Name: 배양 된 세포를 세포 열 효과를 조사하기 위해 가열하는 연속파 툴륨 레이저 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 연속파 툴륨 레이저를 사용하여 배양된 망막 색소 상피 세포를 정밀하게 가열하는 방법을. 온도와 시간을 정확히 제어하여 세포의 열 반응을 재현 가능하게 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) (부여 # 13GW0043C)와 유럽 우주 항공 연구 개발국 (EOARD, grant # FA9550-15-1-0443)의 연구비 지원에 의해 지원되었으며,

1. RPE 세포 배양 <ol><li> 돼지 눈에서 RPE 세포 분리 <ol><li> 지역의 도축장에서 새롭게 적출 된 돼지 눈을 구하십시오. 차가운 곳 (4 ° C)과 어두운 곳에서 보관하십시오. </li><li> 가위로 세포 외 조직을 제거하고 눈을 소독액에 5 분간 담근다. </li><li> 사용하기 전 칼슘과 마그네슘이없는 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS (-))에 눈을 넣으십시오. </li><li> 메스를 사용하여 각막 윤부 후방 약 5 mm에서 공막을 관통시킵니다. 각막 윤부와 평행하게 모든 방법을 통해 가위로 절단하여 눈 앞부분 전체를 절제하십시오. </li><li> 눈 앞부분 ( 즉, 각막과 렌즈)과 유리체를 제거하십시오. PBS (-) 1 ML을 추가하고 부드럽게 신경 망막을 제거합니다. 참고 :이 "안구 컵"은 공막, 맥락막 및 RPE로 구성되어 이제 준비되었습니다. </li><li> P에서 예열 된 (37 ° C) 0.25 % 트립신 추가BS (-)를 아이 컵에 넣으십시오. 아이 컵의 약 80 %가이 트립신 용액으로 채워지도록 볼륨을 조절하십시오. </li><li> 37 ° C에서 10 분 동안 5 % CO 2 배양기에서 트립신 용액으로 아이 컵을 배양하십시오. </li><li> 인큐베이터에서 아이 컵을 제거하고 0.05 % 트립신 + 0.2 % ethylenediaminetetraacetic 산 tetrasodium 소금 (EDTA · 4N)와 PBS (-) 솔루션과 0.25 % 트립신 솔루션을 대체하십시오. 45 분 동안 인큐베이터에서 아이 컵을 품어 라. 참고 : 45 분 후 RPE 세포는 Bruch의 막에 느슨하게 부착되거나 이미 분리되어 트립신 -EDTA 용액에 부유합니다. </li><li> 부드러운 pipetting하여 RPE 세포를 수집합니다. 10 % 돼지 혈청, 항생제 / antimycotic 및 나트륨 pyruvate (1 MM)를 포함하여 문화 매체 (L - 글루타민과 DMEM 높은 포도당), 10 ML으로 가득 원뿔 튜브에있는 세포와 솔루션을 수집합니다. 참고 : 혈청은 트립신의 효과를 중화시킬 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기실온에서 5 분 동안 400 xg에서 세포 현탁액. </li><li> 뜨는을 제거하고 신선한 매체 10 ML을 추가합니다. 같은 조건에서 5 분 동안 다시 원심 분리하십시오. </li><li> 세포 농도가 5 x 10 5 세포 / ML (hemocytometer를 사용하여 세포를 계산하여 결정) 결과에 따라 뜨는을 제거하고 새로운 매체를 추가합니다. 부드러운 pipetting하여 잘 섞는다. </li><li> 세포 현탁액을 세포 배양 접시에 분배하십시오. 직경 60mm의 배양 접시 당 3ml를 사용하십시오. 참고 :이 배양을 통로 영 (P0)이라고합니다. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 세포를 유지하십시오. 매 2 일마다 조정 된 배지의 반을 새로운 배지로 변경하십시오. </li><li> 합류하는 경우 이관 (1.2 단계). </li></ol></li><li> RPE 세포 배양의 계대 <ol><li> 배양액을 제거하고 PBS (-)로 세포를 두 번 헹구십시오. </li><li> 0.05 % 트립신 + 0.2 % EDTA와 PBS (-) 솔루션으로 세포를 품어5 % CO 2 배양기에서 37 ℃로 5 분간 배양 하였다. </li><li> 부드러운 pipetting하여 RPE 세포를 분리하고 10 % 돼지 혈청을 포함한 10 ML의 매체로 가득 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 수집하십시오. </li><li> 상온에서 5 분 400 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 뜨는를 제거하고 세포 농도 5 X 10 5 세포 / ML (hemocytometer와 셀 수를 계산하여 결정) 만들기, 새로운 문화 매체를 추가합니다. 단계 1.1.13에서 설명한대로 새로운 60mm 직경의 문화 요리에 세포를 배포합니다. 참고 : 세포 배양 물은 이제 1 번 관절입니다 (P1). </li><li> confluency에 도달 한 후, 단계 1.2.1-1.2.5에서 설명한 동일한 절차를 사용하여 P1 문화를 P2로 subculture. P2 문화에서 60mm 직경의 문화 요리 대신 작은 문화 요리 (30mm 내경)에 세포를 뿌리십시오. </li><li> 실험을 위해서는 P2 또는 P3 배양 물을 사용하십시오. </li></ol></li></ol> 2. Thulium 레이저 조사 <ol><li> 조사 스테이션의 건설 <ol><li> 툴륨 레이저 장치 (1.94 μm, 전력 범위 : 0-20 W)를 0.22 NA, 365 μm 코어 직경의 광섬유에 연결하십시오. </li><li> 조사 스테이션의 수직 금속 포스트에 수평으로 고정 된 금속 팔에 섬유 팁을 기계적으로 고정합니다. 레이저 섬유의 끝이 세포 배양 접시가 조사하는 동안 배치되는 뜨거운 접시 위에 위치하고 있도록 수직 게시물을 놓습니다. </li><li> 핫 플레이트에 흰 종이를 놓고 조준 광선을 켜십시오 (λ = 635 nm, 최대 = 1 mW, 종이 레벨에서 지름 ≈ 30 mm). 백혈구에 조준 광선의 주위를 표시하여 배양 접시가 방사선 조사 중에 놓이는 위치를 알 수 있도록하십시오. 참고 : 섬유 팁의 z- 평면은 변경 가능할 수 있습니다. 추가 이미징 광학이 없으면, 세포 배양면의 레이저 스폿 직경은 섬유 팁 아래 12cm에 위치한다.약 30mm로 세포 배양 접시의 내경과 거의 동일하다. 설정의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg"> 그림 1 : 툴륨 레이저 조사 스테이션의 개략적 인 이미지. 배양 접시는 가열판에 놓는다. 세포는 트럼륨 레이저 섬유 팁 아래 12cm에 위치하여 빔 크기가 배양 접시 (약 30mm)의 내경과 거의 동일하게됩니다. 레이저 조사 절차는 맞춤형 시스템 설계 플랫폼의 시간 제어 루틴에 의해 제어됩니다. 조사 설정 프로그램을 시작하기 전에 전원 설정을 결정해야합니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <olstart> 세포 배양의 레이저 조사 <ol><li> 조사 1 시간 전에, 배지를 완전히 새로운 배지 1.2 mL로 교체한다. 참고 : 이것은 중요한 단계이므로 엄격히 준수해야합니다. </li><li> 깨끗한 벤치에 조사 스테이션 ( 예 : 핫 플레이트 및 레이저 파이버를 고정 할 포스트)을 놓습니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 꺼내 핫 플레이트의 표시된 위치에 놓습니다 (2.1.3 단계). </li><li> 보호 안경을 착용하십시오. 툴륨 레이저를 켭니다. 레이저 장치에서 원하는대로 전원을 설정합니다 (0 - 20W에서 조정 가능). 방출을 켜십시오. </li><li> 레이저 조사 및 타이밍 프로토콜 (보충 파일)을 제어하는 ​​시스템 설계 플랫폼을 시작하십시오. </li><li> 배양 접시를 핫 플레이트에 놓은 직후 "pre-heating time"을 클릭하여 140 초 동안 타이머를 시작합니다 ( "예열 시간 1"). 이것은 배지 온도를 3 ℃로 유지할 것이다.조사 전 7 ° C. 참고 : 140 초 후에 삐 소리가 켜지고 다음 타이머 ( "예열 시간 2")가 자동으로 8 초를 시작합니다. 이 8 초 동안, 심사관은 문화 요리를 열 수 있습니다. 148 초의 예열 후, 세포 배양에 10 초간 레이저 조사가 자동으로 수행됩니다. 응급 상황이 발생하면 즉시 레이저를 멈추기 위해 레이저 장치에 강제 종료 버튼을 장비하십시오. 이것은 중요한 단계이며 반드시 지켜 져야합니다. 특별한주의 사항은 8 초의 예열 시간이 시작될 때, 조사 직전에 접시의 덮개를 여는 것과 관련이 있습니다. 덮개를 열면 매체 표면이 매우 빨리 냉각 될 수 있습니다. </li><li> 조사 후 즉시 문화 접시에 다시 커버를 놓고 추가 7 초 동안 뜨거운 접시에 문화 접시를두고 37 ° C 5 % CO 2 배양기에 다시 놓습니다. </li></ol><li> 온도 분포 측정세포 수준 (온도 교정) <ol><li> 세포가없는 30mm 직경의 배양 접시의 4면 (90 °마다)의 바닥에 가까운 작은 구멍 (직경 약 300 μm)을 만듭니다. 분젠 버너로 가열 한 바늘 (20G)의 끝 부분을 사용하십시오. 구멍을 외부로부터 절연 테이프로 밀봉하고 미세 바늘로 작은 구멍을 만들어 방수 조건에서이 구멍을 통해 미세한 열전대 (직경 200 μm) 만 삽입되도록하십시오. </li><li> 배양 접시 바닥면의 바깥쪽에 2 개의 수직 직경을 그리고 교차점 ( 즉, 바닥면 중앙)을 좌표 영 (0)으로 설정합니다. 선을 따라 각 방향으로 요리 ( 즉, 0, 3, 6, 9, 12 및 15 mm) 외부로 방사형으로 3 mm마다 표시합니다 ( 그림 2 , 파란색 점). 점수는 총 21 점이어야합니다. </li><li> 세포 배양 접시에 1.2 mL의 새로운 배지를 채 웁니다. 문화 d 배치37 ° C에서 핫 플레이트에 올려 놓고, 옆 구멍에 미세한 열전대 (직경 200 μm)를 삽입하고 표시된 민감한 팁을 측정 할 표시된 위치에 놓습니다. </li><li> 보호 안경을 착용하십시오. 툴륨 레이저를 켜고 레이저 장비의 전원을 수동으로 설정합니다 (0.1W 단위로 0W에서 20W 사이). 참고 : 온도 보정의 경우 전원을 3W 단위로 측정하면 충분합니다. </li><li> 시스템 설계 플랫폼을 켜고 "Start Temp.Aquisition"버튼 (보충 파일)을 클릭하여 온도 측정을 시작하십시오. </li><li> 2.2.6 단계와 동일한 절차를 수행합니다. 참고 : 제어 프로그램은 삽입 된 열전쌍의 온도를 100ms마다 측정하고 GUI에서 조사 도중 온도 진행을 표시합니다. </li><li> 21 개의 모든 측정 지점과 다른 전원 설정에 대해이 절차를 수행하십시오. 모든 포인트와 모든 파워 셋팅에 대해 전체 과정을 3 번 반복하십시오.신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수 있습니다. </li><li> 온도 데이터를 csv 데이터로 내 보내면 결국 스프레드 시트로 변환 될 수 있습니다. 각 포인트에서 3 회 측정을 위해 조사가 끝날 때 최대 온도를 평균화합니다. 동일한 원에있는 점의 평균값입니다 (중심점을 제외한 총 4 점). </li><li> 그래프에서 얻은 평균 최대 온도를 플롯하여 접시의 중심으로부터의 거리 (mm)를 x 축으로하고 온도 증가 (ΔT, ° C)를 y 축으로합니다. 수학적 소프트웨어 프로그램의 fit 함수를 사용하여 가우시안 모델을 원시 데이터에 맞 춥니 다. 가우스 피팅 온도 분포를 만듭니다. </li></ol></li><img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg"> 그림 2 : 하나의 세포 배양 접시에서 온도 보정을위한 요점. 온도 데이터는 중앙 및 5에서 측정되었다.방사형 점 4 가지 각도 이상 (파란색 점). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 3. 열 방사선 조사 후의 세포 반응에 대한 생물학적 평가 <ol><li> 다양한 전원 설정 및 세포 사망 문턱치의 결정에 따라 세포 생존력 ( 즉, 생존, 세포 사멸 및 사멸) 평가 <ol><li> 표시된 시점 ( 즉, 방사선 조사 후 3, 24 및 48 시간)에 PBS (-)로 세포를 씻고 시판중인 키트를 사용하여 제조 회사의 지침에 따라 세포 생존력 ( 즉, 중요 세포, 사멸 세포, 죽은 세포)을 평가합니다. 실험 계획안. </li><li> fluorescein isothiocyanate (FITC) - anexin V 5 μL, ethidium homodimer III 5 μL, Hoechst 33342 5 μL를 1x binding buffer 100 μL에 첨가하여 염색 용액을 준비하십시오.구성 요소). 세포를 덮기에 충분한 염색 용액을 준비하십시오. 15 분 동안 세포를 품어. </li><li> 결합 버퍼로 두 번 세포 배양을 씻어 PBS (-)로 바인딩 버퍼를 교체하고 형광 현미경의 무대에서 문화를 설정합니다. </li><li> 빛의 경로를 접안 렌즈로 전환하고 4 ', 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) 필터를 선택하고 조명 등을 켜고 4x 대물 렌즈로 초점을 맞춘 평면을 찾으십시오. </li><li> 카메라의 빛 경로를 변경하고 현미경 이미징 소프트웨어에서 컴퓨터 화면의 이미지를 찾은 다음 초점을 조정합니다. </li><li> 전체 세포 배양 접시의 형광 이미지를 얻기 위해 스티치 기능 ( 즉, 접시에 여러 이미지를 기록하고 단일 대형 이미지를 만드는 기능)을 사용하여 현미경 특유의 소프트웨어를 사용하십시오. DAPI, FITC 및 tetramethylrhodamine (TRITC)의 3 가지 필터 세트를 사용하여 Hoechst 33342 양성 세포 (모든 세포 핵), FITC-annexin V-positive 세포 (apoptotic), ethidium homodimer III- 양성 세포 (죽은 세포)가있다. </li><li> 죽은 (ethidium homodimer III 양성) 부위의 반경 (mm)과 염색 된 세포 배양에서의 apoptotic (annexin V- 양성) band-form 부위의 외경 / 내경을 측정하십시오. 해당 반경 설정 값에 맞는 온도 분포의 가우스 함수를 적용하십시오. 세포 사멸 및 세포 사멸 변화를위한 임계 온도를 명확히하기 위해 죽은 또는 apoptosis 영역의 림에서 정확한 온도를 계산하십시오. </li></ol></li></ol></olstart>

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온도와 관련된 생물학적 세포 반응을 논의 할 때, 대부분의 생화학 적 과정은 시간에 의존하기 때문에 온도뿐 아니라 증가 된 온도의 지속 시간도 중요합니다. 특히 안과에서 레이저로 유발되는 고열의 경우 밀리 초에서 초까지의 짧은 시간 범위로 인해 정확한 온도 제어로 세포 열 효과를 조사하기가 어렵습니다. 따라서, 세포 배양 모델 및 엄격한 온도 및 시간 제어를 가능하게하는 조작 시스템에 적합한 레이저 조사 장치가 요구된다. 단백질 발현이나 분비와 같은 열 노출 후 세포 반응의 생물학적 평가는 충분한 수의 영향을받는 세포에 대해 반복적으로 정량적 평가가 필요합니다. 이것은 임상 치료에서와 같이 직경이 수백 마이크로 미터 인 레이저 스폿을 사용하는 연구에 장애가되고 있습니다. 단일 레이저 지점에서의 정량 분석은 매우 유용합니다.rdensome. 이 연구에서는 가능한 한 이러한 요구를 충족시키기위한 시도가 이루어졌다. 조사 제어 프로그램과 함께 1.94 μm 파장의 연속파 두륨 레이저를 사용함으로써, 짧은 시간 내에 전체 세포 배양에...

온도 의존성 세포 생물학적 반응을 이해하는 것은 성공적인 고온 치료에 매우 중요합니다. 안과에서 사용되는 열 레이저로 망막 레이저 광응고술은 의학에서 가장 잘 알려진 레이저 치료법 중 하나입니다. 주로 녹색에서 노란색 파장의 가시 광선이 망막 레이저 치료에 사용됩니다. 빛은 망막 색소 상피 (RPE) 세포에서 멜라닌에 의해 많이 흡수되며 망막의 최 외각 세포 단층을 형성합니다. 여러 종류의 망막 장애에 대한 새로운 치료 전략으로 매우 가벼운 열 방사선 (sub-visible photocoagulation)에서 의사와 연구자들 사이에 최근의 관심이있었습니다 1,2 . 이러한 추세에 따라, 우리의 관심은 온도 조절 광열 요법 (TC-PTT)이라는 정확한 온도 조절하에 RPE 세포를 치사 적으로 가열하는 것에 있습니다. 최근 옵토우리 연구소의 음향 기술은 망막의 조사 된 부위에서 온도 증가를 실시간으로 측정 할 수있게 해주었습니다. 이로써 조사 중 온도 상승을 제어 할 수 있습니다 3 . 그러나 온도를 측정하고 조절할 수 없기 때문에 RPE 세포를 준 사염 적으로 가열함으로써 망막의 치명적이지 않은 고열이 이전에 고려되지 않았기 때문에 열 레이저 조사 후 RPE 세포의 온도 의존 세포 반응은 지금까지 연구 된 적은 거의 없다. 더욱이, 온도차는 상세하게 논의되지 않았을뿐만 아니라 준 치명적 및 치명적 조사 후에 살아남은 세포의 세포 행동의 차이도 또한 상세하게 논의되지 않았다. 따라서 TC-PTT 기반 치료법에 대한 과학적 증거를 수집하기 위해 우리는 온도 의존적 ​​인 RPE 세포 생물학적 반응 및 시험 관내 실험 장치를 사용하여 그 기전을 밝혀내는 것을 목표로한다. t그의 목적은 다음과 같은 조건을 충족시키는 세포 가열 장치를 확립하는 것이 필요하다 : 1) 빠른 온도 증가 가능성, 2) 정확한 시간 및 온도 제어, 3) 생물학적 실험을위한 비교적 많은 수의 검사 세포 . 가열 방법과 관련하여, 주파수가 두 배로 증가한 Nd.YAG 레이저 (532 nm)와 같은 임상 레이저는 불행히도 세포 배양 가열에 적합하지 않습니다. 이는 배양 된 RPE 세포에서 멜라노 좀의 수가 크게 감소했기 때문입니다. 레이저 광 흡수는 불균일 할 수 있으며 세포 수준에서의 온도 증가는 동일한 복사 전력으로 조사 된 경우에도 실험간에 가변적입니다. 몇몇 이전의 연구는 실험 5 , 6 전에 배양 세포에 의해 탐식 된 추가 멜라노 좀의 사용 또는 조사 4 동안 접시 바닥 아래에 검은 종이의 사용을보고했다. 많은온열 플레이트, 수 욕조 또는 온도 설정이 7 인 CO2 배양기를 사용하여 고열로 유발 된 세포 반응을 평가하기위한 시험 관내 생물학적 연구가 수행되었습니다. 이러한 방법은 원하는 온도에 도달하는 데 약간의 시간 ( 즉, 몇 분)이 걸리므로 가열 시간이 길어야합니다. 또한, 이러한 방법을 사용하면 세포 수준에서 상세한 열 이력 (시간에 온도를 곱한 값)을 얻는 것이 어렵습니다. 또한, 하나의 배양 접시에서 상이한 위치의 세포들 사이의 온도는 가변 온도 확산으로 인해 다를 수있다. 생물학적 세포 반응이 온도의 증가와 온도의 지속 시간에 의해 결정적으로 영향을받을지라도, 대부분의 경우 고온 치료 중이 시간 및 공간 온도 정보는 생물학적 분석을 위해 고려되지 않았습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 conti여기에 nuous-wave thulium 레이저를 사용하여 세포를 가열했다. 툴륨 레이저 방사 (λ = 1.94 μm)는 물에 의해 강하게 흡수되며, 배양 접시의 바닥에있는 세포는 열확산을 통해 단독으로 열 자극을 받는다. 365-μm 직경의 레이저 섬유는 배양 접시 위에서 약 12cm 위에 놓았으며 그 사이에는 광학 장치가 없습니다. 레이저 광선의 직경은 배양 접시 표면의 배양 접시 (30mm)의 내경과 거의 동일하게 발산한다. 배양액의 양이 일정한 경우 세포의 온도 상승을 조사 할 수있다 높은 반복성. 가변 출력 설정은 최대 20W의 조사가 가능하며 세포 수준의 중간 온도는 10 초 동안 ΔT ≈ 26 ° C까지 증가 할 수 있습니다. 조사 조건을 변경함으로써, 레이저 빔 프로파일을 변경하여 온도 분포를 변화시킬 수있다문화 요리에. 예를 들어, 현재의 연구 에서처럼 가우스 형태의 온도 분포로 또는 균질 한 온도 분포로 조사하는 것이 가능합니다. 후자는 치명적이지 않은 온도 증가에 대해서는 온도 의존성 세포 반응의 효과를 조사하는데 유리하지만 세포 사멸 스트레스 또는 상처 치유 반응에는 유리하지 않을 수있다. 전체적으로, 툴륨 레이저 조사는 상이한 열 노출 후에 유전자 / 단백질 발현, 세포 사멸 동력학, 세포 증식 및 세포 기능 발달과 같은 여러 종류의 생물학적 요인을 조사 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 - 고혈당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>사용하기 전에 (2)-(4)를 추가하십시오. 37 &deg에서 따뜻하게; C 사용 전 수조.</td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액 (100 &times;)</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td>10,000 단위 페니실린, 10 mg 스트렙토 마이신 및 25 &mu를 포함; g 암포테리신 B 1mL. 사용하기 전에 500mL 중간 크기의 병(1)에 5.5mL를 넣으십시오.</td></tr><tr><td>피루브산나트륨 (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td>사용 전 500 mL 중간 크기 병(1)에 5.5 mL 첨가 (최종 농도: 1 mM)돼지</td></tr> <tr><td>혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C-500ML</td><td>사용 전 500 mL 배지 병(1)에 50 mL 첨가 (최종: 10%)</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>돼지 췌장에서 추출한 트립신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-25G</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>ED-100G</td><td></td></tr><tr><td>인간 VEGF 퀀티킨 ELISA 키트</td><td>R& D 시스템</td><td>DVE00</td><td></td></tr><tr><td>Oxiselect 총 글루타티온 분석 키트</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>STA-312</td><td></td></tr><tr><td>세포사멸/괴사/건강한 세포 검출 키트</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA707-30018</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thulium laser</td><td>Starmedtec GmbH</td><td>Prototype</td><td>0-20 W</td></tr><tr><td>365 mm 코어 직경</td><td>파이버 레이저 구성 요소 독일</td><td>CF01493-52</td><td></td></tr><tr><td>열전대</td><td>Omega Engineering Inc</td><td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td><td></td></tr><tr><td>가열판</td><td>MEDAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate 리더 ( 분광형광계)</td><td>분자 장치</td>: <td>Spectramax M4</td><td></td></tr><tr><td>세포 균질화기</td>, <td>QIAGEN</td>, <td>TissueLyser, LT</td><td></td></tr>, <tr><td>형광 현미경</td>, <td>Nikon</td><td>ECLIPSE, Ti</td><td></td></tr>, <tr><td>수학 소프트웨어 프로그램</td>, <td>The Mathworks. Inc</td><td>MATLAB 릴리스 2015b</td><td></td></tr><tr><td>시스템 설계 플랫폼</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td></tr></tbody></table>

배양 된 세포를 세포 열 효과를 조사하기 위해 가열하는 연속파 툴륨 레이저

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

생물학적 평가를 위해 1.94 μm 연속파 툴륨 레이저를 사용하여 배양 된 세포를 가열하는 독창적 인 방법을 소개합니다. 툴륨 레이저 방사는 물에 강하게 흡수되며 배양기 바닥의 세포는 열 확산을 통해 가열됩니다. 365 μm의 직경을 가진 레이저 섬유는 배양 접시의 약 12 ​​cm 위에 놓여 있으며, 레이저 빔 직경은 배양 접시 (30 mm)의 내경과 거의 동일합니다. 각 실험에서 일관된 양의 배양 배지를 유지함으로써 재현성 높은 온도 증가로 세포를 조사 할 수 있습니다. 각각의 파워 세팅을 위해 하나의 세포 배양 접시에서 온도 증가 및 그 분포를 보정하기 위해, 온도는 상이한 위치 및 세포 수준에서 10 초 동안 조사되었다. 온도 분포는 수학 그래픽 소프트웨어프로그램, 문화 격판 덮개의 맞은 편에 그것의 본은 가우스 모양에서이었다. 레이저 조사 후, 온도 의존성 세포 반응을 평가하기 위해 상이한 생물학적 실험을 수행 할 수있다. 이 원고에서 생존 염색 (생존, 세포 자멸 및 사멸 세포 구별)은 시간 경과에 따른 세포 사멸 및 사망의 역치 온도를 결정하는 데 도움이됩니다. 이 방법의 장점은 전체 세포 배양 접시에서 가열 세포의 고효율뿐만 아니라 온도 및 가열 시간의 정확성입니다. 또한, 컴퓨터 운영 체제로 잘 제어 할 수있는 다양한 온도 및 시간 간격으로 학습 할 수 있습니다.

다양한 전원 설정 후 온도 분포 각 단일 조사에 대한 모든 온도 변화는 온도 보정에서 모니터링되었습니다. 이 데이터로부터 측정 된 점에서 최대 온도가 구해지고 T max (℃)로 정의됩니다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 배양 접시가 가열판에 놓인 시점에서 프로그램을 수행 하였다. 37 ° C에서 안정된 중간 온도를 보관하는 데 필요한 140 초의 "예열 시간 1"후 8 초의 예열 시간 2 동안 배양 접시의 덮개가 제거되었습니다. "예열 시간 2"가 끝나면 레이저 방출이 자동으로 시작됩니다. 이 곡선은 10 초 조사의 대표적인 온도 진행입니다. 조사 동안, 온도는 증가하였고, 레이저 방출 직후꺼지면 온도가 내려 가기 시작했습니다. 배양 접시의 중심에서 최대 온도는 본 연구에서 T ma...

1.94 μm 연속파 레이저 방사를 사용하여 배양 접시에서 세포를 가열하는 독창적 인 실험 장치를 소개합니다. 이 방법을 사용하여 다양한 열 노출 후 망막 색소 상피 세포 (RPE)의 생물학적 반응을 조사 할 수 있습니다.

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

이 절차의 전반적인 목표는 배양된 세포를 정밀한 온도 및 시간 제어로 가열하여 체외에서 열 선량에 따른 세포의 생물학적 반응을 연구하는 것입니다. 이 방법은 망막 레이저 치료 연구와 같이 온열요법에 대한 세포 또는 조직의 반응을 조사하는 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 빠른 가열과 가열 지속 시간을 정밀하게 제어하여 실험 중에 높은 재현성 있는 열 노출을 허용한다는 것입니다.이 방법은 열 레이저 조사에 대한 배양된 망막 색소 상피 세포의 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암세포와 같은 다른 모델에도 적용할 수 있습니다. 우리는 가시광선 레이저 광으로 멜라닌 함유 세포를 가열할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 그러나 이로 인해 색소 침착의 변화로 인해 온도 프로파일이 다양해졌습니다.절차를 시작하려면 깨끗한 벤치의 조정 가능한 금속 실험실 스탠드에 핫 플레이트를 놓습니다. 핫플레이트를 섭씨 39도로 설정합니다. 코어 직경이 0.22마이크로미터인 365NA 광섬유를 스탠드의 수평 암에 고정합니다.금속 암을 핫 플레이트 위에 놓고 파이버 팁이 핫 플레이트에서 12cm 위에 있도록 스탠드를 조정합니다. 1.94마이크로미터 20와트 툴륨 레이저를 365나노미터 1밀리와트 조준 빔과 파이버 팁에 연결합니다. 핫 플레이트에 직경 30mm의 배양 접시를 놓습니다.핫 플레이트 표면에서 접시의 둘레를 조심스럽게 추적한 다음 접시를 제거합니다. 조준 빔을 켜고 핫 플레이트의 빔 스폿 중심이 추적된 원과 일치할 때까지 스탠드를 조정합니다. 그런 다음 조준 빔을 끕니다.온도 보정 절차를 시작하려면 분젠 버너로 20게이지 바늘 끝을 가열합니다. 가열된 바늘 끝으로 직경 30mm의 배양 접시를 90도 간격으로 4개 지점에서 바닥에 가깝게 뚫어 직경 약 300마이크로미터의 구멍을 만듭니다. 구멍 위에 전기 테이프를 붙입니다.가는 바늘을 사용하여 각 구멍을 덮고 있는 테이프에 약 200마이크로미터 직경의 구멍을 뚫습니다. 배양 접시의 아래쪽에 180도 떨어진 각 구멍 쌍 사이에 선을 그립니다. 선의 교차점에서 시작하여 각 선을 따라 반경 방향으로 3mm마다 표시하여 21개의 측정 지점을 지정합니다.그런 다음 섭씨 1.2도로 예열된 정확히 37ml의 신선한 배양 배지를 접시에 넣습니다. 접시를 덮고 핫 플레이트의 추적된 원으로 접시를 놓습니다. 직경 200마이크로미터의 열전대를 레이저 제어 컴퓨터에 연결하고 온도 교정 프로토콜을 엽니다.열전대를 접시의 구멍 중 하나에 삽입하여 팁이 표시 위치 중 하나의 접시 바닥에 오도록 합니다. 온도는 깊이에 따라 달라질 수 있으므로 열전대의 끝이 측정된 정밀도로 접시 바닥에 닿는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 배양 배지가 섭씨 37도에서 안정화될 때까지 기다립니다.그런 다음 툴륨 레이저를 켜고 레이저 출력을 원하는 시작 수준으로 설정합니다. 예열 시간이 140초와 8초로 설정되어 있는지 확인한 다음 예열 조사 시퀀스를 시작합니다. 140초 후 신호음이 들리면 즉시 배양 접시의 덮개를 제거합니다.예열이 끝나고 10초 조사가 진행될 때까지 기다립니다. 그런 다음 즉시 접시를 덮으십시오. 이런 식으로 21개 표시 위치에서 온도를 측정합니다.이 절차는 레이저 출력 범위에 걸쳐 3와트 전력 간격으로 각각 세 번 수행합니다. 완료되면 툴륨 레이저를 끕니다. 온도 데이터를 내보내고 분석합니다.실험에 앞서, 30 직경의 배양 접시에서 배양 렌탈 색소 상피 세포를 배양했습니다. 세포 배양을 5% 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도로 유지하고 살아있는 세포 이미징 시스템을 사용하여 확인합니다. 방사선 조사 1시간 전에 각 접시의 배양 배지를 정확히 1.2ml의 신선한 배양 배지로 교체하십시오.배양물을 인큐베이터로 반환합니다. 조사 스테이션이 준비되었고 핫 플레이트가 섭씨 39도로 설정되어 있는지 확인합니다. 방사선 조사를 시작할 준비가 되면 원하는 출력으로 툴륨 레이저를 시작합니다.실험 프로토콜을 열고 예열 시간이 140초와 8초로 설정되어 있는지 확인합니다. RPE 세포 배양액을 열판의 표시된 위치에 있는 밀폐된 접시에 놓고 즉시 140초 및 8초 예열 조사 시퀀스를 시작합니다. 140초 예열 후 접시 덮개를 제거하십시오.예열이 끝나고 10초 조사가 진행될 때까지 기다립니다. 즉시 접시를 덮고 7초 동안 기다린 다음 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 증가하는 레이저 출력 레벨에서 추가 샘플을 조사합니다.완료되면 툴륨 레이저를 끕니다. 세포 생존율 평가를 시작하려면 방사선 조사된 세포를 PBS로 세척합니다. 살아있는 세포사멸세포와 괴사세포를 구별할 수 있는 키트를 구합니다.그런 다음 저조도에서 500 마이크로 리터의 결합 완충액을 25 마이크로 리터의 ethidium homodimer-3, FITC annexin 및 Hoechst 33342와 결합하십시오. 이 염색 용액의 세포를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 1X 결합 버퍼로 셀을 두 번 세척합니다.결합 완충액을 PBS로 교체하고 DAPI, FITC 및 TRITC 필터가 있는 형광 현미경의 스테이지에 세포를 놓습니다. 현미경 광 경로를 접안 렌즈로 설정하고 DAPI 필터를 선택합니다. 조명 조명을 켜고 4X 대물 렌즈로 초점 평면을 찾습니다.현미경 카메라에 대한 광 경로를 설정합니다. 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지의 중심을 잡고 초점을 맞춥니다. DAPI 필터를 사용하여 이미지 획득을 위한 매개변수를 정의합니다.FITC 및 TRITC 필터를 사용하여 초점 프로세스와 이미지 획득 설정을 반복합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 사용하여 접시 전체에 걸쳐 3개의 필터 세트가 있는 여러 이미지를 획득하고 이를 전체 배양 접시의 단일 이미지로 결합합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 세포사멸 및 세포 사멸에 대한 온도 임계값을 측정합니다.세포 배양 접시 중앙에서의 최대 온도 증가와 레이저 출력 사이의 비례 관계는 설명된 열 보정 절차에 의해 결정되었습니다. 그런 다음 세포 배양 접시를 가로지르는 최대 온도 분포를 가우스 함수에 맞췄습니다. 방사선 조사 후 세 가지 염색 패턴이 관찰되었습니다.섭씨 43도 이하의 온도에 노출된 배양에서는 생존 능력 변화가 관찰되지 않았습니다. 세포사멸은 섭씨 47도에서 방사선 조사 3시간 후에 처음 관찰되었습니다. 세포 사멸은 섭씨 51도 이상 후 3시간 이후에 관찰되었습니다.그런 다음 세포사멸 및 세포 사멸에 대한 평균 임계값 온도는 측정된 사멸 및 세포사멸 영역의 반경 평균을 온도 분포를 설명하는 가우스 함수에 적용하여 결정되었습니다. 이 절차에 따라 다양한 레이저 프로파일, 스폿 크기 및 조사 시간과 같은 다양한 조건에서 방사선 조사를 수행할 수 있습니다. 이는 세포 수준에서 개별 시간 지정 온도 원인과 관련된 질문을 이해하고 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 온도와 시간을 잘 제어하여 세포 배양을 가열하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이는 다양한 열 조사 조건에 대한 생물학적 반응을 연구할 수 있는 가능성에 달려 있을 수 있습니다. 레이저로 작업하는 것은 눈과 피부에 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.레이저 조사 안전 교육에 대한 정보를 확인하십시오. 이 절차를 수행할 때는 항상 적절한 보안경, 실험복 및 장갑을 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 이와 같은 강력한 광열 치료 에이전트 기능, 구조에 의존 형광 자기 담금질 독특한 광열 속성이 porphysomes라는 새로운 내장 다기능 nanovesicles을 개발. 우리는 고압 압출을 사용하여 porphysomes을 공식화하고 이종 이식 종양 모델에서 자신의 광열 치료 효과를 조사 하였다.

한 분, Porphysomes를 사용하여 하위 한 와트 광열 종양 절제, 내장 다기능 Nanovesicles

MRI 호환 주문 설계된 레이저 기반의 가열 장치는 특히 종양 영역에서 감온 리포좀 제제로부터의 방출을 활성화하기 위해 피하 종양 국소 가열을 제공하기 위해 개발되었다.

자기 공명 이미지 지침에 열성 리포좀에서 시스플라틴의 트리거 된 릴리스를위한 맞춤 설계 레이저 기반의 가열 장치

유로퓸 thenoyltrifluoroacetonate (EuTFC)가 활성화 온도 효율 강하게 감소 612 nm의 광에서 발광 라인을 갖는다. 이 재료의 박막으로 코팅 된 샘플은 마이크로 이미징 경우 612 nm의 발광 강도 응답 샘플 표면 온도를 직접 맵으로 변환 될 수있다.

유로퓸 킬레이트 발광 코팅을 사용하여 고해상도 열 마이크로 이미징

이 방법은 수직 표면 하의 결함을 찾는 것을 목표로합니다. 여기서 우리는 레이저를 공간 광 변조기와 결합시키고 비디오 입력을 트리거하여 고분해능 열 화상을 얻는 동안 2 개의 반대 위상 변조 선으로 결정 성있게 시료 표면을 가열합니다. 결함 위치는 열파 간섭 최소값을 평가하여 검색됩니다.

레이저 조사 형 광열 열 분석을 이용한 구조 가열에 의한 지층 결함 국산화

여기에 제시된 자기 조립을 통한 산화철 나노입자 껍질 마이크로버블(NSM)의 제조를 위한 프로토콜이 제시되어, 자기 고열증 및 광열 병용 암 치료를 위한 하나의 나노치료 플랫폼에서 자기 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 시너지 효과를 낼 수 있다.

자기 고열증 및 포토열 조합 암 치료를 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

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체외(In Vitro ) 티타늄 실린더에 사용되는 Er, Cr : YSGG 및 다이오드 레이저의 효과 평가

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배양 된 세포를 세포 열 효과를 조사하기 위해 가열하는 연속파 툴륨 레이저

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