Name: 생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 배우세요 각막 내피 세포-중간 엽 전이 메커니즘을 생체 외 및 생체 내 모델에서 연구하는 방법을. 소 각막 내피 세포 원발 배양과 랫트 동상 손상 모델을 활용하여 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

기술 지원에 대해 National Taiwan University Hospital 의학 연구과 Second Core Lab 직원들에게 감사드립니다.

모든 절차는 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 문에 연구를위한 협회 부여 본 연구에서 다음과 국립 대만 대학 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 격리, 차 문화의 제조 및 소 CECs의 면역 염색 <ol><li> 로컬 도살장에서 신선한 소 눈을 획득. </li><li> 3 분 동안 10 %의 v / w 포비돈 요오드 용액에 눈 소독. 인산염 완충 식염수 (PBS) 솔루션을 씻으십시오. </li><li> 무균 조건에서 메스와 가위로 각막 버튼을 수확. 해부 현미경 집게로 껍질 데스 메막 (이 연구에서 그주의, 소 눈은 로컬 도살장에 의해 적출 된, 따라서 첫 번째 연구 절차는 실험실에서 preenucleated 눈의 소독이었다). </li><li> 시도 1 ㎖에 데스 메 막을 품어30 분 동안 37 ° C에서 psin. 5 분 112 XG에서 원심 분리하여 소 CECs를 수집합니다. 보충 호르몬 상피 매체 (SHEM) HEPES 완충 둘 베코 변형 이글 배지와 5 % 소 태아 혈청이 보충 된 햄 F12 배지, 0.5 % 디메틸 술폭 시드, 인간 표피 2 ng를 / ㎖의 동일한 양을 함유하는 1 ml의 세포를 재현 탁 성장 인자, 5 밀리그램 / 인슐린 ㎖, 5 밀리그램 / 트랜스페린 ㎖, 5 NG / 셀레늄 ㎖, 콜레라 독소의 1 nmol의 / l, 50 밀리그램 / 젠타 마이신 ㎖, 1.25 밀리그램 / 암포 테리 신 B의 용액 </li><li> 6 형상 접시에 세포 (안구 당 ​​약 1 × 105 세포)를 시드. 셈 문화를. 공기 중 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션 접시. 3 일마다 배지를 변경합니다. </li><li> 세포가 합류점에 도달하면, PBS로 씻어, 5 분 동안 37 ° C에서 트립신 1 ㎖ 그들을 부화. 5 분 112 XG에서 원심 분리를 수집합니다. 셈 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. <ol&gt; <li> 혈구의 세포를 계산합니다. A A 24 웰 플레이트에 웰 당 1 × 104의 밀도, 문화 셈의 셀에서 커버 슬라이드에 세포를 시드. 타틴의 EnMT 억제 효과를 조사하는 경우, 타틴의 μM이 배양 배지에 첨가 10 SHEM에서 세포를 배양하고, 3 일마다 배양액을 변경합니다. </li></ol></li><li> 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 250 ㎕를, pH가 7.4으로 지시 된 시점에서 세포를 고정한다. 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 250 ㎕를 함께 Permeabilize 하시려면. 30 분 동안 10 %의 소 혈청 알부민으로 차단. </li><li> 밤새 4 ℃에서 활성 베타 - 카테닌 (ABC), 달팽이와 민달팽이에 대한 일차 항체와 세포를 품어. 200 : 사용 된 일차 항체의 희석은 1입니다. 항체는 10 mM의 PBS, 1 %의 v / w 소 혈청 알부민 및 0.09 % w / V의 아 지드 화 나트륨으로 구성된 항체 희석제로 희석된다. </li><li> 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 세척하고, 품어1 시간 동안 실온에서 (항체 희석액 100 1) 알렉사 형석 접합 이차 항체 m. </li><li> 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 2 μg의 / ml의 세포를 피복하여 세포 핵 Counterstain과 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 씻어 장착 용액을 안티 페이드로 마운트. </li><li> 20X 목적 배율 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 405 및 488 nm의의 여기 파장에서 면역 형광 이미지를 얻습니다. </li></ol> 2. 쥐 각막 내피 Cryoinjury 모델 및 내원시 주입 <ol><li> 2 % 자일 라진 (5.6 ㎎ / ㎏) 및 tiletamine 플러스 zolazepam (/ kg 18 mg)을 근육 주사이 12 주령의 수컷 흰쥐를 마취. 가볍게 피부 경련의 부재하에 적절한 마취를 확인하기 위하여 동물의 피부를 끼우는. </li><li> 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화하기 위해 각 쥐의 오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염 한 방울을 주입. 주입왼쪽 눈에 테트라 사이클린 연고는 각막 건조를 방지합니다. </li><li> 액체 질소 스테인레스 스틸 프로브 (직경 = 3 mm)를 냉각. 30 초간 오른쪽 눈의 중심 각막 스테인리스 프로브를 적용한다. 자주 각막 건조를 방지하는 절차 중 우측 눈에 PBS를 주입. </li><li> 즉시 cryoinjury 후 0.1 % 아트로핀 및 0.3 % 황산 젠타 마이신을 주입 매일 한번 섬모 경련으로 인한 안구 통증을 완화하고, 감염을 방지 할 수있다. <ol><li> 시술 후, 래트를 가열 램프를 이용하여 보온, 그들은 모터 제어를 회복 할 때까지 마취 회복 후에도 15 분마다 관찰. 또한 회복 기간 동안 각막의 건조를 방지하기 위해 우안에 테트라 사이클린 연고를 적용한다. </li></ol></li><li> 3 일 연속 각막 cryoinjury를 반복합니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 쥐 눈의 전방 챔버로 타틴 또는 bFGF를 전달 들어, 래트를 마취. 한 방울을 주입오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염의 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화합니다. </li><li> 멸균 PBS와 안구 표면을 관개. 홍채에 위의 평행 한 평면에 paralimbal 맑은 각막에 1 ML의 주사기에 부착 된 30 G 바늘을 삽입하여 운영 현미경으로 전방 천자를 수행합니다. </li><li> 바늘이 최대 베벨 켜고, 약간 약간의 방수를 배출하고 안압을 줄이기 위해 각막 상처를 우울. 에 각막 약 0.02 mL의 주입. 조심스럽게 바늘을 철수하는 동안면 끝이 바늘 관을 압축합니다. </li><li> 운영 현미경 지시 된 시점에서, 외부 눈 사진. </li></ol> 3. 수확 쥐 각막 버튼과 면역 염색 <ol><li> 래트를 안락사하려면 안락사 챔버에 배치 분당 챔버 부피 10-30 %의 충전 속도로 100 % CO 2 달이다. 에 대한 CO 2 주입 유지호흡의 부족 및 머 금고 눈 색깔 후 추가 분. </li><li> 날카로운 블레이드와 윤부에서 쥐의 눈을 침투. 윤부를 따라 각막 가위로 각막을 잘라. 슬라이드에 각막을 평평하게. 각막이 꼬고 경우 추가 반경 방향 절개를합니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 250 ㎕를, pH가 7.4으로 각막을 수정. 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 250 ㎕를 Permeabilize 하시려면로, 30 분 동안 10 %의 소 혈청 알부민으로 차단. </li><li> (1)의 희석 4 ° C에서 하룻밤 ABC에 대한 일차 항체로 각막을 품어 : (200) 항체 희석액에. 15 분 동안 PBS로 두 번 씻어 각막 및 이차 항체로 배양 한 1 시간 동안 실온에서 (1 항체 희석제 100). 셀 2 μg의 4 / ㎖ &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌로 세포를 피복함으로써 핵 및 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 씻어 Counterstain과. </li><li> 설치 솔루션을 방지 페이딩의 각막을 탑재합니다. 산부인과20X 대물 확대 한 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 면역 (405)의 여기 파장 및 561 nm의 이미지를 주석 박. </li></ol>

<ol><li>Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+the+fluid+pump+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The location of the fluid pump in the cornea.</a> J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).</li>
<li>Joyce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+capacity+of+the+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferative capacity of the corneal endothelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).</li>
<li>Morishige, N., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bullous+keratopathy+as+a+progressive+disease%3A+evidence+from+clinical+and+laboratory+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies.</a> Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).</li>
<li>Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophakic+bullous+keratopathy%3A+relationship+with+endothelial+cell+density+and+use+of+a+predictive+cell+loss+model.+A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report.</a> Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).</li>
<li>Wilson, S. E., Lloyd, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+its+receptor%2C+basic+fibroblast+growth+factor%2C+transforming+growth+factor+beta-1%2C+and+interleukin-1+alpha+messenger+RNA+production+in+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).</li>
<li>Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta2+in+aqueous+humor+suppresses+S-phase+entry+in+cultured+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).</li>
<li>Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA%3A+a+promoter+of+proliferation+in+human+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).</li>
<li>Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+corneal+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth of human corneal endothelial cells in culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).</li>
<li>Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+endothelial+cell+expansion+for+corneal+endothelium+transplantation%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview.</a> Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).</li>
<li>Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+in+human+corneal+endothelial+cells+cultured+from+young+and+older+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors.</a> Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).</li>
<li>Ko, M. K., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+FGF-2+on+type+I+collagen+expression+during+endothelial+mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).</li>
<li>Lee, H. T., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-2+induced+reorganization+and+disruption+of+actin+cytoskeleton+through+PI+3-kinase%2C+Rho%2C+and+Cdc42+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells.</a> Mol Vis. 9, 624-634 (2003).</li>
<li>Pipparelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Enhances+Adhesion+and+Wound+Healing+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells.</a> PloS one. 8 (4), e62095(2013).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li>
<li>Jakobiec, F. A., Bhat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrocorneal+membranes%3A+a+comparative+immunohistochemical+analysis+of+keratocytic%2C+endothelial%2C+and+epithelial+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins.</a> Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ZEB1+and+Snail1+in+excessive+production+of+extracellular+matrix+in+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+on+primate+corneal+endothelial+cell+survival+in+vitro+by+a+ROCK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).</li>
<li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li>
<li>Ho, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Matrix+Metalloproteinase+Activity+Reverses+Corneal+Endothelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+and+fibronectin+synthesis+by+retrocorneal+fibrous+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signal+Regulates+Corneal+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+Inhibitor+Eye+Drop+Accelerates+Corneal+Endothelium+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).</li>
<li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier%3A+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li>
</ol>

저자는 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

CECs는 세포 증식 동안 EnMT를 받아야하는 그들의 성향 알려져있다. 치료 목적 EnMT 처리를 억제하기위한 전략을 개발하려면 EnMT기구의 완전한 이해가 필요하다. 우리는 EnMT, 체외 배양 모델 쥐의 각막 내피 세포의 cryoinjury 모델, 즉 소 CEC를 조사하기 위해이 모델을 설명했다. 우리의 결과는 두 모델의 EnMT 과정을 보여 주었다. 또한, 타틴의 EnMT 억제 효과는이 두 모델은 동일한 메커니즘을 공유 할 것을 제안, 두 모델에서 재현되었다. 체외 배양 모델의 소 CEC는 조작의 용이성을 제공합니다. 또한, 이전의 연구 (17, 18)에 사용되는 체외 배양 모델에서 인간 영장류 또는 CEC 비해 소의 눈을 더 크고 더 확보하기 쉽게하고, 따라서 더 CECs 사용할 수있다. 우리의 연구에서, 우리는 지역 도살장에서 세포핵이 제거 된 소의 ...

각막 내피 세포(CEC)는 적극적인 펌핑을 통해 각막 기질의 수분 상태를 조절함으로써 각막의 투명도를 유지하여 시력을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. 인간 CEC의 증식 잠재력이 제한되어 있기 때문에 세포 수는 나이가 들면서 감소하며, 손상 후 각막 내피 상처의 복구는 일반적으로 세포 유사분열보다는 세포 확대 및 이동을 통해 이루어집니다2. CEC 수가 약 500 cells/mm2의 임계값 이하로 감소하면 각막 기질의 탈수 상태를 유지할 수 없어 수포성 각막병증 및 시력 손상이 발생합니다3,4.
인간 CEC의 제한된 증식 잠재력은노화 세포에서 표피 성장 인자와 그 수용체의 발현 감소5, 수액 내 항증식성 TGFβ26, 접촉 억제2,7 등 여러 요인에 기인합니다. 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 일부 성장 인자는 배양된 인간 각막 내피에서 증식을 증가시킬 수 있지만, 배양 효율은 여전히 제한적입니다8,9. 또한, CEC는 생체 외 확장 중에 상피-중간엽 전이(EMT)10-13과 유사한 표현형 변화를 겪을 수 있습니다. EnMT(Endothelial-mesenchymal transition)는 세포 접합 불안정화, 정점-기저 극성 손실, 세포골격 재배열, 알파 평활근 액틴 발현 및 I형 콜라겐 분비를 특징으로 합니다14. 이러한 모든 특성은 CEC의 정상적인 기능을 폐지하여 조직 공학에서 체외 배양 CEC의 사용을 방해할 수 있습니다. 또한, EnMT는 Fuchs 내피 각막 이영양증(endothelial endecal dystrophy) 및 후각막막 형성(retrocorneal membrane formation)을 포함한 여러 각막 내피 질환의 발병기전과 관련이 있습니다15,16. 따라서 EnMT의 메커니즘을 이해하면 EnMT 프로세스를 조작하는 데 도움이 될 수 있으며 CEC를 재생하여 유능한 기능을 수행할 수 있습니다. 
이 연구에서는 각막에서 소 CEC를 분리하는 방법을 설명했습니다. 1차 in vitro 배양에서는 표현형 변화, β-catenin의 핵 전좌, EMT 조절자 달팽이와 민달팽이를 포함한 EnMT 과정이 관찰되었습니다. 우리는 쥐 각막 내피 동결 손상 모델을 사용하여 생체 내에서 EnMT를 시연하는 방법을 추가로 설명했습니다. 이 2가지 모델을 사용하여 광범위한 MMP(Matrix, 기질단백분해효소) 억제제인 마리마스타트(marimastat)가 EnMT 과정을 억제할 수 있음을 입증했습니다. 설명된 프로토콜은 EnMT 메커니즘에 대한 자세한 분석과 추가 임상 적용을 위해 EnMT 프로세스를 조작하기 위한 전략 개발을 용이하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>트립신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형된 Eagle 매체와 Ham's F12 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>인간 표피 성장 인자</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>인슐린, 트랜스페린, 셀레늄&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>111219</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>marimastat</td><td>Sigma</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>항활성 베타 카테닌 항체</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>항달팽이 항체</td><td>Santa cruz</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>항민달팽이 항체</td><td>Santa cruz</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>염소 항마우스 IgG (H+L) secondary </td> 항체 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>소 CECs</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td><td>쥐 각막 내피</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체</td>의 ABC 염색 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td> : <td>달팽이 및 소 CEC</td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>염색 생명공학</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>xylazine&nbsp;</td><td>바이엘</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>틸레타민 플러스 졸라제팜</td><td>Virbac</td><td>N/A</td><td>동물용 약물</td></tr><tr><td>프로파라카인 하이드로클로라이드 안과 용액</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>동물용 약물</td></tr><tr><td>0.1% 아트로핀</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>임상 약물&nbsp;</td></tr><tr><td>0.3% 겐타마이신 설페이트</td><td>Sinphar 그룹</td><td>N/A</td><td>임상 약물&nbsp;</td></tr><tr><td>기본 섬유아세포 성장 인자</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>임상 약물&nbsp;</td></tr></tbody></table>

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

각막 내피 세포(CEC)는 활발한 펌핑을 통해 각막의 투명도를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. CEC 수치가 감소하면 각막 부종이 발생하고 시력이 저하될 수 있습니다. 그러나 인간 CEC는 증식 가능성이 손상되기 쉽습니다. 또한, 세포 성장 자극은 점진적 내피-중간엽 전이(EnMT)에 의해 복잡해지는 경우가 많습니다. 따라서 EnMT의 메커니즘을 이해하는 것은 유능한 기능을 가진 CEC의 재생을 촉진하는 데 필요합니다. 본 연구에서는 각막에서 Descemet's membrane으로 CEC를 벗겨내어 소 CEC의 1차 배양을 준비하고, 소 CEC가 in vitro 배양에서 표현형 변화, β-catenin의 핵 전좌, EMT 조절인자인 달팽이와 민달팽이를 포함한 EnMT 과정을 나타냈음을 입증했습니다. 또한 쥐 각막 내피 냉동 손상 모델을 사용하여 in vivo에서 EnMT 프로세스를 시연했습니다. 총체적으로, 소 CEC의 체외 1차 배양 및 생체 내 쥐 각막 내피 냉동 손상 모델은 EnMT의 메커니즘을 조사하는 데 유용한 플랫폼을 제공합니다.

소 CECs의 분리 후, 세포를 시험관 내에서 배양 하였다. (1)가 소 CECs의 위상차 이미지를 보여주고있다. 합류 셀의 육각형은 세포가 세포 분리 동안 각막의 간질 섬유 아세포에 의해 오염되지 않은 것으로 나타났다. (2)는 지정된 시점에서 ABC, 달팽이와 민달팽이에 대한 항체를 이용하여 수행 한 면역 염색을 보여주고있다. 외에도 체외 배양 표현형 변화에서, ABC 및 EMT 레귤레이터 대응 핵 전위가 관찰되었다.도 3은 시험 관내 배양 소 CECs의 EnMT 프로세스에 타틴 효과, 광범위한 스펙트럼 MMP 억제제를 나타낸다.도 도 4는 전방 내 주사 하였다 cryoinjury 후 쥐의 외부 눈 사진을 포함한다.도 5는,...

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

이 절차의 전반적인 목표는 In Vitro 및 In Vivo에서 각막 내피-중간엽 전이의 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이 방법은 각막 내피 재생 분야에서 각막 내피-중간엽 전이에 관한 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점는 In Vitro와 In Vivo 모델 모두에 적용 가능하다는 점입니다.또한 조작이 용이합니다. 이 기술의 함의는 각막 내피-중배엽 전이와 관련된 질환의 치료로 향하는 경향이 있습니다. 이러한 모델을 통해 각막 내피-중배엽 전이 과정을 억제하는 물질을 선별할 수 있기 때문에, 그 형성과 같은 과정에 적용할 수 있습니다.실험 절차는 실험실 기술자인 Jung-Shen Chang 씨가 진행합니다. 이 절차를 시작하려면, 신선한 소의 눈을 10% w/v Povidone-iodine 용액에 3분 동안 소독하십시오. 그 다음, PBS로 세척하십시오.메스와 가위를 사용하여 각막 버튼을 채취하고 PBS로 세척합니다. 해부 현미경 하에서 핀셋으로 데스메막(Descemet's Membrane)을 박리합니다. 그 후, 37°C에서 1mL의 Trypsin에 데스메막을 30분 동안 배양합니다. 이어서 112×g에서 5분간 원심분리하여 소의 CECs를 수집합니다.원심분리 후, 세포를 1 mL의 SHEM에 재부유합니다. 세포를 6 cm 디쉬에 분주하고 SHEM에서 배양합니다. 이어서, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며 3일마다 배양액을 교체합니다.세포가 합쳐질 때까지 성장하면, PBS로 세척합니다. 그다음, 37 °C에서 1 mm의 Trypsin으로 5분 동안 배양합니다. 112 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 수집합니다.5분 후, 세포 펠릿을 1 mL의 SHEM에 재현탁합니다. 그다음, Hemacytometer를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 이어서, 24-웰 플레이트의 커버 슬라이드에 세포를 분주하고 SHEM에서 배양합니다.Maramastat의 ENMT 억제 효과를 조사하려면, 배양액에 10 micromolar Maramastat이 포함된 SHEM에서 세포를 배양하고 3일마다 배양액을 교체하십시오. 그 후, 지정된 시점에 250 microliters의 4% Paraformaldehyde를 사용하여 실온에서 30분 동안 세포를 고정하십시오. 이어서 250 microliters의 0.5% Triton X-100으로 5분 동안 투과화하십시오.그런 다음 10% BSA로 30분 동안 블로킹합니다. 이어서 ABC, snail 및 slug에 대한 1차 항체를 처리하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 세포를 15분씩 두 번 세척합니다.그 후, Alexa Fluor가 결합된 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, 2 µg/mL 농도의 DAPI를 세포에 처리하여 세포핵을 대조 염색합니다. PBS로 세포를 2회, 각 15분씩 세척합니다.그런 다음 면역형광 이미지를 얻기 전에 항퇴색 마운팅 용액으로 마운팅합니다. 12주령 수컷 SD 쥐를 마취시킨 후, 동물의 피부를 살짝 집어 피부 경련이 없는지 확인하여 마취가 적절히 되었는지 확인합니다. 그 후, 통증과 눈깜빡임 반사를 최소화하기 위해 쥐의 오른쪽 눈에 0.5% Proparacaine Hydrochloride 한 방울을 점안합니다.이어서, 각막 건조를 방지하기 위해 왼쪽 눈에 Tetracycline 연고를 도포합니다. 다음으로, 스테인리스강 프로브를 액체 질소로 냉각합니다. 냉각된 스테인리스강 프로브를 오른쪽 눈의 각막 중심부에 30초 동안 접촉시킵니다.시술 중에는 각막 건조를 방지하기 위해 오른쪽 눈에 PBS를 수시로 점안하고, 모양체 경련으로 인한 안구 통증을 완화하고 감염을 예방하기 위해 냉각 손상 직후 0.1% Atropine과 0.3% Gentamicin Sulfate를 1일 1회 투여합니다. 시술 후에는 가열 램프를 사용하여 쥐의 체온을 따뜻하게 유지하고, 운동 제어 능력을 회복할 때까지 회복 과정을 관찰합니다. 회복 기간 동안 각막 건조를 방지하기 위해 오른쪽 눈에 Tetracycline 연고를 도포하며, 각막 냉각 손상 시술을 3일 연속으로 반복합니다.Maramastat 또는 basic FGF를 쥐의 안구 내부 챔버로 전달하기 위해, 마취된 쥐의 오른쪽 눈에 0.5% Proparacaine Hydrochloride 한 방울을 점안하여 통증과 눈깜빡임 반사를 최소화합니다. 그다음, 멸균된 PBS로 안구 표면을 세척합니다. 수술 현미경 하에서, 1mm 시린지에 연결된 30게이지 바늘을 홍채 위쪽의 평행한 각막 주변부 투명 영역에 삽입하여 전방 천자를 수행합니다. 그런 다음, 바늘의 사면(bevel)을 위로 향하게 하고 각막 상처 부위를 약간 눌러 방수를 일부 배출시켜 안압을 낮춥니다.약물 0.02 milliliters를 전방 내로 주입하고, 바늘을 뺄 때 면봉으로 바늘 자국을 가볍게 압박합니다. 이 그림은 소의 CECs 및 배양 세포의 위상차 현미경 이미지를 보여줍니다. 세포가 합쳐졌을 때 나타나는 육각형 모양은 세포 분리 과정 중 각막 기질 섬유아세포에 의해 오염되지 않았음을 나타냅니다.소 각막내피세포(CEC)의 In Vitro 배양 과정 중, 14일까지 ABC, snail 및 slug의 핵 내 전이가 검출되었습니다. 이 그림은 광범위 MMP 억제제인 Maramastat이 In Vitro 배양된 소 CEC의 ENMT 과정에 미치는 영향을 보여줍니다. 여기에는 동결 손상 후 전방 내 주사를 처치한 쥐의 안구 외부 사진이 제시되어 있습니다.사진은 basic FGF 주입 후 각막 부종이 감소한 모습을 보여줍니다. 반면, Maramastat은 basic FGF 단독 처리 시보다 각막 부종을 더욱 감소시켰습니다. 그리고 이 그림은 냉각 손상 후 전방 내 주입을 거친 쥐 각막 버튼의 ABC 항체를 이용한 면역 염색 결과를 보여줍니다.PBS 군에서 ABC의 핵 내 이동이 관찰되었으며, basic FGF 군에서는 이것이 유의미하게 증가하여 Wnt Beta-catenin 신호 전달 및 ENMT 과정의 활성화를 나타냈습니다. 안구 내 주입 후 basic FGF에 이어 Maramastat를 처리하자 ABC의 핵 염색이 감소하였으며, 이는 Maramastat의 ENMT 억제 효과를 시사합니다. 이 기술은 개발 이후 각막 내피-중간엽 전이(Corneal Endothelial-mesenchymal Transition) 분야의 In Vitro 및 In Vivo 연구자들에게 새로운 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하고 나면 소 각막 내피세포를 분리하는 방법과 각막 냉동 손상 유발 및 전방 내 주사 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-vitro-vivo-models-to-study-corneal-endothelial-mesenchymal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다.

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

Mice는 각막 이식을 포함한 다양한 형태의 이식을 연구하기 위한 모델로 사용되었습니다.  이 보고서에서는 급성 및 후기 각막 이식을 위한 쥐 모델을 설명합니다.

쥐의 각막 이식 : 고체 장기 이식의 가장 일반적인 형태를 연구하기위한 모델

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

이 프로토콜에는 새로운 3 차원 생체 외에서 모델을, 어디 각 막 실질 세포와 분화 된 신경 세포 교양 함께 시험에는 두 종류의 세포 상호 작용의 이해를 돕기 위해 설명 합니다.

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기서, 돼지 분할 각막 버튼의 제조 및 재배를 위한 단계별 프로토콜이 제시된다. 이 오르가노-전형적으로 재배된 장기 배양 모델은 인간 기증자 각막에 필적하는 15일 이내에 세포 사망률을 나타내므로, 독성 덱젠을 첨가하지 않고 비인간 각막의 장기 재배를 허용하는 첫 번째 모델을 나타낸다.

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

이 프로토콜은 인간 또는 양 조직의 이식에서 각막 내피 세포 배양을 확립하고 성장하는 데 필요한 중요한 단계를 설명합니다. 각막 내피 세포를 membranous 생체 재료에 소양성하는 방법도 제시된다.

생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장

당사는 세포 형태 변화를 관찰하고 면역형성 염색을 이용한 발현 EndMT 관련 마커 변경을 검사함으로써 내피 세포에서 TGF-β2 유도 EndMT를 조사하는 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 유전자 편집은 TGF-β2 유도 EndMT에서의 역할을 조사하기 위해 달팽이를 코딩하는 유전자를 고갈시키기 위해 기술및 사용되었다.

TGF-β 매개 내피- 중간엽 전환(EndMT)과 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 EndMT 이펙터의 기능평가

여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

배우세요 각막 내피 세포-중간 엽 전이 메커니즘을 생체 외 및 생체 내 모델에서 연구하는 방법을. 소 각막 내피 세포 원발 배양과 랫트 동상 손상 모델을 활용하여 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

더 많은 동영상 탐색