 50 µL를 버립니다. H1 웰에는 40에서 0 µM까지의 인산염 표준 용액을 만들기 위해 버퍼만 포함되어야 합니다. 다음으로, 각 샘플 50 µL를 플레이트에 두 번씩(duplicate) 넣습니다.동일한 시점의 샘플은 수직 열로, 서로 다른 시점의 샘플은 수평 행으로 추가하십시오. 이를 통해 플레이트당 최대 8개의 샘플과 5개의 시점을 처리할 수 있습니다. 멸균 피펫을 사용하여 샘플과 표준품이 들어 있는 각 웰에 100 µL씩 추가할 수 있도록 충분한 양의 malachite green meliptate phosphate 검출 시약을 취하십시오.멀티채널 피펫을 사용하여 쉽게 분주할 수 있도록 검출 시약을 디시에 담습니다. 인산염 오염이 발생할 가능성이 있으므로 검출 시약을 디시에 직접 붓지 마십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 인산염 검출 시약 100 µL를 첨가하고, 기포가 생기지 않도록 일정한 횟수로 피펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 이때 마지막 시점부터 첫 번째 시점 순으로 진행하십시오.플레이트를 실온에서 25분 동안 또는 제조사의 지침에 따라 방치하십시오. 결과를 정량화하려면 흡광 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 650 nanometers에서 시료의 흡광도를 측정하십시오. 자극제인 cardiolipin의 존재 및 부재 시 type two secretion ATPase/EPSE의 야생형 및 변이형의 활성을 측정한 kinetic 및 endpoint ATPases의 대표적인 결과가 제시되어 있습니다.여기에 나타난 것은 키네틱 카디올리핀 자극 ATPase 결과로, 야생형 EPSE와 이중 리신 돌연변이체의 시간에 따른 선형 인산 방출을 보여주며, 소 혈청 알부민이 음성 대조군으로 사용되었습니다. 이 데이터는 각 단백질의 ATPase 활성을 정량화하고 비교하기 위해 분당 인산 방출량/단백질 농도로 표시될 수 있습니다. 데이터는 두 개의 리신 잔기인 K417 및 K419가 EPSE의 카디올리핀 자극 ATPase 활성에 기여함을 나타냅니다.동일한 단백질의 카르디올리핀 자극 없는 ATPase 활성을 비교한 결과, 이 두 라이신 잔기는 EPSE의 낮은 기저 활성에는 기여하지 않으나, 단백질이 카르디올리핀에 의해 자극받는 능력에는 기여하는 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 정제된 단백질의 ATPase 활성을 빠르고 정확하게 정량하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 인산염 검출 시약의 민감도를 고려하는 것이 중요합니다.인산염 오염을 방지하기 위해, 일회용 플라스틱 제품과 초순수를 사용할 것과 단백질 정제 후 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피를 수행할 것을 권장합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

아세테이트 키나제 활동의 결정을위한 방법을 설명합니다. 이 분석은 다른 phosphoryl acceptors와 아세테이트 - 성형 방향으로 아세테이트 키나제 효소의 활동과 속도론을 결정하기위한 직접적인 반응을 활용합니다. 또한,이 방법은 다른 아세틸 인산 또는 아세틸 - COA 활용한 효소를 시금 활용하실 수 있습니다.

효소 아세테이트 키나제의 아세테이트 - 형성 활동의 직접적인 탐지

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

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박층 크로마토그래피 기반 효소 활성 분석: 박층 크로마토그래피를 사용하여 체외 피로포스포키나제 활성을 측정하는 기술

이 동영상은 합성 4-메틸룸벨리페릴 기질을 사용하여 샘플에서 α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제에 대한 효소 활성의 체외 측정을 보여줍니다.

α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제 효소 활성의 체외 측정

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오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

여기에서는 ATP 의존성 염색질 리모델링 효소의 능력을 특성화하는 데 사용할 수 있는 생화학적 분석법을 설명합니다. 1) ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩을 촉매하고, 2) 뉴클레오솜 기질과 결합하고, 3) 뉴클레오솜 또는 DNA 의존성 방식으로 ATP를 가수분해합니다.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

본 보고서는 리슈마니아 세포 추출물을 사용하여 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소 활성을 측정하기 위한 체외 효소 분석을 설명합니다. 이 분석은 방사성 메틸기가 S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 내인성 포스파티딜에탄올아민으로 전달되는 것을 기반으로 합니다.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

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전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 "고아" 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.

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정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

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배우세요 정제된 단백질의 체외 ATPase 활성을 정량화하는 생화학적 방법을 통해 효소 기능을 특성화하고 잠재적 활성제 또는 억제제를 평가하는 기술을.

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