Name: 에서 이미징 칼슘 초파리 계란 활성화에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 계란 활성화 과정에서 칼슘 역학을 시각화하는 ex vivo 이미징 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에서 칼슘 파동의 기원과 전파를 고해상도로 분석하는 데 활용됩니다.

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우리는이 원고의 준비 기간 동안 지원 로라 Bampton, 알렉스 데이비슨, 리차드 파튼, 아리타 아차에 감사하고 있습니다; 계란 활성화에 대한 토론 마리아나 Wolfner; 영상 지원을위한 매트 WAYLAND; 그리고 할머니 후 실험실에서 일반적으로 지원. 이 작품은 TTW 캠브리지, ISSF 대학 [허가 번호 097814]에 의해 지원되었다.

주의 : 다른 언급이없는 한 실온에서의 모든 단계를 수행. 1. 해부 준비 참고 : 여기에 설명 된 단계는 E. Gavis, 프린스턴 대학 &amp; 웨일 등에 따라 있습니다. 알. 18. 촬영하기 전에 다음 단계 이일을 수행합니다. <ol><li> 고형 식품의 약 10 ㎖를 함유하는 바이알 플라이를 가지고 하나의 코너 건조 효모를 소량 추가 1g 미만으로 충분하다. 참고 : 플라이 유리 병이나 음식에 대한 정보는 &#39;초파리 유지 보수&#39;(19)을 참조하십시오. </li><li> 효모를 수화 물 3 방울 - 1을 추가합니다. </li><li> 45 ° 각도로 옆으로 병을 설정하고 3 수 - 물을 차지하기 위해 효모 5 분. </li><li> 효모가 물을 흡수하는 동안, (최근에 등장하는 (GCaMP5라고 함) myristoy을 욕조-VP16GAL4에 의해 구동 UASt- MYR의 GCaMP5 (20)을 표현하는 파리의 병을 선택GCaMP5의 lated 양식) 난자의 세포막에 GECI 테 더링을 통해 대 잡음비가 높은 신호를 제공하도록 선택되었다. </li><li> CO 2 가스 병에 파리를 마취. 젖은 음식에 파리를 상실하지 않도록 반전 병을 유지해야합니다. </li><li> 공동 2 패드 위에 마취 파리 팁과 정렬 10-15 여성과 해부 현미경으로 붓을 사용하여 5 명의 남성. 참고 : 해부 건강한 여성을 제공하는 남성을 포함하는 표준입니다. </li><li> 단계 130에서 바이알이 준비되면, 바이알에 선택된 파리를 추가한다. 파리가 활성화 될 때까지 바이알 수평을 유지하도록주의하십시오. </li><li> 약 36 시간 동안 25 ° C에서 병을 놓습니다. </li><li> 병 또는 폐기에 대한 CO 2 패드에 남아있는 파리를 돌려줍니다. </li></ol> 2. 해부 초파리 난소 참고 : 여기에 설명 된 단계는 웨일 등에 따라 있습니다. 알. <s&gt; 18입니다. <ol><li> 36 시간 후, CO 2와 yeasted 유리 병에서 파리를 마취시키다. </li><li> 유리 병 안에 파리가 CO 2 패드에 그들을 팁 마취되면 해부 현미경 페인트 브러시로 분류된다. </li><li> 여성을 선택합니다. </li><li> 여성에서 두 개의 난소를 분리합니다. 전체 상세한 프로토콜의 웨일 등을 참조하십시오. 알. 18. 요약하자면: <ol><li> 호 1.5, 22 X 40mm의 coverslip에에 산소 할로 카본 오일 (시리즈 95)의 작은 방울을 넣습니다. </li><li> 복부의 앞쪽에 집게와 함께 여성을 잡고. </li><li> 해부 현미경으로 여성을 잡고 부드럽게 여성의 후방을 제거하기 위해 집게의 두 번째 세트를 사용합니다. </li><li> 두 번째 포셉의 후방 조직을 닦아냅니다. </li><li> 복부의 후방에 전방에서 두 번째 집게로 복부 구멍에 꽉. 두 불투명 난소 때 FEMA의 외부 집게에 충실해야르. </li><li> 오일에 난소를 터치합니다. </li><li> 포셉을 닦아 포셉에서 어떤 조직을 제거합니다. </li><li> 일 파리에서 세 된 커버를 얻기 위해 각 포함 난소 - 다음 단계 (2.4.7 2.4.1)를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 3. 분리 개인 성숙한 계란 <ol><li> 단계 2.4에서 첫 번째 커버 슬립에, 4X로 설정 배율 표준 해부 현미경에서 난관을 찢어하여 두 개의 난소를 분리합니다. </li><li> 모든 계란 챔버에 구멍 않도록주의하면서, 하나의 난소의 중심에 폐쇄 포셉 한 쌍을 소개합니다. </li><li> 다음 닫힌 집게로 난소의 중심에 표준 해부 프로브를 삽입합니다. </li><li> 조심스럽게 성숙한 계란 (단계 14 달걀 챔버)가 위치하는 후방 극으로 난소를 통해 해부 프로브를 끕니다. </li><li> 반복 3.1 단계 - 3.4 2-5 시간은 난소 및 계란의 수의 크기에 따라. 주 : CO 2의 추 </서브&gt; 일반적으로 미리 증착 된 달걀보다 상승 등의 부속에 크게 표시하는 단일 계란의 증착이 발생합니다. 이미 여성의 내부에 활성화되어 있기 때문에이 계란은 이미징 폐기해야합니다. 참고 : 성숙한 계란은 난소 결합 조직에서 쉽게 분리 할 가능성이 높다. </li><li> 더 성숙한 계란은 난소의 외부에서 볼 수없는 경우, 해부 프로브를 괴롭 히고 부드럽게 계속합니다. </li><li> 커버 슬립의 중심에 선 5 - 성숙한 계란은 난소의 외부 커버 슬립에 볼 수 있습니다되면, 3으로 이동합니다. 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 계란의 측면을 따라 부드럽게 프로브를 실행합니다. 참고 :이 계란을 손상시킬 수로 등의 부속 당겨하지 마십시오. 참고 : 미래 영상 설정에 따라 최대 이미징 영역에 대한 커버 슬립에 수직으로 약 200 μm의 떨어져 계란을 맞 춥니 다. </li><li> 정렬 된 후에는 F를 사용하여 정렬 된 계란에서 멀리 드래그하여 난소 조직의 나머지 부분을 제거orceps. </li><li> 의료 와이프의 모서리에 뿌리며 마치로 여분의 기름을 제거합니다. 의료가 손실됩니다 접촉 성숙 난자를 닦아와 성숙한 계란을 만지지 않도록주의한다. </li><li> 현미경 샘플의 위치를​​ 단순화하기 위해 마커로 커버 슬립에 십자선을 그립니다. </li><li> 안전한 장소에 커버 슬립을 설정하고 5 휴식을 커버 슬립에 준비된 달걀 챔버를 남겨 - 10 분. 계란은 기름에 정착하기 위해이 있습니다. 샘플은 1 시간 후 해부까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 그들에 난소와 커버 슬립의 나머지 3.11 - 반복 3.1 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 이미징 준비 <ol><li> 실온으로 준비 활성화 버퍼 (15)를 가져옵니다. 참고 : 활성화 버퍼는 저장성 버퍼이다 : 3.3 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 16.6 mM의 KH 2 PO 4, 10 mM의 염화나트륨, 50 mM의 KCl을 1로 pH 6.4로 가져, 5 % 폴리에틸렌 글리콜 8000, 2 mM의 염화칼슘 2 : NaOH를 5 비율 : KOH.자세한 내용은 Mahowald, 1983 참조 (15). 활성화 버퍼의 분취 량은 최대 2 주 동안 C 달 동안 4 °에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 이미징 시설에 준비 된 커버, 활성화 버퍼와 유리 피펫을 전송. 참고 : 넓은 필드, 공 초점, 회전하는 디스크 또는 광 시트 현미경을 사용할 수 있습니다. 우리는 거꾸로 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 우리의 대표적인 결과는 공 초점 현미경을 사용하여 얻었다. </li><li> 전체 성숙 난자를 영상화에 적합한 목적은 (여기 : 20X 0.7 NA)를 선택해야합니다. </li><li> 현미경 스테이지의 첫 번째 준비 커버 슬립을 마운트합니다. 무대에 커버 슬립을 깰 않도록주의하십시오. </li><li> 질적 활성화를위한 성숙한 계란 챔버와보기의 필드를 선택합니다. 이미지 구멍 계란 챔버 또는 막에에 blebbing와 그하지 마십시오. 참고 : 단계 4.6 - 4.7, 소프트웨어 명령 현미경 및 제조 업체에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 설정 이미징 파라(- 580 내지 500 nm) 표준 GFP 여​​기 (488 ㎚) 및 배출을위한 미터 거리에 있습니다. 또한 성숙한 계란과 변위 기름을 시각화하고 배향하기 위해 밝은 필드 뷰를 설정합니다. </li><li> 전체 Z - 스택을 성숙 계란이 볼 수있는 가장 낮은 Z-평면을 선택하고 설정하는 단계 당 40 μm의 약 2 μm의에 대해 수행한다. Z 스택 획득 사이에 지연이 없도록 매개 변수를 설정합니다. 약 30 분 동안 캡처하는 시간 시리즈를 설정합니다. </li></ol> 5. 이미징 예 생체 계란 활성화 <ol><li> 이미지 캡처를 시작합니다. </li><li> 2 완전 Z-스택을 취득 할 수 - 1 기다립니다. 이것은 활성화하기 전에 성숙 난자를 보여줍니다. </li><li> 유리 피펫으로 활성화 버퍼의 약 300 μl를 철회. </li><li> 그것이 성숙 난자 이미지화되는 바로 위에까지 커버 슬립 위에서 45도 각도로 활성 버퍼를 포함하는 유리 피펫의 끝을 위치 천천히 빔 경로에 피펫을 이동. 유리 피펫해야오일 위 2cm - 1 일. </li><li> 유리 피펫에서보다 5 초에 활성화 버퍼 2 방울 - 1을 추가합니다. 이 오일을 대체한다. 초과 활성화 버퍼를 추가하거나 성숙 난자의 변위를 일으킬 수있는 유리 피펫 계란을 만지지 마십시오. 이 목적과 커버 슬립 사이에 침지 기름에 형성 초점면 또는 기포의 변화를 일으킬 수있는 피펫으로 coverslip에 닿지 않도록주의하십시오. </li><li> 화상 취득 동안에 활성화 완충액을 첨가하는 동안, 오일이 활성화 완충액으로 치환되었음을 확인하기 위해 시야 채널을 확인한다. 참고 :이 처음으로 인해 빔 경로를 차단 피펫에 그림자로 나타납니다뿐만 아니라 작은 기름 방울의 모양에 발생합니다. 일부 기름 방울 실험 결과와 이미지 품질에 영향을 미칠 성숙한 난자와 관련된 상태를 유지 할 수 있습니다. </li><li> 5 - 오일이 활성화 버퍼 반복의 초기 또한 변위되지 않은 경우 5.4 단계0.6. </li><li> 오일을 성공적으로 변위되면, 시계열이 완료 될 때까지 실행하도록 허용한다. 참고 : 활성화에 난자의 붓기에, 일부 계란 챔버가 활성화 버퍼의 추가에 초점면 또는 시야에서 극적으로 이동합니다 인해. 이러한 상황에서, 획득을 중단하고 다음의 커버 슬립을 장착. </li><li> 이미지 시퀀스가​​ 인수를 완료 한 후, 데이터를 저장합니다. </li></ol> 6. 후 획득 이미지 처리 <ol><li> 피지 (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) 또는 등가의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 데이터 세트를 열고 분석 관련 파일을 선택한다. </li><li> 수집 된 데이터의 투영을 구축하기 위해 선택 : 이미지&gt; 스택&gt; Z-프로젝트를. </li><li> 시작 Z 슬라이스 및 정지 Z 슬라이스, 일반적으로 전체 섹션을 선택합니다. 일반적으로 &#39;최대 강도로 설정 투사형을 선택한다. 전체 시리즈에 선택한 설정을 적용 틱 상자 &#39;모든 시간 프레임&#39;을 선택합니다. </li><li> 만약하나 이상의 형광 채널은 복합을, 색상 간의 이동을 가능하도록 채널 도구를 사용하거나 이미지 그레이 스케일을, 몇 군데있다. 선택 이미지&gt; 색상&gt; 채널 도구입니다. </li><li> 이미지의 밝기를 조정하고 이미지를 선택 대비&gt;&gt; 밝기 / 대비를 조정합니다. </li><li> 하나의 이미지를 내보내려면, 관련 프레임을 선택 파일&gt; 다른 이름으로 저장&gt; JPEG, 또는 원하는 형식으로 날짜 표시 줄 슬라이더를 이동합니다. </li><li> 내 보낸 파일의 위치와 제목을 선택하고 저장합니다. 이미징 소프트웨어의 프레임 속도를 참고 화상에 타임 스탬프를 제공해야한다. </li><li> 동영상으로 시계열을 내보내려면 선택 파일&gt; 다른 이름으로 저장&gt; AVI는, 다음 (~ 초당 7 프레임) 프레임 속도를 선택합니다. </li><li> 내 보낸 파일의 위치와 제목을 선택하고 저장합니다. </li><li> 피지 형식으로 조정 된 파일을 저장하려면 파일&gt; 저장을 선택합니다. </li></ol>

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이 프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 성숙한 난자를 손상 없이 분리하는 것입니다. 이것은 해부 탐침으로 난자를 이방인이 조작함으로써 달성할 수 있습니다. 연습을 통해 알에 손상을 주지 않고 이 조작을 실행할 수 있습니다. 두 번째 중요한 단계는 활성화 완충액이 오일 속의 성숙한 난자에 적용될 때 샘플의 손실을 방지하는 것입니다. 활성화 완충액의 도포는 커버슬립과 접촉하지 않고 천천히 이루어져야 합니다. 현미경 설정으로 샘플에 쉽게 접근할 수 없는 경우 이 단계는 어려울 수 있습니다. 온도 인큐베이터와 같은 현미경의 겨드랑이 부분을 움직이는 것이 좋습니다. 
난자 활성화 시 Ca2+ 대신 다른 형광 태그 인자를 시각화하기 위해 이 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 보다 일반적으로, 초파리 발달의 다른 단계 또는 다른 완충액을 추가한 결과는 이 프로토콜을 사용하여 분석될 수 있습니다. 
현미경의 설정이 샘플의 신호를 시각화하는 데 최적이 아닌 경우 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 이는 레이저 출력을 늘리거나 줄이고, 캡처 범위를 변경하고, Z-스택 매개변수를 조정하여 달성할 수 있습니다. 또 다른 문제는 활성화 버퍼를 추가할 때 계란이 지속적으로 시야 밖으로 이동한다는 것입니다. 이런 일이 정기적으로 발생하면 성숙한 알이 15-20분 동안 커버슬립에 가라앉도록 하십시오. 점도가 높은 오일을 사용하면 활성화 완충제에 의한 오일의 변위가 변경됩니다. 
여기에 제시된 이 기술은 대물렌즈의 작동 거리, 성숙한 난자의 탈수 및 손상 없이 성숙한 난자를 해부하는 능력에 의해 제한됩니다. 그러나 성숙한 난모세포가 성인 암컷을 통과하여 침착되는 생 체 내 이미징 방법과 비교할 때 13, 우리의 방법은 더 많은 공간 해상도, 활성화 전에 성숙한 난자를 물리적으로 조작할 수 있는 옵션 및 수정 없이 난자 활성화의 역할을 테스트할 수 있는 능력을 가능하게 합니다. 
난자 활성화 시 세포 성분에 대한 리포터 구조를 테스트하고 돌연변이 배경에서 Ca2+ 파동을 시각화하는 것을 포함하여 이 기술의 잠재적인 미래 응용 분야가 많이 있습니다 14,24. 실험 및 유전 도구와 함께 여기에 제시된 생체 외 난자 활성화 분석은 보편적으로 보존된 Ca2+ 파동의 유발, 전파 및 다운스트림 효과를 연구할 수 있습니다.

계란 (난자) 활성화에서의 세포 내 칼슘의 변화 2+ 농도는 모든 연구 생물 1, 2의 보존 구성 요소입니다. 이 이벤트는 세포주기의 재개 및 저장의 mRNA의 번역을 포함한 칼슘 의존적 공정의 넓은 범위를 개시한다. 때문에 세포 내 칼슘 농도의 일시적인 변화를 시각화 칼슘이 요구 사항에 주요 관심이었다. 역사적으로, 모델 생물은 알의 크기와 가용성에 따라 계란 활성화에 대한 연구에 선정되었다. 다양한 시각화 방법을 포함 이러한 시스템에서 2 + 농도에 따라 세포 내 칼슘의 변화를 정량화하기 위해 사용되었습니다 송사리 3의 광 단백질의 쿼린을; 등의 Fura-2 성게와 햄스터 4,5에서와 같이 칼슘 민감한 형광 염료; 칼슘 - 녹색 1 덱스 트란 Xenopus의 6인치 생성 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 개선은 생체 내 7에 칼슘을 2 + 역학을 시각화 할 수있는 능력을 변형시켰다. 이러한 유전자 구조물은 특정 조직에서 발현 및 조직 침윤성 제제 8에 대한 필요성을 제한한다. GCaMPs 인해 높은 칼슘 친화력 매우 효과적이었다 GECIs의 녹색 형광 단백질 (GFP) 기반 클래스이며, 신호 - 대 - 잡음 비율 및 용량 9-11을 정의한다. 칼슘의 존재에서, GCaMP 착체, 칼 모듈 린에 칼슘의 결합으로 시작하고, 형태 적 변화를 겪는다 시리즈 그 GFP 성분 (9)의 형광 강도 향상을 초래한다. GCaMPs 광범위 세포 내 칼슘 (12)의 변화를 시각화하기 위해 초파리 신경 세포에 대한 연구에 사용되어왔다. 최근 applicati에성숙한 초파리 계란 2 + 칼슘을 시각화하는 GCaMP 기술에 계란 활성화 (13, 14)에서 단일 과도 칼슘 파를 밝혔다. 칼슘 2 + 웨이브는 생체 활성 분석 (13, 14)를 사용하여 생체 (13)에 배란 동안이나 높은 배율에서 낮은 배율로 시각화 할 수 있습니다. 생체 외 분석에서, 각각의 성숙 난자가 난소로부터 단리 및 저장성 용액을 사용하여 활성화되는, 생체 활성 15-17 사건 요점을 되풀이하는 것으로 나타났다 활성화 완충액이라. 이 생체 분석은 약물 중단, 물리적 조작과 유전자 돌연변이 등 다양한 실험 조건에서 칼슘 2 + 파의 쉬운 고해상도 시각화 할 수 있습니다. 이 문서에서는 생체 활성화 및 일에 대한 성숙한 초파리 계란의 준비를 보여줍니다GCaMP를 사용하여 칼슘 파를 시각화하는 데 사용되는 전자 후속 현미경. 이 방법은 칼슘 파의 개시 및 제어를 테스트하기 위해 하류 결과를 조사하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>건조 활성 효모</td><td>Fleischman' s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>다양한 작업</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec 광섬유</td><td>MF0-90</td><td>다양한 작업 의료</td></tr><tr><td>물티슈</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마커 펜</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen 유니버설, 블랙 - 대부분의 문구점에서 구입할 수 있습니다. 초미세 너비 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO2 패드</td><td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>할로 카본 오일, 시리즈 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>유럽 유통 업체 :</td><td></td></tr> <tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Halocarbon oil 대신 사용할 수 있음, 시리즈 95</td></tr><tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>이러한 도구는 깨끗해야하지만 오토 클레이브를 사용할 필요는 없으며 에탄올로 충분합니다.</td></tr><tr><td>프로브</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Fisherbrand,FB50251</td><td></td> <td>파스퇴르 피펫, 유리, 언플러그드, 길이 150mm&nbsp;</td></tr><tr><td>바이알</td><td>레지나 인더스트리</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

난자 활성화는 수정란이 감수분열을 완료하고 배아 발달을 시작할 수 있도록 하는 일련의 이벤트를 포함하는 보편적인 과정입니다. 조사된 모든 유기체에서 보존된 난자 활성화의 한 측면은 종종 'Ca2+ 파'라고 하는 칼슘(Ca2+)의 세포 내 농도의 변화입니다. Ca2+ 파의 진동 속도와 횟수는 종마다 다르지만 세포 내 Ca2+의 변화는 배아 발달에 필수적인 사건을 일으키는 데 핵심입니다. 이러한 변화에는 세포주기의 재개, mRNA 조절, 피질 과립 외세포작용 및 세포골격의 재배열이 포함됩니다.
성숙한 초파리 난자에서는 수정 전에 암컷 난관에서 활성화가 일어나 일련의 Ca2+ 의존적 사건을 시작합니다. 여기에서는 초파리에서 Ca2+ 파를 이미징하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 Ca2+ 파의 메커니즘 및 이와 관련된 다운스트림 변화를 조사하기 위한 조작 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

여기에서 우리는 생체 활성화 성숙한 초파리 계란을 준비하는 방법을 설명했다. 2 + 역학 계란 활성화에 칼슘의 GECI 수 있도록 이미징 및 배아 발달의 시작 (그림 1) 표현 계란입니다. GCaMP에 의존하는 것은 특별히 미리 스토 일 그룹의 존재는, 결과가 약간의 질적 차이 (13) (14)을 가지고 있고, 사용하는 것을 주목해야한다. 우리는 또한 액틴 중합 억제제의 첨가에 의해 난자 활성화 중에 기능성 액틴의 역할을 입증 한 사이토 D, 활성화 버퍼 (그림 2) 14. 계란 활성화의 세포 골격에 대한 요구 사항은 보존된다. C.에서 엘레는 시비 다음, 세포 골격 성분은 제 21,22 비대칭 분할을위한 하나의 세포 수정란을 제조 재구성된다. cytoskele의 성게에서, 중단탈 활성화 다음 다시 조직 수축성 고리 형성 (23)을 차단하여 세포주기에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 칼슘 파도와 초파리 계란 활성화에 다운 스트림 기능을 매개 굴지의 역할은 완전히 밝혀지지 남아있다. 초파리에서, 칼슘 파도 액틴 세포 골격의 공동 시각화이 생체 활성 분석을 이용하여 달성 될 수있다. 여러 채널의 시계열을 획득 할 수 있고, 세포 내 칼슘의 역학 난자 (도 3)에서 액틴 조직의 변화와 일치 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> 그림 1 :. 생체의 초파리 계란 활성화 시간 시리즈에서 단일 칼슘 웨이브는 후속 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리 달걀 성숙활성화 완충액 (AH)의 ddition. 세포질 칼슘의 증가는 2 + 약 1.5 μm의 / 초 평균 속도와 극부 (B) 및 전파 (BF)에서 유래. 파형의 개시는 일반적으로 활성화 완충액 첨가가 3 분 내에 관찰되었다. 활성화 후, 성숙한 난자의 세포 내 칼슘 농도는 레벨 (G, H) - 활성화 프리 되돌아 간다. 보충 영화 1 (총 시간 33 분)를 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> 그림 2 : 활성화 버퍼 교란 칼슘에 사이토 칼라 D의 추가2 + 웨이브 전파. 생체의 시간 시리즈는 10 μg의 / ㎖의 사이토 D 최종 농도 (AH)를 포함 활성화 버퍼 또한 다음 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2+ 파 극부 (A)에서 개시되는 동안,이 손상되고, 난자 (F)의 앞쪽에 도달하지 않는다 (백색 화살촉 웨이브의 전면을 나타낸다). 더 이상의 칼슘 변경) 30 분에 걸쳐 관찰되지 않았다. 보충 영화 2 (총 시간 30 분)을 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> 그림 3 : E에서 액틴과 칼슘의 공동 시각화생체의 초파리. 시간 시리즈 GG 정품 인증은 UASt- myrGCaMP5 (시안) 및 UASp -F-Tractin.tdTomato (마젠타) 활성화 버퍼의 다음과 같은 추가 (AH)를 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2 + 파가 극부에서 시작하고 그림에서와 같이 복구 1. 액틴, 흰색 화살촉 (H 대 A) 시간이 지남에 따라 변화하는 것으로 보인다. 성숙한 계란의 중심 칼슘 신호 검출의 부족은 촬상시의 시료의 이동에 기인한다. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다.

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 Drosophila melanogaster의 난자 활성화 과정 중 칼슘을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 난자 활성화 시 칼슘의 기원, 역학 및 하위 역할과 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 더 높은 공간 해상도를 제공하고, 활성화 전 성숙한 난자의 물리적 조작이 가능하며, 수정 없이 난자 활성화의 역할을 테스트할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 성숙한 난자를 손상 없이 분리하거나, 샘플을 손실하지 않고 성숙한 난자에 활성화 버퍼를 처리하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 해부 현미경의 배율을 4X로 설정하십시오. 첫 번째 커버슬립 위에서, 닫힌 포셉과 해부용 프로브를 사용하여 난관을 찢어 두 난소를 분리하되, 난포가 천공되지 않도록 주의하십시오.다음으로, 닫힌 핀셋 옆 난소 중앙에 표준 해부용 프로브를 삽입합니다. 성숙한 난자가 위치한 후극 방향으로 해부용 프로브를 이용하여 난소 내부를 부드럽게 긁어냅니다. 성숙한 난자들이 난소 밖 커버슬립 위에 보이면, 그중 3~5개를 중앙에 일렬로 배치합니다.다음으로, 정렬된 난자로부터 나머지 난소 조직을 끌어내어 제거합니다. 그런 다음, 의료용 와이프의 모서리로 톡톡 두드려 과도한 오일을 제거합니다. 현미경으로 시료의 위치를 찾을 수 있도록 마커를 사용하여 커버슬립에 십자선을 그립니다.그 후, 준비된 난실을 커버슬립 위에 5~10분 동안 그대로 두어 알들이 오일 속에 가라앉도록 합니다. 준비된 커버슬립, 실온의 활성화 완충액, 그리고 유리 피펫을 영상 촬영 시설로 가져갑니다. 성숙한 알 전체를 촬영하는 데 적합한 대물렌즈를 선택하십시오.그런 다음, 준비된 첫 번째 커버슬립을 현미경 스테이지 위에 고정합니다. 다음으로, 활성화를 위해 성숙한 난실(egg chamber)의 시야를 선택합니다. 표준 GFP 들뜸 및 방출을 위한 이미징 파라미터를 설정합니다.그 후, 성숙한 난자와 변위된 오일을 시각화하고 방향을 잡기 위해 명시야(bright field) 뷰를 설정하십시오. 이제 성숙한 난자가 보이는 가장 낮은 Z-평면을 선택하십시오. 그리고 2 µm 간격으로 40 µm 동안 전체 Z-스택(Z-stack)을 촬영하도록 설정하십시오.그런 다음, 30분 동안 이미지를 캡처하도록 타임 시리즈를 설정하십시오. 이 과정에서 이미지 캡처를 시작하고, 활성화 전의 성숙한 난자를 보여주기 위해 1~2개의 전체 Z-stack을 획득합니다. 다음으로, 유리 피펫으로 활성화 버퍼 약 300 µL를 취하십시오.활성화 완충액이 담긴 유리 피펫의 팁을 커버슬립 위 45도 각도로 위치시킨 후, 이미징 중인 성숙 난자 바로 위에 올 때까지 피펫을 빔 경로 안으로 천천히 이동시킵니다. 오일을 밀어내기 위해 5초 이내에 활성화 완충액을 한두 방울 첨가합니다. 한두 방울의 활성화 완충액 첨가는 정확한 각도에서 부드럽고 신속하게 이루어져야 합니다.이미지 획득 중에 활성화 버퍼(activation buffer)를 추가하면서, 명시야 채널을 확인하여 오일이 완전히 치환되었는지 확인하십시오. 오일이 성공적으로 치환되면, 타임 시리즈(time series)가 완료될 때까지 실행하십시오. 획득한 데이터의 투영 이미지를 생성하려면, 전체 섹션에 대한 시작 Z-슬라이스와 종료 Z-슬라이스를 선택하십시오.그 후, 최대 강도(maximum intensity)와 같은 투영 유형을 선택하십시오. 다음으로, '모든 시간 프레임(All time frames)' 확인란을 선택하여 선택한 설정을 전체 시리즈에 적용하십시오. 이미지의 밝기와 대비를 조정하려면 '이미지(Image)'를 선택한 다음 '조정(Adjust)'을 거쳐 '밝기/대비(Brightness/Contrast)'를 선택하십시오.시계열 데이터를 동영상으로 내보내려면 'File'을 선택한 다음 'Save As'를 누르고 'AVI'를 선택하십시오. 그 후 프레임 속도를 선택합니다. 여기에는 활성화 완충액을 첨가한 후 유전적으로 부호화된 칼슘 지표를 발현하는 ex vivo 성숙 Drosophila 난자의 시계열 영상이 나타나 있습니다.세포질 내 칼슘 농도의 상승은 후극에서 시작되며, 이후 초당 약 1.5 $\mu\text{m}$의 평균 속도로 전파됩니다. 파동의 시작은 일반적으로 활성화 완충액을 첨가한 후 3분 이내에 관찰됩니다. 활성화 이후 성숙한 난자의 세포 내 칼슘 수치는 회복됩니다.초파리에서는 이 ex vivo 활성화 분석법을 사용하여 칼슘 파동과 액틴 세포골격을 동시에 시각화할 수 있습니다. 흰색 화살표가 가리키는 것처럼, 액틴은 시간이 지남에 따라 변화하는 것으로 보입니다. 성숙한 난자의 중앙에서 칼슘 신호가 검출되지 않은 것은 이미지 캡처 중 시료가 움직였기 때문입니다.이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 전체 과정을 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 난자 챔버를 조작하고 획득 파라미터를 설정하는 과정에서 충분한 시간을 갖고 신중하게 진행하는 것이 중요합니다. 본 절차는 난자 활성화 시의 다른 형광 표지 단백질, 세포소기관 또는 칼슘 지표를 시각화하는 데에도 응용될 수 있습니다.이는 칼슘의 공급원 및 하위 효과에 관한 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 비디오는 유전적으로 암호화된 형광 리포터 단백질을 사용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 개별 뉴런에서 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. 이 연구는 기생충의 움직임을 이미징하고 뉴런에서 리포터 형광 비율을 측정하여 세포 내 칼슘 수치를 알을 낳는 동안 뉴런 활동 및 행동 변화와 상관시키는 단계를 간략하게 설명합니다.

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다.  이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

여기에서는 모델 선충 C. elegans의 생식계에서 발현되는 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터를 사용하여 수정 및 초기 배발생 중 칼슘을 시각화하기 위한 프로토콜과 도구를 제시합니다.

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

배우세요 Drosophila melanogaster 계란 활성화 과정에서 칼슘 역학을 시각화하는 ex vivo 이미징 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에서 칼슘 파동의 기원과 전파를 고해상도로 분석하는 데 활용됩니다.

에서 이미징 칼슘

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