에서 이미징 칼슘 초파리 계란 활성화에

이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila melanogaster에서 난자가 활성화되는 동안 칼슘을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 난자 활성화에서 칼슘의 공급원, 역학 및 다운스트림 역할이 무엇인지와 같은 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 더 높은 공간 해상도, 활성화 전에 성숙한 난자의 물리적 조작, 수정 없이 난자 활성화의 역할을 테스트할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 손상 없이 성숙한 난자를 분리하고 샘플을 잃지 않고 성숙한 난자에 활성화 완충액을 적용하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 해부 현미경의 배율을 4X로 설정합니다. 첫 번째 커버슬립에서 한 쌍의 닫힌 집게와 해부 프로브로 난관을 찢어 두 난소를 분리하고 난실에 구멍을 뚫지 않도록 주의합니다.

다음으로, 닫힌 겸자 옆의 난소 중앙에 표준 해부 프로브를 삽입합니다. 해부 프로브를 난소를 통해 성숙한 난자가 있는 후극 쪽으로 부드럽게 드래그합니다. 성숙한 난자가 난소 외부의 커버슬립에 보이면 3-5개를 중앙에 일렬로 움직입니다.

다음으로, 정렬된 난자에서 드래그하여 나머지 난소 조직을 제거합니다. 그런 다음 의료용 물티슈 모서리로 두드려 여분의 기름을 제거합니다. 마커가 있는 커버슬립에 십자선을 그려 현미경 아래에서 샘플을 찾습니다.

그 후, 준비된 난자를 커버 슬립에 그대로 두어 계란이 기름에 정착할 수 있도록 5-10분 동안 휴지시킵니다. 이미징 시설로 준비된 커버슬립, 실온 활성화 버퍼 및 유리 피펫을 가져옵니다. 전체 성숙한 난자를 이미징하는 데 적합한 대물렌즈를 선택합니다.

그런 다음 첫 번째로 준비된 커버슬립을 현미경 스테이지에 장착합니다. 다음으로, 활성화를 위해 성숙한 난자 챔버의 시야를 선택합니다. 표준 GFP 여기 및 방출에 대한 이미징 매개변수를 설정합니다.

그런 다음 성숙한 난자와 변위된 오일을 시각화하고 방향을 지정하기 위해 명시야 보기를 설정합니다. 이제 성숙한 난자가 보이는 가장 낮은 Z-평면을 선택합니다. 그리고 단계당 2마이크로미터에서 40마이크로미터에 대해 사용할 전체 Z 스택을 설정합니다.

그런 다음 30분 동안 이미지를 캡처하도록 시계열을 설정합니다. 이 절차에서는 이미지 캡처를 시작하고 활성화하기 전에 성숙한 난자를 보여주기 위해 1-2개의 전체 Z 스택을 획득합니다. 다음으로, 약 300마이크로리터의 활성화 버퍼를 유리 피펫으로 회수합니다.

활성화 버퍼가 포함된 유리 피펫의 끝을 커버슬립 위로 45도 각도로 배치하고 이미징되는 성숙한 난자 바로 위에 올 때까지 피펫을 빔 경로로 천천히 이동합니다. 오일을 대체하기 위해 5초 이내에 1-2방울의 활성화 버퍼를 추가합니다. 활성화 완충액 1-2방울을 추가하려면 올바른 각도로, 부드럽게, 신속하게 수행해야 합니다.

이미지 획득 중에 활성화 버퍼를 추가하는 동안 명시야 채널을 확인하여 오일이 변위되었는지 확인합니다. 오일이 성공적으로 변위되면 완료될 때까지 시계열이 실행되도록 합니다. 수집된 데이터의 투영을 작성하려면 전체 섹션에 대해 시작 Z 슬라이스와 정지 Z 슬라이스를 선택합니다.

그런 다음 프로젝션 유형(예: 최대 강도)을 선택합니다. 그런 다음 모든 시간 프레임 확인란을 선택하여 선택한 설정을 전체 시리즈에 적용합니다. 이미지 밝기와 대비를 조정하려면 Image(이미지), Adjust(조정), Brightness/Contrast(밝기/대비)를 차례로 선택합니다.

시계열을 동영상으로 내보내려면 파일, 다른 이름으로 저장, AVI를 차례로 선택합니다. 그런 다음 프레임 속도를 선택합니다. 여기에 표시된 것은 활성화 완충액이 추가된 후 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 생체 외 성숙 초파리 난자의 시계계열입니다.

세포질 칼슘의 상승은 후극에서 시작되어 초당 약 1.5마이크로미터의 평균 속도로 전파됩니다. 파동의 시작은 일반적으로 활성화 버퍼가 추가된 후 3분 이내에 관찰됩니다. 활성화 후에는 성숙한 난자의 세포 내 칼슘 수치가 회복됩니다.

초파리(Drosophila)에서는 칼슘파(calcium wave)와 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 공동 시각화(co-visualization)가 이 생체 외 활성화 분석법을 사용하여 달성할 수 있습니다. Actin은 흰색 화살촉으로 표시된 것처럼 시간이 지남에 따라 변화하는 것으로 보입니다. 성숙한 난자 중앙에서 칼슘 신호가 감지되지 않는 것은 이미지 캡처 중 샘플의 움직임 때문입니다.

일단 숙달되면 이 전체 기술을 적절하게 수행하면 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 난실 챔버를 조작할 때와 획득을 위한 매개변수를 설정할 때 시간을 할애하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차는 난자 활성화 시 형광으로 표지된 다른 단백질, 세포 기관 또는 칼슘 지표를 시각화하는 데 적용할 수 있습니다.

이는 칼슘의 공급원과 다운스트림 효과에 관한 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.