생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

이 절차의 전반적인 목표는 In Vitro 및 In Vivo에서 각막 내피-중간엽 전이의 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이 방법은 각막 내피 재생 분야에서 각막 내피-중간엽 전이에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 In Vitro 및 In Vivo 모델 모두에 적용할 수 있다는 것입니다.

그리고 조작하기 쉽습니다. 이 기술의 함의는 각막 내피-중간엽 전이와 관련된 질병 치료로 향하는 경향이 있습니다. 예를 들어, 형성과 같은, 모델은 각막 내피-중간엽 전이의 과정을 억제하는 것을 선택하는 데 사용될 수 있기 때문입니다.

절차는 실험실의 기술자 인 Jung-Shen Chang 양이 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 부피당 10%의 포비돈 요오드 용액으로 신선한 소 눈을 3분 동안 소독합니다. 그런 다음 PBS로 씻으십시오.

메스와 가위로 각막을 채취하고 PBS로 씻는다 해부 현미경으로 Descemet의 막을 집게로 벗겨낸다. 그 후, Descemet's Membrane을 섭씨 37도의 트립신 1ml에 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 5분 동안 112배 g에서 원심분리하여 소 CEC를 수집합니다.

원심분리 후 1ml의 SHEM에 세포를 다시 현탁시킵니다. 6cm 접시에 세포를 파종하고 SHEM에서 배양합니다. 그 후, 섭씨 37도에서 5%CO2로 세포를 배양하고 3일마다 배양 배지를 교체합니다.

세포가 합류점에 도달하면 PBS로 씻으십시오. 그런 다음 섭씨 37도의 트립신 1mm에 5분 동안 배양합니다. 112회 g에서 5분 동안 원심분리하여 수집합니다.

5분 후, 세포 펠릿을 1mm의 SHEM에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 혈구계에서 세포를 계수합니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 커버 슬라이드에 세포를 파종하고 SHEM에서 세포를 배양합니다.

Maramastat의 ENMT 억제 효과를 조사하기 위해 배양 배지에 10 micromolar Maramastat를 사용하여 SHEM의 세포를 배양하고 3일마다 배양 배지를 교체합니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 250마이크로리터의 4% 파라포름알데히드로 표시된 시점에 세포를 고정합니다. 그 후, 250 마이크로 리터의 0.5 % 트리톤 X-100으로 5 분 동안 투과시킵니다.

그리고 30분 동안 10% BSA로 차단합니다. 그 후, ABC, 달팽이, 슬러그에 대한 1차 항체가 있는 세포를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, PBS로 매번 15분 동안 세포를 두 번 세척합니다.

그리고 Alexa Fluor 접합 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 밀리리터당 2마이크로그램의 DAPI로 세포를 덮어 세포핵을 역염색합니다. PBS로 매번 15분 동안 세포를 두 번 세척합니다.

그리고 면역형광 이미지를 얻기 전에 페이딩 방지 마운팅 솔루션으로 장착하십시오. 12주 된 수컷 SD 쥐를 마취한 후 동물의 피부를 부드럽게 꼬집어 피부 경련이 없을 때 적절한 마취를 확인합니다. 그런 다음 0.5% 프로파라카인 하이드로클로라이드를 쥐의 오른쪽 눈에 한 방울 떨어뜨려 통증과 눈 깜빡임 반사를 최소화합니다.

그 후, 테트라사이클린 연고를 왼쪽 눈에 바르면 각막 건조를 예방할 수 있습니다. 그런 다음 스테인리스 스틸 프로브를 액체 질소로 냉각합니다. 스테인리스 스틸 프로브를 오른쪽 눈의 중앙 각막에 30초 동안 적용합니다.

각막 건조를 예방하기 위해 시술 중 오른쪽 눈에 PBS를 자주 주입하고 섬모 경련으로 인한 안구 통증 완화 및 감염 예방을 위해 1일 1회 냉동 손상 직후 0.1% 아트로핀과 0.3% 겐타마이신 설페이트를 도포합니다. 절차가 끝나면 열 램프를 사용하여 쥐를 따뜻하게 유지하고 운동 제어를 회복 할 때까지 회복을 관찰하십시오. 회복 기간 동안 각막 건조를 방지하기 위해 오른쪽 눈에 테트라사이클린 연고를 바르고 3일 연속으로 각막 냉동 손상 절차를 반복합니다.

마라마스타트(Maramastat) 또는 염기성 FGF를 쥐의 눈 내부로 전달하려면 마취된 쥐의 오른쪽 눈에 0.5% 프로파라카인 하이드로클로라이드(Proparacaine Hydrochloride)를 한 방울 떨어뜨려 통증과 눈 깜빡임 반사를 최소화합니다. 다음으로, 멸균 PBS로 안구 표면을 세척합니다. 작동 현미경으로 1mm 주사기에 부착된 30 게이지 바늘을 홍채와 평행한 평지의 평지에 삽입하여 전방부 천자를 수행합니다.그런 다음 바늘 경사를 위로 돌리고 각막 상처를 약간 눌러 수액을 배출하고 안압을 낮춥니다.

0.02ml의 약물을 camerally로 주입하고 바늘을 빼내는 동안 면봉으로 바늘 요를 부드럽게 압박합니다. 이 그림은 소 CEC 및 배양의 위상차 이미지를 나타냅니다. 합류 시 세포의 육각형 모양은 세포가 세포 분리 중에 각막 기질 섬유아세포에 의해 오염되지 않았음을 나타냅니다.

소 CEC의 체외 배양 동안 ABC, 달팽이 및 민달팽이의 핵 전좌가 14일까지 감지되었습니다. 이 그림은 브로드 스펙트럼 MMP 억제제인 Maramastat가 In Vitro 배양 소 CEC의 ENMT 과정에 미치는 영향을 보여줍니다. 다음은 냉동 손상 후 쥐의 외부 눈 사진과 음반 내 주사입니다.

사진은 기본 FGF 주사 후 감소된 각막 부종을 보여줍니다. 반면 Maramastat는 기본 FGF 단독에 비해 각막 부종을 더 감소시켰습니다. 그리고 이 그림은 동결 손상 후 ABC에 대한 항체를 사용하여 쥐 각막의 면역 염색을 한 후 극장내 주사를 한 것을 보여줍니다.

ABC의 핵 전좌는 PBS 그룹에서 관찰되며 기본 FGF 그룹에서 크게 증가하여 Wnt Beta-catenin 신호 전달 및 ENMT 프로세스의 활성화를 나타냅니다. 마라마스타트에 이어 기본 FGF인 상원내 주사 후 ABC의 핵 염색이 감소하여 마라마스타트의 ENMT 억제 효과를 시사합니다. 개발 후 이 기술은 각막 내피-중간엽 전이, 체외 및 생체 내 분야의 연구자들을 위한 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 소의 각막 내피 세포를 분리하는 방법과 각막 냉동 손상 및 원내 주사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다