자질 체외 ATP 아제 활동

이 절차의 전반적인 목표는 기능적 특성화를 위해 정제된 단백질의 체외 ATPase 활성을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 새로운 추정 ATPase를 특성화하고, 효과적인 잠재적 활성제 또는 억제제를 평가하고, ATPase 활성에 대한 특정 도메인 또는 잔기의 기여도를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외 ATPase 활성을 측정하기 위한 간단하고 민감한 방법이며 쉽게 최적화할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜의 지시에 따라 정제된 단백질로 배양하는 데 필요한 모든 시약의 재고를 준비합니다. ATP 가수분해 반응을 시작하기 직전에 100밀리몰의 염화마그네슘과 100밀리몰의 ATP를 1:1 비율로 프리믹스합니다. 반응 전반에 걸쳐 일정한 간격으로 샘플을 수집하기 위해 1.5 millil 튜브를 준비하고 라벨링합니다.

0분과 15분, 30분, 45분, 60분에 샘플을 채취할 수 있는 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 245마이크로리터의 1x HNG 완충액을 추가하여 ATP 가수분해 반응에서 수집된 샘플을 1에서 50의 희석으로 희석합니다. 다음으로, 반응을 멈추기 위해 샘플을 빠르게 동결하기 위해 드라이 아이스와 에탄올 수조를 준비합니다.

고무 얼음 양동이 또는 기타 안전한 용기에 드라이 아이스 여러 조각을 넣고 드라이 아이스를 덮을 만큼 70%에서 100% 에탄올을 조심스럽게 붓습니다. 정제된 단백질을 1X HNG 완충액에 희석하여 얼음 위에 보관합니다. 30 마이크로리터의 최종 반응 부피에 도달하기 위해 미리 계산된 부피의 물을 첨가하여 준비된 0.5 millilit 튜브에서 ATP 가수분해 반응을 설정합니다.

그 다음에는 6마이크로리터의 5X HNG 또는 기타 완충액, 3마이크로리터의 100밀리몰 염화마그네슘 ATP 혼합물 및 0.25-5마이크로몰 단백질이 뒤따릅니다. 단백질이 추가되지 않은 완충액 전용 음성 대조군 조건을 배양합니다. 다음으로, 0 시간에 반응에서 5 마이크로 리터를 제거합니다.

그런 다음 245 마이크로 리터의 HNG 완충액이 들어있는 준비된 1.5 밀리리터 튜브에 분취액을 50으로 희석합니다. 즉시 샘플을 드라이 아이스 에탄올 수조에 얼립니다. ATP 가수분해가 1시간 동안 일어날 수 있도록 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다.

각 간격마다 반응에서 5마이크로리터 분취액을 제거하고 이전과 같이 HNG 완충액이 포함된 라벨링된 샘플 튜브에 추가합니다. ATP 가수분해 반응이 끝나면 희석된 샘플을 섭씨 80도의 냉동고로 옮겨 보관합니다. 모든 샘플이 완전히 동결되었는지 확인하려면 진행하기 전에 최소 10분을 기다리십시오.

각 시점의 ATP 가수분해 반응 분취액을 포함하는 희석된 샘플을 실온에서 해동합니다. 다음으로, 샘플과 인산염 표준물질을 포함하는 96웰 플레이트를 준비합니다. 0.5 밀리리터 튜브에서 104.5 마이크로 리터의 HNG 버퍼에 5.5 마이크로 리터의 표준물을 첨가하여 인산염 표준물을 800 마이크로 몰에서 40 마이크로 몰로 희석합니다.

잘 섞고 이 40마이크로몰 인산염 표준물질 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 웰 A1에 추가합니다. 인산염 표준물질의 일대일 직렬 희석을 위해 웰 B1에서 H1까지 50마이크로리터의 HNG 완충액을 추가합니다. 웰 A1에서 50마이크로리터의 40마이크로몰 인산염을 제거하고 웰 B1에 있는 50마이크로리터의 분석 버퍼에 첨가하고 혼합합니다.

그런 다음 웰 B1에서 50마이크로리터를 제거하고 웰 C1에 첨가하여 웰 G1을 통해 희석을 계속합니다. 혼합 후 웰 G50에서 1마이크로리터를 버리고 각 웰의 부피가 동일한지 확인합니다. Well H1은 40에서 0 마이크로 몰까지의 인산염 표준을 생성하기 위해 완충액 만 포함해야합니다. 다음으로, 각 샘플의 50마이크로리터를 플레이트에 복제하여 추가합니다.

동일한 시점의 샘플을 세로로로 열에 추가하고 다른 시점의 샘플을 가로로 추가합니다. 이를 통해 플레이트당 최대 8개의 샘플과 5개의 시점을 사용할 수 있습니다. 멸균 피펫을 사용하여 샘플과 표준물질이 들어 있는 각 웰에 100마이크로리터를 추가하기에 충분한 말라카이트 녹색 멜립테이트 인산염 검출 시약을 제거합니다.

검출 시약을 접시에 추가하여 멀티채널 피펫을 사용하여 쉽게 피펫팅할 수 있습니다. 인산염 오염이 발생할 수 있으므로 검출 시약을 접시에 직접 붓지 마십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100마이크로리터의 인산염 검출 시약을 추가하고 기포가 생기지 않도록 일정한 횟수만큼 위아래로 피펫팅하여 마지막 시점부터 첫 번째 시점까지 순서대로 혼합합니다.

접시를 실온에서 25분 동안 또는 제조업체의 지시에 따라 그대로 두십시오. 결과를 정량화하려면 흡광도 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 650나노미터에서 샘플의 흡광도를 판독합니다. 운동 및 종점 ATPase의 대표적인 결과가 표시되며, 여기서 2형 분비 ATPase/EPSE의 야생형 및 돌연변이 형태의 활성은 자극성 cardiolipin의 유무에 따라 결정됩니다.

여기에 표시된 것은 kinetic cardiolipin-stimulated ATPase의 결과로, 야생형 EPSE 및 이중 라이신 돌연변이체에 대한 시간 경과에 따른 선형 인산염 방출을 보여주며, 소 혈청 알부민이 음성 대조군 역할을 합니다. 이러한 데이터는 각 단백질의 ATPase 활성을 정량화하고 비교하기 위해 분당 방출되는 인산염의 양을 단백질 농도로 나눈 값으로 나타낼 수 있습니다. 이 데이터는 두 개의 라이신 잔기인 K417 및 K419가 EPSE의 카디올리핀 자극 ATPase 활성에 기여한다는 것을 나타냅니다.

카디올리핀 자극이 없는 동일한 단백질의 ATPase 활성을 비교한 결과, 이 두 라이신 잔기가 EPSE의 낮은 기저 활성에 기여하는 것이 아니라 카디올리핀에 의해 자극되는 단백질의 능력에 기여한다는 것을 알 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 정제된 단백질의 ATPase 활성을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 인산염 검출 시약의 감도를 고려하는 것이 중요합니다.

인산염 오염을 방지하려면 일회용 플라스틱 용기와 초순수를 사용하고 단백질 정제 후 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 것이 좋습니다.